Eksperimental na gawain sa paglipat ng allogeneic keratinocytes sa artipisyal na nilikha na mga peklat ng mga puting daga

Ang pagnanais na gamitin ang potensyal na cellular at ang pangangailangan na makahanap ng mga bagong epektibong pamamaraan upang mapabuti ang aesthetic na hitsura ng mga peklat ay humantong sa ideya ng pagsubok na pag-aralan ang posibilidad ng paglipat ng mga keratinocytes sa ibabaw ng peklat.

Upang mapatunayan ang posibilidad ng paggamit ng kultura ng keratinocyte upang mapabuti ang hitsura ng mga peklat, isang eksperimentong pag-aaral ang isinagawa sa mga puting daga ng laboratoryo, kung saan nilikha ang mga ibabaw ng peklat. Ang modelo ng peklat ng daga ay nakuha bilang isang resulta ng pagpapagaling ng artipisyal na mga sugat sa likod, kasama ang gulugod. Ang mga daga ay pinutol ng magkatulad na piraso ng balat, 2x3 cm ang laki. 2.5 buwan pagkatapos ng operasyong "scar modeling", ang mga daga ay sumailalim sa dermabrasion (pag-alis ng mga itaas na layer ng peklat gamit ang thermocaustic) at ang mga allogeneic keratinocyte ay inilipat, na nakahiwalay sa balat ng mga rat pups 2-4 na araw pagkatapos ng kapanganakan.

Ang paghihiwalay at paglilinang ng mga epidermal cell ng daga ay isinasagawa sa laboratoryo ng mga teknolohiya ng cell ng Institute of Cytology ng Russian Academy of Sciences gamit ang sumusunod na teknolohiya.

Ang balat ay hinugasan sa Hank's saline solution na naglalaman ng 200 U/ml gentamicin at pinutol sa maliliit na piraso, 0.2-0.5 cm2 ang lugar ^. Ang mga piraso ng balat ay incubated sa 0.5% dispase solution sa balanseng salt phosphate-buffered solution sa 37°C sa loob ng 1 oras. Ang mga piraso ay inilipat sa Dulbecco's phosphate-buffered saline at ang epidermis ay nahiwalay sa mga dermis. Ang epidermis ay natupok sa 0.125% na solusyon ng trypsin sa loob ng 10-15 minuto na may pagpapakilos sa 50 rpm, pagkatapos nito ay tumigil ang pagkilos ng enzyme sa pamamagitan ng pagdaragdag ng 5% na serum ng pangsanggol na baka. Ang isang ikatlo ng nagresultang suspensyon ng cell ay ginamit sa purong anyo para sa isa sa mga opsyon para sa paglipat sa mga peklat, ang pangalawang pangatlo ay lumaki sa biocompatible na domestic film coatings na "Polypor", at ang pangatlo - sa mga pagkaing Petri na walang substrate. Ang operasyon ng dermabrasion ng mga nagresultang peklat sa mga daga na may kasunod na paglipat ng mga epidermal cell ng daga sa kanila ay isinagawa sa ilalim ng ether anesthesia gamit ang isang thermal cautery.

Sa unang pangkat ng mga daga, pagkatapos ng dermabrasion, ang mga sterile na piraso ng cambric ay inilagay sa pinakintab, hugasan ng physiological solution at pinatuyong ibabaw ng peklat, kung saan ang isang inalog na suspensyon ng allogenic rat epidermocytes ay inilapat sa isang konsentrasyon ng 1.5 milyong mga cell bawat 1 ml (ayon sa Institute of Cytology). Ang mga piraso ng cambric ay inilagay sa pinakintab na peklat upang ang mga selula ay nakahiga sa ibabaw ng peklat. Ang isang bendahe ng ilang mga layer ng gasa ay inilagay sa itaas, na natahi sa mga gilid ng peklat.

Ang bahagi ng nakuha na suspensyon ng cell ay na-seed sa Petri dishes sa sterile Polypore films na pinutol sa hugis ng mga pinggan, ang iba pang bahagi - sa Petri dish na walang pelikula. Ang paglilinang ay isinagawa sa FAD medium, na binubuo ng pinaghalong DMEM at F12 medium sa ratio na 3:1. kasama ang pagdaragdag ng 10% fetal bovine serum, 5 μg / ml insulin (Sigma), 0.5 μg / ml hydrocortisone hemisuccinate (Sigma). 10 μg / ml epidermal growth factor EGF (Institute of Cytology RAS, St. Petersburg). Ang pangalawa at pangatlong grupo ng mga daga, 7 indibidwal bawat isa, ay inoperahan sa 6 na araw pagkatapos ng una. Sa oras na ito, nabuo ang mga multilayered na layer mula sa pagsususpinde ng mga seeded keratinocytes sa Petri dishes, na inilipat sa mga daga. Ang pangalawang grupo ay inilipat na may mga epidermocytes sa isang pelikula, ang pangatlo - na may isang multilayer layer na walang substrate. Pagkalipas ng 7 araw, ang nakuhang multilayer na mga layer ng allogeneic keratinocytes (MPALK), na nabinhi sa mga pelikulang "Polypore", ay inilipat bilang isang kultura nang direkta sa ibabaw ng sugat. Sa itaas, ang pelikula, upang maiwasan ang pagkapunit nito, ay naayos na may multilayer gauze bandage at tinahi sa balat ng mga daga.

