Ang non-viral gene therapy ay nag-aalok ng pag-asa para sa talamak na sakit sa likod

Sa isang kamakailang pag-aaral na inilathala sa journal Biomaterials, nakabuo ang mga mananaliksik ng isang nobelang non-viral gene therapy upang gamutin ang discogenic back pain (DBP) sa pamamagitan ng paghahatid ng transcription factor na Forkhead Box F1 (FOXF1) gamit ang engineered extracellular vesicles (eEVs) sa mga degenerative intervertebral disc (IVDs) sa vivo.

Ang talamak na sakit sa likod (LBP) ay isang lumalaking pandaigdigang problema dahil sa isang tumatanda na populasyon at lumalalang mga problema sa opioid. Kasama sa mga kasalukuyang paggamot ang panandaliang lunas o mamahaling operasyon, na nagbibigay-diin sa pangangailangan para sa mga hindi nakakahumaling at hindi gaanong invasive na mga therapy.

Ang mga kasalukuyang biological approach, kabilang ang growth factor administration, cell therapy, at viral gene therapy, ay maaaring mabawasan ang pagkabulok sa mga modelo ng hayop at tao. Gayunpaman, ang mga isyu tulad ng mga panandaliang epekto, mahinang pangmatagalang efficacy, at hindi kinakailangang immunogenicity at oncogenicity ay maaaring makahadlang sa direktang paggamit ng mga pamamaraang ito.

Sa pag-aaral na ito, ang mga mananaliksik ay nagtatag ng non-viral gene therapy para sa intervertebral disc degeneration (IVD) gamit ang FOXF1-eEV.

Inilipat ng mga mananaliksik ang pangunahing mouse embryonic fibroblast (PMEF) na may mga plasmid na naglalaman ng FOXF1 o pCMV6 bilang kontrol at nailalarawan ang mga sample ng eEV gamit ang nanoparticle tracking assay (NTA).

Sinuri nila ang mahusay na pag-load ng molecular cargo sa mga eEV gamit ang quantitative reverse transcription-polymerase chain reaction (qRT-PCR) at conventional PCR. Natukoy ng pagsusuri sa Western blot ang FOXF1 at mga protina na tukoy sa EV sa mga pagbuo ng eEV. Gumamit ang team ng mga plasmid na nagpapahusay sa upper at lower polylinker regions para matukoy ang presensya ng FOXF1 plasmid DNA sa mga donor cell at nakabuo ng mga eEV.

Sinuri nila ang buong-haba na mRNA na ginawa mula sa plasmid DNA sa mga eEV at donor cell.

Lumikha ang mga mananaliksik ng mga extracellular vesicle na may mga transcription factor upang maibalik ang function ng tissue at baguhin ang mga tugon sa sakit sa isang modelo ng hayop ng DBP.

Natukoy nila ang mga EV para sa transportasyon at pamamahagi ng FOXF1 sa mga nasirang intervertebral disc sa isang mouse model ng discogenic back pain upang matukoy ang FOXF1 eEV inhibition ng intervertebral disc degeneration.

Pinagsama ng team ang biomechanical testing ng mouse intervertebral discs na may imaging, extracellular matrix (ECM) na pagbabago, at mga tugon sa sakit na nasuri pagkatapos ng 12 linggo upang kumpirmahin ang mga pagbabago sa istraktura at paggana, pati na rin ang sakit, na dulot ng therapeutic intervention.

Kasama sa mga pagsusuri sa sakit na preoperative at postoperative ang micro-computed tomography (micro-CT), magnetic resonance imaging (MRI), mechanical testing, Alcian blue (AB) at picrosirius red (PSR) staining, dimethylmethylene blue test, at immunohistochemistry (IHC).

Ang pag-aaral ay nagsasangkot ng isang surgical technique kung saan ang mga mananaliksik ay pinangangasiwaan ang Buprenorphine ER subcutaneously sa mga daga upang makontrol ang post-operative pain.

Ang koponan ay nagsagawa ng mga pagsusuri sa pag-uugali bago ang operasyon at bawat dalawang linggo mula apat hanggang 12 linggo pagkatapos ng operasyon, gamit ang iba't ibang pamamaraan kabilang ang open field test, cold plate, tail suspension, at wire suspension.