Bago i-transplant ang mga keratinocytes sa ikatlong pangkat ng mga daga na lumaki nang walang substrate, ang PAC ay pinaghiwalay mula sa ilalim ng Petri dish sa pamamagitan ng paggamot dito nang may dispase, na may kakayahang piliing makagambala sa dermal-epidermal bond. Kapag kumikilos sa isang multilayered na layer, ang dispase ay nakakagambala sa koneksyon ng mga basal layer na selula sa ilalim ng Petri dish at may mas mababang epekto sa mga intercellular na koneksyon, na ginagawang posible na "alisin" ang layer nang buo. Ang detatsment ng multilayered cell layer na may dispase ay isinagawa tulad ng sumusunod. Ang daluyan ng transportasyon ay pinatuyo mula sa mga pagkaing Petri, ang mga layer ng cell ay hugasan ng tatlong beses na may isang nutrient medium na naglalaman ng mga antibiotics, sa partikular, gentamicin (0.2 mg / ml). Ang mga multilayered na layer ay napuno ng 0.125% dispase solution ("Sigma") at inilagay sa isang thermostat, kung saan sila ay incubated sa t=37°C sa loob ng 20-30 minuto. Ang hitsura ng isang puting rim na nagbabalat sa kahabaan ng periphery ng layer ay isang tagapagpahiwatig ng simula ng proseso ng paghihiwalay nito mula sa mga gilid at ilalim ng Petri dish. Ilang minuto pagkatapos ng simula ng proseso ng paghihiwalay, ang dispase solution ay pinatuyo, ang mga epithelial layer ay hugasan ng 2-3 beses sa daluyan. Ang isang piraso ng sterile wound dressing na "Lita-color" na hiwa sa laki ng tasa ay inilapat sa ibabaw ng epidermal layer, kung saan ang layer na pinaghihiwalay ng dispase, bukod pa rito ay binalatan mula sa ilalim ng tasa na may spatula, ay natigil. Gamit ang mga sipit sa mata, ang layer kasama ang patong ng napkin na "Lita-color" (Russia) ay napunit mula sa ilalim ng Petri dish at maingat na inilipat sa inihandang ibabaw ng peklat. Ang mga napkin na "Lita-color" ay naglalaman ng gentamicin at exolin (collagen extract), na, kapag moistened sa mga labi ng medium ng paglago at pagkatapos ay may isang physiological solution, namamaga at naging isang modernong dressing ng sugat, na nagbibigay ng mahusay na proteksyon mula sa panlabas na impeksiyon at mabilis na paggaling dahil sa moisture-absorbing structure.

Ang multilayer gauze bandage ay inilapat sa Polypore films at Lita-color napkin at tinahi sa balat ng mga daga para sa mas malakas na pag-aayos. Ang bawat daga ay inilagay sa isang hiwalay na hawla upang lumikha ng pinakamainam na kondisyon para sa pagpapanatili at pag-engraft nito ng mga inilipat na keratinocytes. Ang mga bendahe ng mga daga kung saan ang suspensyon at ang multilayer na layer ng epidermocytes na inalis sa pamamagitan ng dispase ay inilipat ay binasa ng sterile saline ilang beses sa isang araw upang lumikha ng pinaka-kanais-nais na mga kondisyon para sa engraftment para sa mga cell. Isinasaalang-alang na ang Polypore film ay hindi natatagusan ng tubig, ang mga bendahe ng mga daga sa pangalawang grupo ay hindi nabasa, na isa sa mga pakinabang sa mga transplant na walang mga pelikula. Ang mga bendahe ay tinanggal pagkatapos ng 10 araw. Ang klinikal na larawan ng mga peklat pagkatapos ng paglipat ng cell ay bahagyang naiiba sa mga peklat na walang paglipat, maliban sa kanilang pinker na kulay (dahil sa dermabrasion) at mas malaking pagbabalat. Ang katotohanang ito ay nagpapahiwatig na. na kaagad pagkatapos mahulog ang mga dressing ng sugat kasama ng MPC, walang pagbabagong naganap sa peklat.

Pagkuha ng biopsy material mula sa mga daga.

Pagkatapos ng 1, 2, 5 at 9 na buwan pagkatapos ng paglipat ng mga allogeneic keratinocytes ng daga sa pinakintab na mga peklat ng mga puting daga, kinuha ang materyal para sa histological, cytomorphological at electron microscopic examination. Ang mga sample ng normal na balat ng daga at peklat na walang cell transplantation ay kinuha bilang kontrol. Ang anesthesia ng mga daga ay isinagawa gamit ang ether anesthesia.

Pagkatapos ng anesthesia, ang mga piraso ng scar tissue ay kinuha mula sa mga minarkahang lugar kung saan ang mga keratinocytes ay inilipat gamit ang isang 2 mm diameter biopsy punch at inilagay sa isang 2.5% na glutaraldehyde solution upang ihanda ang materyal para sa electron microscopic examination. Ang mga piraso ng tissue na kinuha para sa histological examination ay inilagay sa isang 10% neutral formalin solution, na sinusundan ng pagpasa sa mga alkohol at pag-embed sa paraffin, na sinusundan ng pagputol ng mga ultra-manipis na seksyon at pagtingin sa mga ito sa isang light-optical microscope.

Kontrol I. Normal na balat ng daga.

Upang makita ang pagkakaiba sa pagitan ng mikroskopikong larawan ng normal na balat ng daga na binago ng peklat at mga peklat sa ilang mga oras pagkatapos ng paglipat ng MPC, ang mga litrato at paglalarawan ng mga ito ay ipinapakita sa lahat ng mga yugto ng pag-aaral na ito.

Ang epidermis ng normal na balat ay binubuo ng 7-9 na layer ng mga selula. Ang stratum corneum ay may katamtamang kapal. Sa ilang mga lugar ito ay binubuo ng 6-8 na patong ng malibog na kaliskis. Ang basal layer ay kinakatawan ng cylindrical cells na may malaki, magaan, regular na hugis na nuclei at ilang nucleoli. Ang mga koneksyon sa desmosomal sa pagitan ng mga selula at sa basal na lamad ay malinaw na ipinahayag. Sa ilalim ng mahusay na tinukoy na basal lamad, na may maliliit na outgrowths sa subepidermal layer, parallel dito ay namamalagi ng pinong mga bundle ng collagen at elastin fibers, bukod sa kung saan ay pinahabang fibroblasts, maliliit na sisidlan. Sa mas malalim na mga layer, ang mga bundle ng collagen at elastin fibers ay namamalagi sa iba't ibang direksyon. Kabilang sa mga ito ang maraming mga sisidlan na may manipis na pader ng parehong kalibre, mga elemento ng cellular (fibroblast, mast cell, leukocytes). Ang isang malaking bilang ng mga follicle ng buhok, sebaceous glands.

Kontrolin 2. Peklat ng daga, 2 buwang gulang.

Klinikal na larawan. Ang mga peklat ay maputlang rosas, na may pagbabalat, ang mga crust ay nananatili sa mga lugar. Ang kanilang lugar ay nabawasan dahil sa pag-urong ng collagen fibers at naging humigit-kumulang 3.0-3.5 cm ^:. Wala ang mga appendage sa balat.

Microscopic na larawan. Ang epidermis ay binubuo ng 3-5 na mga layer ng mga cell, nakatiklop, na kinakatawan ng mga bilugan na basal na selula, isang hilera ng subulate, 1-2 na mga hilera ng butil na may mga butil ng keratohyalin sa itaas na layer, may mga lugar ng intracellular edema. Ang stratum corneum ay hindi pantay na nababago mula sa napakanipis hanggang sa makapal. Ang pagtitiklop ng peklat ay napapansin dahil sa (contraction) ng scar tissue. Ang mga fold ay tumagos sa papillary layer at lumikha ng impresyon ng papillae. Ang hangganan sa pagitan ng epidermis at dermis ay isang tuwid na linya. Ang basement membrane ay hindi natunton sa lahat ng dako. Sa ibabang bahagi ng subepidermal at mas malalim na mga layer ay may mga sisidlan na may makapal, maluwag na pader, marami ang desyerto, na may stasis. Sa paligid ng mga sisidlan ay mayroong akumulasyon ng mga macrophage, fibroblast. Ang mga macrophage ay pumapalibot sa mga erythrocytes na inilabas mula sa mga capillary at phagocytose ang mga ito. Sa mas mababaw na mga layer mayroong maliliit na capillary. Sa ilalim ng epidermis, ang mga hibla ng collagen ay maluwag na matatagpuan. Sa mas malalim na layer ng peklat mayroong mga magaspang na bundle ng collagen fibers, bukod sa kung saan mayroong maraming mga fibroblast.

Peklat ng daga isang buwan pagkatapos ng paglipat ng mga keratinocytes ng daga.

Klinikal na larawan. Ang mga peklat ay kulay-rosas, ang kanilang lugar ay nabawasan, lalo na sa diameter, at nasa average na 2.5-3 cm ². Ang buhok at sebaceous glands ay wala.

Ang data ng mikroskopikong pagsusuri ng materyal na nakuha mula sa mga daga na may paglipat ng MPaLK sa pelikula at MPaLK na walang substrate ay halos magkapareho. Gayunpaman, puro teknikal, ang pagtatrabaho sa MPaLK na walang substrate ay mas kumplikado at masakit kaysa sa paglaki ng MPaLK sa isang substrate, samakatuwid, sa karagdagang pag-aaral ng isyu ng paglipat ng mga keratinocytes sa mga peklat, ginamit namin ang multilayer cambric bilang batayan para sa paglaki ("substrates").

Microscopic na larawan. Ang pampalapot ng epidermis sa 15-20 na mga layer ay nabanggit, halos sa gitna kung saan ang mga keratinocytes ay may makitid, pinahabang, patayong hugis at compact na pag-aayos. Ang mga basal cell ay matatagpuan sa isang hindi pantay na linya. Ang kanilang nuclei ay magaan, malaki, bilugan na may isa o dalawang nucleoli, na nagpapahiwatig ng kanilang mataas na synthetic at proliferative na aktibidad. Ang hangganan sa pagitan ng epidermis at dermis ay isang tuwid na linya. Ang spinous layer ay mahusay na binuo, binubuo ng 3-5 na mga layer ng bilugan na mga cell, mayroong 2-nucleolar cells.

Kaagad sa ilalim ng basement lamad may mga makapal na matatagpuan manipis na bundle ng collagen fibers, parallel sa kanila mayroong isang malaking bilang ng mga desyerto vessels, mas malalim collagen fibers ay coarser, nakolekta sa siksik na bundle. Maraming malalaking fibroblast, mast cell (2-3 sa larangan ng view), macrophage, leukocytes at desyerto na mga sisidlan, ang mga dingding nito ay lumuwag, sa paligid ng mga ito ay may maluwag na matatagpuan na mga hibla ng collagen. Sa ilang mga sisidlan ay mayroong stasis, diapedesis ng mga nabuong elemento. Sa paligid ng mga sisidlan ay may mga fibroblast, solong lymphocytes. Wala ang mga appendage sa balat.

Kapag naglilipat ng suspensyon ng keratinocyte sa isang pinakintab na peklat, ang mikroskopikong larawan ay naiiba sa nauna. Sa karamihan ng mga hayop, ang epidermis ay manipis at binubuo ng 5-6 na layer ng mga selula. Ang mas mababang layer ay binubuo ng mga cell na hindi regular, polygonal na hugis na may nuclei ng round-irregular na hugis. Ang estado ng subepidermal layer ay katulad ng estado nito sa pangkat ng mga hayop na walang paglipat ng MPALK.

Sa kasong ito, maaari nating pag-usapan ang alinman sa isang pagkaantala sa mga proseso na kasama ng cell transplant, o tungkol sa isang malaking pagkawala ng mga cell na inilipat sa anyo ng isang suspensyon. Samakatuwid, ang isang konklusyon ay ginawa tungkol sa kawalan ng kakayahan ng pagwawasto ng peklat sa pamamagitan ng paglipat ng mga keratinocytes sa anyo ng isang suspensyon.

Peklat ng daga 2 buwan pagkatapos ng paglipat ng mga keratinocytes ng daga.

Klinikal na larawan. Ang peklat ay mukhang manipis at maselan. Sa mga lugar, ang pagbabalat at mga scaly spot ay sinusunod.