Sinuri ng open field test ang kusang aktibidad ng mga daga; ang mga pagsubok sa malamig na plato ay sinusukat ang thermal hyperalgesia; Sinusukat ng mga pagsusuri sa suspensyon ng buntot ang sakit ng ehe; at sinukat ng mga pagsubok sa suspensyon ng wire ang lakas.

Labindalawang linggo pagkatapos ng operasyon, hiniwalay ng koponan ang lumbar spines ng mga hayop gamit ang femoral nerve at artery tracing upang makilala ang mga intervertebral disc sa pagitan ng L4 at L5, L5 at L6, at L6 at S1 IVD. Ginamit nila ang L5/L6 IVD upang masuri ang histology at matukoy ang nilalaman ng glycosaminoglycan (GAG).

Malaking binawasan ng mga FOXF1 eEV ang mga tugon sa pananakit habang nire-restore ang istraktura at paggana ng IVD, kabilang ang pinahusay na taas ng disc, tissue hydration, proteoglycan content, at mga mekanikal na katangian.

Nakatuon ang pag-aaral sa pagpapalabas ng mga FOXF1-loaded na eEV mula sa mga pangunahing fibroblast na inilipat gamit ang transcription factor na FOXF1. Ang dami ng RT PCR ay nagpakita ng isang makabuluhang pagtaas sa mga antas ng transcript ng FOXF1 mRNA at full-length na na-transcribe na mga antas ng FOXF1 mRNA kumpara sa mga cell na inilipat ng pCMV6.

Maaaring bawasan ng FOXF1 eEV therapy ang mga tugon sa pananakit sa isang modelo ng lumbar disc puncture sa mga daga nang hanggang 12 linggo. Ang mga babaeng daga ay nagpakita ng mas mahabang oras ng pag-atake sa grupong ginagamot ng FOXF1 kaysa sa napinsalang grupo, na tumagal ng hindi bababa sa 12 linggo pagkatapos ng paggamot.

Pinahusay ng FOXF1 eEV therapy ang IVD tissue hydration at height sa mga nasugatan at degenerative na hayop sa vivo, habang pinapanatili ang mga antas ng hydration at IVD disc T2-weighted image intensity.

Gayunpaman, napansin ng koponan ang pagbawas sa taas ng disc sa mga nasugatang hayop at hayop na ginagamot ng pCMV6 eEV. Ang mga daga na ginagamot sa FOXF1 eEV ay walang pagbawas sa taas ng disc 12 linggo pagkatapos ng paggamot. Hindi naapektuhan ng kasarian ang mga functional na kinalabasan.

Ibinalik ng mga FOXF1 eEV ang mekanikal na paggana ng mga nasira at degenerated na IVD sa vivo. Sa ilalim ng axial stress, ang FOXF1 eEVs-treated IVDs ay nagpakita ng mas mataas na normalized NZ stiffness kumpara sa mga nasirang IVD.

Sa ilalim ng mga kondisyon ng creep, ang mga nasirang IVD ay nagpakita ng mas mataas na normalized na creep displacements, na nagpapahiwatig ng pagbaba sa normalized na creep elastic stiffness.

Ipinapakita ng mga resulta na ang pagbabawas ng nilalaman ng GAG sa mga nasirang IVD ay nagpapataas ng mekanikal na flexibility, ngunit pinipigilan ng eEV therapy ang pagkawala ng mga glycosaminoglycans at mga kasunod na pagbabago sa mekanikal na paggana.

Ang mga FOXF1 eEV ay nagdulot ng mga pagbabago sa istruktura at functional sa IVD sa pamamagitan ng pagtaas ng mga antas ng proteoglycan at GAG.

Ang mga resulta ng pag-aaral ay nagpakita na ang mga eEV na puno ng mga developmental transcription factor ay maaaring gamutin ang mga masakit na joint disease gaya ng DBP sa pamamagitan ng paghahatid ng mga transcription factor na ito sa degenerative at painful joints sa pamamagitan ng IVD.

Maaaring makatulong ang diskarteng ito na bawasan ang mga structural at functional na abnormalidad na dulot ng sakit at i-regulate ang mga tugon sa pananakit sa paraang partikular sa kasarian.

Inirerekomenda din ng mga mananaliksik ang paggamit ng mga kadahilanan ng transkripsyon ng pag-unlad tulad ng FOXF1 upang ilipat ang mga degenerative na selula ng NP sa isang pro-anabolic na estado sa vivo. Ang mga karagdagang pag-aaral ay kinakailangan upang matukoy ang therapeutic efficacy nito.