Microscopic na larawan. Ang stratum corneum ay pinalapot, sa mga lugar - hyperkeratosis. Ang epidermis ay makapal, binubuo ng 12-20 na hanay ng mga selula. Ang hangganan sa pagitan ng epidermis at dermis ay isang tuwid na linya. Ang pinong mga hibla ng collagen sa ilalim ng epidermis ay namamalagi nang makapal. Sa mas malalim na mga layer ng peklat, sila ay nakolekta sa malalaking magaspang na mga bundle. Sa subepidermal layer, lumilitaw ang bagong pagbuo ng vascular. Sa mas mababang mga layer ng scar tissue, mayroong maraming mga desyerto na mga sisidlan na matatagpuan parallel sa ibabaw ng epidermis. Ang mga malalaking fibroblast ay pantay na ipinamamahagi sa kapal ng peklat, may mga higante, multi-branched, maraming macrophage.

Peklat ng daga 5 buwan pagkatapos ng paglipat ng mga selulang epidermal ng daga.

Klinikal na larawan. Ang peklat ay mukhang pantay, makinis na walang pagbabalat, may mga solong buhok, ang kanilang density ay mas malaki sa paligid ng mga peklat, na nagpapahiwatig ng marginal na ingrowth ng mga follicle ng buhok sa peklat at bagong pagbuo ng mga follicle ng buhok. Ang lugar ng mga peklat ay patuloy na bumababa.

Microscopic na larawan. Ang epidermis ay makapal pa rin (15-20 layers, sa ilang mga lugar hanggang 30) sa itaas na mga layer ay puno ito ng mga butil ng keratohyalin. Ang basement membrane ay malinaw na nakikita. Sa ilalim nito, ang mga hibla ng collagen ay nakahiga nang maluwag. Sa mas mababang mga layer, ang collagen ay mas malakas at mahigpit na nakaimpake. Mayroong maraming mga capillary sa mga bundle ng collagen. Sa itaas na mga layer, ang bilang ng mga desyerto na sisidlan ay nabawasan. Ang junction ng epidermis at dermis ay bahagyang kulot. Sa ilang lugar, may malalalim na epidermal outgrowth sa scar tissue. Ang mga bagong nabuong sisidlan ay makikita sa mga hibla ng collagen. Lumilitaw ang mga solong follicle ng buhok at sebaceous glands.

Peklat ng daga 9 na buwan pagkatapos ng paglipat ng mga epidermal na selula ng MPA ng daga.

Klinikal na larawan. Ang mga peklat ay naging makabuluhang mas maliit sa laki kumpara sa mga naunang panahon, ang kanilang lugar ay nasa average na mga 1.5-2.0 cm ². Ang mga peklat ay hindi pantay na natatakpan ng pinong buhok, lalo na sa paligid. Minor fine-plate pagbabalat ay nananatiling.

Microscopic na larawan.

Ang epidermis ay naging mas payat, ay kinakatawan ng 6-8 na hanay ng mga selula, kahawig ng epidermis ng normal na balat ng daga sa istraktura, tanging ang density ng cell ay 1 mm na mas mataas at mas maliit sila. Ang basal layer ay binubuo ng maliliit na round-cylindrical na mga cell. Ang basal membrane ay mahusay na ipinahayag, ang mga hemidesmosome ay malinaw na nakikita. Ang pagkakaroon ng mga epidermal outgrowth sa subepidermal layer ay nabanggit. Ang papillary layer ay ipinahayag kasama ang buong haba ng peklat. Ang mga katotohanang ito ay nagpapahiwatig na sa oras na ito ang pagdirikit ng mga inilipat na keratinocytes ay naging mas malakas sa pinagbabatayan na mga tisyu ng peklat. Samakatuwid, ang pag-aalaga ng peklat sa mga taong may paglipat ng MPALK 9 na buwan pagkatapos ng paglipat ng MPC ay maaaring tradisyonal. Sa ilalim ng epidermis, ang mga hibla ng collagen ay mas maselan kaysa sa malalim na mga layer. Maraming mga sisidlan ang lumitaw, lalo na ang mga mababaw. Ang mga dingding ng malalaking sisidlan ay lumapot. Ang mga follicle ng buhok at sebaceous glands ay nasa malalaking dami. Ang mikroskopikong larawan ay kahawig ng dermal-like tissue.

Mga resulta ng eksperimentong gawain at ang kanilang talakayan.

Sa kurso ng gawaing ito, ang mga keratinocytes sa iba't ibang anyo ay inilipat sa artipisyal na nilikha na mga peklat sa balat ng daga pagkatapos ng dermabrasion surgery - sa mga panakip ng sugat, bilang isang suspensyon sa cambric, at bilang isang multilayer na layer na walang substrate. Ang gawain ay isinagawa na may layuning makakuha ng morphological data sa epekto ng transplanted allogeneic keratinocytes sa mga scars, pati na rin ang pagtukoy ng pinakamainam na mga opsyon sa transplant.

Napag-alaman na lahat ng tatlong paraan ng paglipat ay magagawa, ngunit ang paglipat ng MPAC na walang substrate ay isang napakahirap na pamamaraan, kung saan ang MPAC ay maaaring masugatan, na nakakaapekto sa mga resulta ng paglipat. Bukod dito, ang paraan ng paglipat na ito ay hindi kasama ang trabaho sa malalaking ibabaw.

Ang Keratinocyte suspension transplantation ay isang mas cost-effective na paraan, hindi nangangailangan ng pangmatagalang cell cultivation at simple sa bersyon na aming iminumungkahi gamit ang sterile cambric blanks, ang mga sukat nito ay tumutugma sa laki ng mga peklat. Ang pagkaantala sa therapeutic effect kapag naglilipat ng cell suspension ng humigit-kumulang isang buwan kumpara sa MPC sa isang patong ng sugat ay hindi isang mahalagang punto na may tagal ng paggamot na maraming buwan. Ito ay kilala na kapag ang MPC ay inilipat upang masunog ang mga pasyente, ang pagbabago ng istraktura ng balat ay nangyayari nang unti-unti at sa loob ng ilang taon. Ang paglipat ng kultura ng keratinocyte sa mga coatings ng sugat ay ang pinaka-maginhawa at promising na paraan, ngunit mas mahal din. Bilang karagdagan, sa kasalukuyan ay nangangailangan ito ng paghahanap para sa mas advanced na mga opsyon sa coating na dapat ay flexible, hygroscopic, may bacteriostatic o bactericidal properties at biologically neutral para sa mga cell. Ang pelikulang "Polypor" - isang intermediate na bersyon ng domestic film wound covering, sa kabila ng ilang mga di-kasakdalan, ay nagpapahintulot sa amin na pag-aralan sa eksperimento ang paglipat ng mga keratinocytes ng daga sa mga peklat at gumawa ng mga konklusyon tungkol sa pagiging epektibo ng direksyon na ito ng paggamot sa peklat.

Ang mga may-akda na nag-transplant ng MPC sa mga paso na sugat ay nabanggit na sa unang linggo pagkatapos ng paglipat ng isang multilayered layer ng keratinocytes papunta sa sanitized na mga sugat, ang epidermis ay lumapot at nagsapin-sapin. Ang lahat ng mga layer ng epidermis ay malinaw na nakikita. Kapansin-pansin, ang bilang ng mga layer ng cell sa mga transplant ay 10-30% na mas malaki kaysa sa mga biopsy ng balat. Napansin ng mga may-akda ang hitsura ng mga granules ng keratohyalin sa ika-5 araw pagkatapos ng paglipat ng MPC, at ang basal membrane at hemidesmosomes - nasa ika-3 araw na.

J.Rives et al. (1994), Paramonov BA (1996); Kuznetsov NM et al. (1998) natagpuan na sa mga unang yugto pagkatapos ng paglipat ng MPC sa mga pasyente na may ganap na kapal ng mga depekto sa balat pagkatapos ng pagkasunog, ang koneksyon sa pagitan ng mga dermis at epidermis ay napakahina at isang tuwid na linya, ang papillary layer ay wala. Sa pagtatapos ng ika-2 buwan, ang mga mababaw na papillae at mga appendage ng balat ay nagsisimulang mabuo, ang koneksyon sa pagitan ng mga dermis at epidermis ay nagiging mas malakas. Ipinahihiwatig ng data ng literatura na ang paglipat ng allogeneic keratinocytes sa mga sugat sa mga pasyenteng nasusunog ay isang magandang paraan. Sa kabila ng katotohanan na ang pagtanggi sa allogeneic keratinocytes ay nangyayari, ayon sa iba't ibang mga may-akda, sa loob ng 10 araw hanggang 3 buwan, gayunpaman ay ginagampanan nila ang kanilang papel sa pagpapagaling sa ibabaw ng sugat, pagtatago ng mga kadahilanan ng paglago at mekanikal na pagsasara ng depekto. Ito ay pinaniniwalaan na ang MPALC ay nabawasan ang antigenic na aktibidad, dahil sa panahon ng in vitro cultivation nawala ang mga selula ng Langerhans, na nagpapahintulot sa kanila na umiral sa katawan ng tatanggap sa loob ng mahabang panahon. Bilang karagdagan, ang isang allogeneic na kultura na nakuha mula sa balat ng mga kabataang malusog na tao ay may hindi maihahambing na mas malaking potensyal na biyolohikal kaysa sa isang autologous na kultura ng mga pasyente pagkatapos ng isang pinsala.

Ang pangunahing layunin ng aming pag-aaral ay upang malaman kung ang allogeneic keratinocytes ay magkakaroon ng ugat sa mga peklat at kung anong mga pagbabago ang magaganap sa scar tissue sa ilalim ng impluwensya ng naturang biologically active na "wound coating". Sa kaso ng isang positibong resulta, upang bumuo ng pinaka-epektibo at hindi bababa sa labor-intensive na teknolohiya para sa lugar na ito ng rehabilitation medicine.

Ang data na nakuha namin ay sa maraming paraan katulad ng data ng panitikan sa mga pagbabagong morphological na nagaganap sa epidermis ng tao pagkatapos ng paglipat ng mga allogeneic keratinocytes upang masunog ang mga sugat. Gayunpaman, mayroon ding mga makabuluhang pagkakaiba, kapwa sa mga tuntunin ng morphological substrate kung saan nangyayari ang paglipat at sa mga tuntunin ng teknolohiya. Kaya, ang proseso ng pagbuo ng basement membrane at dermal-epidermal na koneksyon (hemidesmosomes, papillae) ay nangyayari sa mas huling yugto kumpara sa paglipat ng mga keratinocytes sa mga ibabaw ng sugat na walang mga pagbabago sa cicatricial. Tila, ito ay nangyayari dahil sa mas mahinang nutrisyon ng scar tissue kumpara sa dermis o muscle fascia. Ang isang peklat, lalo na ang isang luma, ay isang siksik na connective tissue na may napakaliit na bilang ng mga sisidlan, habang ang ilalim ng isang sugat na paso ay granulation tissue na mayaman sa mga sisidlan. Kaya, malinaw na ang mga kondisyon kung saan nangyayari ang paglipat at pag-engraftment ng mga keratinocytes ay ganap na naiiba. Ang mas vascularized ang cell transplant area ay, mas madali ang proseso ng kanilang engraftment ay. Mula sa postulate na ito ay sumusunod sa konklusyon tungkol sa kagustuhan ng pagtatrabaho sa mga batang scars, kung saan ang connective tissue ay medyo maluwag at mayaman sa mga sisidlan.

Bilang resulta ng gawaing pang-eksperimentong ito, napatunayan na:

1. Posible ang paglipat ng MPALK sa mga peklat.
2. Ang pinakamainam na paraan ng paglipat ay ang paglipat ng mga keratinocytes sa pantakip ng sugat.
3. Ang ibabaw ng peklat ay dapat na pinakintab gamit ang surgical laser dermabrasion o isang Schumann cutter.
4. Sa ilalim ng impluwensya ng MPALK, ang mabilis na epithelialization ng makintab na ibabaw ng peklat ay nangyayari.
5. Ang mas mahusay na vascularized ang scar tissue, iyon ay, mas bata ang peklat, mas mahusay ang mga resulta ng keratinocyte transplantation.
6. Sa ilalim ng impluwensya ng mga inilipat na keratinocytes, ang scar tissue ay unti-unting nagbabago at nagiging isang dermal-like (mas maluwag na scar tissue na may mga appendage sa balat).
7. Unti-unting pag-loosening ng scar tissue, simula sa subepidermal layer. Ang vascularization nito ay nagpapabuti, ang mga bundle ng collagen fiber sa itaas at ibabang bahagi ng peklat ay mas maluwag ang pagkakaayos kaysa sa peklat na tissue na walang cell transplantation. Lumilitaw ang mga follicle ng buhok at sebaceous glands. Ang epidermis, sa istraktura nito, na pumasa sa hypertrophy phase, ay lumalapit sa epidermis ng normal na balat.
8. Ang mga naobserbahang pagbabago ay nauugnay sa mga kadahilanan ng paglago at mga cytokine na itinago ng mga keratinocytes, na, sa pamamagitan ng pagpapabuti ng trophism ng scar tissue, ay nagtataguyod ng pagbabago nito mula sa magaspang na fibrous tissue patungo sa looser tissue, na humahantong sa isang pagpapabuti sa hitsura ng peklat.

Kaya, batay sa pag-aaral na ito, maaari itong tapusin na ang mga transplanted keratinocytes ay may kapaki-pakinabang na epekto sa scar tissue, na maaaring magkaroon ng praktikal na implikasyon para sa rehabilitasyon ng mga pasyente na may iba't ibang uri ng mga peklat.

Ang gawaing ito sa mga daga ay nagpapahintulot din sa amin na bumalangkas ng mga kinakailangan para sa mga panakip ng sugat kung saan lumalaki ang mga keratinocyte.

Ang mga dressing sa sugat ay dapat na:

• biocompatible sa mga cell,
• makahinga,
• may nababanat, bumubuo ng anyo na base,
• maging hydrophilic,
• bilang medicinal additives ay naglalaman ng mga antibacterial na gamot at antioxidant na hindi nakakalason sa mga kulturang selula.

Mga klinikal na resulta ng biotechnological na paggamot ng mga peklat.

Noong nakaraan, N. Carver et al. (1993) natagpuan na ang mga occlusive dressing ay pinakamahusay na nagtataguyod ng attachment sa sugat at kaligtasan ng mga keratinocytes, ngunit hindi pinapayagan ang pagbuo ng stratified (mature) na epidermis. Ang kapaligiran ng hangin ay kinakailangan para sa pagbuo ng stratified epidermis. Samakatuwid, pagkatapos ng attachment ng isang multilayer layer, iminungkahi na alisin ang occlusive wound dressing pagkatapos ng 7-10 araw at gamutin ang mga sugat sa ilalim ng dry dressing o water-soluble ointment. Masasabing ang kalidad at katangian ng "substrate" kung saan lumaki ang mga selula ay isang napakahalagang punto para sa pagiging epektibo ng paglipat ng cellular material, at samakatuwid ay para sa mga resulta ng trabaho ng mga doktor. Ngunit walang perpektong pagbibihis ng sugat ngayon, sa kabila ng kasaganaan ng mga iminungkahing opsyon (artipisyal na balat, hindi pinagtagpi na tela na gawa sa carboxymethyl cellulose, fibrin coatings, semipermeable polyurethane films). Ang isang mahalagang punto sa bagay na ito ay ang halaga ng "mga substrate" (mga espesyal na panakip sa sugat), dahil ang mataas na halaga nito ay nagpapataas ng kabuuang halaga ng biotechnological na paggamot.

Ang pagiging epektibo ng mga teknolohiya ng cell ay napatunayan hanggang sa kasalukuyan, ngunit, sa kasamaang-palad, ang mga teknolohiyang ito ay napakamahal, lalo na sa mga bansa kung saan ang pang-industriya na produksyon ng mga komposisyon ng cell ay hindi pa naitatag. Gayunpaman, ang mga bansa tulad ng Estados Unidos ay matagal nang nagtatag ng isang industriya para sa produksyon ng cell material para sa burn transplantation. Sa partikular, ang kumpanyang BioSurface Technology Inc., mula noong 1989, ay lumago ng 37,000 multilayered keratinocyte layer, na ginamit upang gamutin ang 240 na pasyente sa 79 na bansa sa buong mundo (R. Odessey, 1992), habang ang 1 cm 2 ng ^cell culture ay nagkakahalaga ng 7-8 US dollars.

Ang teknolohiya para sa paggamot sa iba't ibang mga sakit sa balat at mga problema ay may ilang mga pagkakaiba, ngunit ang anumang paggamot sa cell ay batay sa pagkuha ng mataas na kalidad na materyal ng cell at paglipat nito.

Ang prosesong ito ay binubuo ng mga sumusunod na hakbang:

• pagkuha ng balat mula sa mga biktima (o mula sa mga donor),
• pagdadala ng mga flap ng balat sa isang biotechnology center,
• paghihiwalay ng basal layer cells at ang kanilang paglaganap,
• paglago ng multilayer keratinocyte layers (MLK).
• paglipat ng kultura ng cell.

Ang pangunahing problema sa pagsasagawa ng paggamot gamit ang paglipat ng mga multilayered na keratinocyte sheet ay ang pangangailangan para sa mga mabubuhay na selula sa lahat ng yugto ng paglipat ng cell. Ang mga piraso ng balat para sa paghihiwalay ng mga autologous o allogeneic na mga cell ay dapat na manipis hangga't maaari, dahil sa kasong ito ay mas madaling paghiwalayin ang mga ito gamit ang mga mekanikal at enzymatic na pamamaraan at makakuha ng isang suspensyon ng mga nabubuhay na selula para sa paglilinang. Makukuha ang mga ito sa pamamagitan ng pagputol gamit ang isang dermatome o paggamit ng balat ng mga talukap ng mata, balat ng masama, at ang panloob na ibabaw ng balikat. Dahil ang mga cell ay sensitibo sa mga halogens (chlorine, yodo), hydrogen peroxide, hindi sila maaaring gamitin kapag pinoproseso ang balat sa panahon ng pagkolekta ng materyal.

Ang quantitative at qualitative yield ng mga cell mula sa skin grafts at ang kahusayan ng kanilang cultivation ay nakasalalay din sa kalusugan at edad ng donor. Bilang karagdagan, ang mga biopsy ng balat ay dapat maihatid sa lalong madaling panahon at sa ilalim ng naaangkop na mga kondisyon (kapaligiran, temperatura) sa isang laboratoryo na sertipikado at akreditado para sa mga layuning ito.

Para sa pag-iimbak at transportasyon ng mga flap ng balat, ang Eagle's medium o medium 199 na may karagdagan ng 10% bovine serum, DMEM medium na may karagdagan ng 5% fetal bovine serum at antibiotics ay maaaring gamitin.

Sa laboratoryo ng cytology, ang biopsy ng balat ay unang mekanikal na nahahati sa maliliit na piraso, pagkatapos ay ang mga piraso ng balat ay naproseso gamit ang mga enzyme: trypsin, collagenase, dispase, atbp.

Sa ilalim ng pagkilos ng mga enzyme, ang mga desmosome ay nawasak at ang mga keratinocyte ay inilabas sa medium sa anyo ng mga indibidwal na mga cell o mga pinagsama-samang binubuo ng iba't ibang bilang ng mga cell. Ang mga basal na keratinocytes lamang ang ginagamit para sa paglilinang, na lumaki sa espesyal na media sa mga thermostat na naglalaman ng 5% CO, sa mga pagkaing Petri o sa mga flasks sa t = 37 ° C. Na pagkatapos ng 48 oras, ang pagbuo ng mga kolonya ng keratinocytes ay sinusunod, na unti-unting pinagsama upang maging isang monolayer. Pagkatapos makatanggap ng sapat na bilang ng mga cell, ang resultang suspensyon ay ibinhi sa mga dressing ng sugat na inihanda para sa layuning ito at inilalagay sa mga Petri dish. Una, ang isang monolayer at pagkatapos ay isang multilayer na layer ng keratinocytes ay nabuo mula sa suspensyon. Ang mga yugto ng proseso ng paglilinang ng keratinocyte ay schematically na ipinapakita sa Fig. 12 (33,43,54,65).

Ang pagbuo ng isang multilayer na keratinocyte layer na angkop para sa paglipat ay karaniwang tumatagal ng 7-10 araw. Minsan ang panahong ito ay mas mahaba, na nakasalalay sa kalidad ng pinagmumulan ng materyal (edad, kondisyon ng kalusugan ng donor, kawastuhan ng koleksyon ng materyal, kalidad ng media na ginamit, atbp.). Kung ang multilayer layer ay lumago, kung gayon ang mga cell na may apoptosis phenomena na hindi angkop para sa paglipat ay maaaring lumitaw sa ibabaw nito. Ang mga petri dish na may multilayer keratinocyte layers (MLK) na lumaki sa mga ito sa mga panakip ng sugat ay inihahatid sa klinika sa mga espesyal na lalagyan sa temperatura na hindi bababa sa +15° C.

Binagong Paraan ng Green para sa Paglago ng MPC

Sa aming trabaho, ginamit namin ang multilayer na cambric bilang panakip ng sugat, na iniwan ang mga pelikulang "Polypor" kung saan nagsimula kaming magtrabaho sa eksperimento sa mga daga. Kaya, pinalaki namin ang mga multilayer na keratinocyte layer sa pre-defatted at sterile na cambric, bagama't hindi rin ito isang pinakamainam na pantakip sa sugat.

Ang mga klinikal na pag-aaral ay isinagawa sa mga boluntaryo bilang pagsunod sa mga kinakailangang pamantayang etikal: paglagda ng isang kasunduan at may kaalamang pahintulot.

1. Ginamit ang kultura ng sariling (autologous) at banked (allogeneic) keratinocytes ng pasyente.
2. Ang sariling mga keratinocytes ng mga pasyente ay nakuha mula sa isang piraso ng balat na hiwa mula sa loob ng kanilang mga braso sa itaas.
3. Ang operasyon ng scar dermabrasion ay isinagawa gamit ang thermocautery, rotary disc at isang erbium laser.
4. Ang mga grupo ng mga pasyente na may normotrophic, hypotrophic at hypertrophic scars ay kinuha.

Ang teknolohikal na proseso para sa aplikasyon ng teknolohiyang cellular upang mapabuti ang hitsura ng mga peklat sa balat ay binubuo ng mga sumusunod na yugto:

1. Pagpili ng pasyente.
2. Mga paliwanag ng kakanyahan ng paggamot, ang takdang panahon para sa pagkuha ng mga inaasahang resulta, pagpirma ng kontrata at may-kaalamang pahintulot.
3. Magreseta sa mga pasyente 2-3 linggo bago ang operasyon selmevit 1 tablet 3 beses sa isang araw, zinctheral 1 tablet 3 beses sa isang araw.
4. Ang pagkuha ng isang piraso ng balat na 2.0 cm ang haba at 0.7-1.0 cm ang lapad mula sa panloob na ibabaw ng balikat, mataas, halos sa ibabang bahagi ng axillary region upang makakuha ng autologous keratinocytes.
5. Sa mga kaso kung saan ang mga pasyente ay tumanggi na magkaroon ng kanilang sariling mga keratinocytes na ihiwalay dahil sa posibilidad ng isang linear na peklat sa panloob na ibabaw ng balikat, ang cellular na materyal ay kinuha mula sa isang cell bank (allogeneic keratinocytes).
6. Ang mga keratinocyte ay ibinukod at pinalaki sa isang laboratoryo na sertipikado para sa ganitong uri ng trabaho.
7. Matapos makakuha ng sapat na halaga ng MPC para sa paglipat sa mga peklat, isang araw ang itinakda para sa operasyon sa klinika, kung saan ang materyal ay dinala sa mga espesyal na lalagyan sa mga pagkaing Petri.
8. Ang isang operasyon ng scar dermabrasion ay isinagawa, hemostasis, ang pinakintab na ibabaw ay hugasan ng isang sterile saline solution, pinatuyo, pagkatapos kung saan ang mga MPC ay inilipat dito sa sterile cambric na "mga cell pababa". Iyon ay, ang mga cell na nasa itaas sa MPC ay naging mas mababa, katabi ng makintab na ibabaw.
9. Ang isang sterile film ay inilapat sa itaas, na naayos sa balat na may isang nababanat na bendahe o nababanat na plaster ng Omnifix. Sa halip na ang pelikula, maaaring gamitin ang walang malasakit na mga dressing ng sugat na naglalaman ng silicone, halimbawa Mepitel, Mepiform, silicone gel sheet.

Pagkatapos ng 5-7 araw, ang film o silicone coating ay tinanggal. Sa oras na ito, ang lahat ng mga keratinocyte ay dapat na gumapang papunta sa pinakintab na peklat at nakakabit sa ibabaw nito.

10. Ang basa-basa na kapaligiran na nilikha sa ilalim ng pelikula at silicone coating ay aktibong nag-aambag dito. Ang cambric na natitira sa peklat mula sa puntong ito ay maaaring ibabad ng curiosin o chitosan gel. Bilang resulta, sa ika-2 araw ang isang siksik na crust ay nilikha, na, para sa kaginhawahan ng pasyente, ay pinakamahusay na naayos na may isang nababanat, breathable patch, tulad ng Omnifix. Ang breathable crust ay nagpapahintulot sa nabuo na epidermis na mag-iba at maging isang mature.

Depende sa uri ng peklat at ang lalim ng paggiling, ang bendahe ay tinanggihan pagkatapos ng 8-10 araw. Sa oras na ito, ang epidermis ay may 30-40% na higit pang mga layer ng cell kaysa sa normal na balat. Ang basement membrane ay hindi nabuo. Ang mga keratinocytes ng makapal na epidermis ay naglalabas ng maraming biologically active molecules sa scar tissue.

Ang tagumpay ng biotechnological scar treatment ay higit sa lahat ay nakasalalay sa paraan ng pangangalaga sa postoperative period. Ang mga cell culture ay isang "magiliw" na uri ng panakip ng sugat at sa mga unang yugto pagkatapos ng paglipat, ang mga IPC ay madaling matanggal mula sa pinagbabatayan na mga tisyu. Samakatuwid, ang mga pasyente ay pinapayuhan na maingat na hawakan ang peklat pagkatapos ng operasyon. Sa loob ng 8-9 na buwan, huwag kuskusin at malumanay na gamutin ng malamig na pinakuluang tubig upang maiwasang mapunit ang manipis, bagong likhang epidermis, na walang mahigpit na pagkakatali sa pinagbabatayan na mga tisyu.

Tandaan.

Bago ang operasyon at sa panahon ng dermabrasion, ang paggamit ng halogenated antiseptics at oxidizers (iodopyrone, suliodopyrone, iodinol, iodinate, chlorhexidine, hydrogen peroxide) ay pinahihintulutan, bago ang cell transplantation - ay mahigpit na kontraindikado dahil sa kanilang cytotoxic effect. Ang methylene blue at brilliant green ay nakakalason din sa mga cell.

Upang maiwasan ang impeksyon, lalo na kapag nagtatrabaho sa hypertrophic scars, ang surgical field ay maaaring gamutin ng neomycin sulfate, polymyxin o gentamicin. Wala silang cytotoxic effect sa mga keratinocytes.

Bilang resulta ng naturang paggamot, nakakamit ang triple effect.

1. Pag-level sa ibabaw ng peklat.
2. Paglikha ng isang layer ng bagong epidermis ng normal na kapal sa itaas nito.
3. Pagbabago ng scar tissue sa dermal-like tissue dahil sa pagkilos ng mga cytokine, growth factor at iba pang biologically active molecules na itinago ng mga transplanted cells at pinasigla ng mga ito ang mga keratinocytes, fibroblast at macrophage.

Ang peklat ay nagiging hindi gaanong kapansin-pansin, mas nababanat, ang mga pores at vellus na buhok ay lilitaw dito, at ang pigmentation ay maaaring maibalik dahil sa pagkakaroon ng mga melanocytes sa IPC.

Gayunpaman, ang lahat ng mga positibong aspeto ng peklat ay hindi kaagad nangyayari. Kaugnay nito, kinakailangang bigyan ng babala ang mga pasyente na ang proseso ng pagbabagong-anyo ng scar tissue sa dermal tissue ay nangyayari nang dahan-dahan at ang pinakamainam na resulta ng naturang paggamot ay maaaring asahan nang hindi mas maaga kaysa sa 10-14 na buwan. Kaagad pagkatapos ng pagtanggi ng mga dressing, ang pinakintab na mga ibabaw ay may binibigkas na polychromy, mas maliwanag ang mas malalim na buli ay ginanap. Ang hindi bababa sa pinsala sa balat ay nabanggit kapag bulihin ang normotrophic scars na may erbium laser. Ang kulay ng mga peklat at nakapalibot na balat ay naibalik sa loob ng 3 hanggang 8 linggo. Sa kabila ng gayong mga pag-iingat, ang postoperative hyperpigmentation minsan ay nangyayari, na maaaring mawala nang mag-isa sa loob ng ilang buwan.

[ 1 ], [ 2 ], [ 3 ], [ 4 ], [ 5 ], [ 6 ], [ 7 ], [ 8 ], [ 9 ], [ 10 ]