Eksperimental na gawain sa paglipat ng allogeneic keratinocytes sa artipisyal na nilikha na mga peklat ng mga puting daga

Ang pagnanais na gumamit ng mga potensyal na cellular at ang pangangailangan upang maghanap ng mga bagong epektibong pamamaraan para sa pagpapabuti ng aesthetic hitsura ng mga scars na humantong sa ideya ng sinusubukan na pag-aralan ang posibilidad ng transplantation ng keratinocyte sa scarring na ibabaw.

Upang patunayan ang posibilidad ng paggamit ng keratinocyte kultura upang mapahusay ang hitsura ng scars experimental trabaho ay tapos na sa puti laboratoryo daga, na kung saan ay nilikha scar surface. Pagkakapilat modelo rats ay inihanda ng artipisyal na nakapagpapagaling na mga sugat na idinulot sa likod, kasama ang spinal column. Rats ay i-cut piraso ng parehong katad, laki ng 2x3 cm. Pagkatapos ng 2.5 na buwan matapos ang operasyon "simulation pagkakapilat" daga ay isinagawa dermabrasion surgery (pag-alis ng itaas na layer sa pamamagitan ng ignioperation unang sikmura) at transplanted allogenic keratinocytes, na nakahiwalay mula sa balat ng mga batang daga 2-4 na araw pagkatapos ng kapanganakan.

Ang paghihiwalay at paglago ng mga epidermeto ng daga ay isinagawa sa laboratoryo ng mga teknolohiya ng cellular ng Institute of Cytology RAS ng sumusunod na teknolohiya.

Ang balat ay hugasan sa Hanks na solusyon sa asin na naglalaman ng 200 U / ml gentamicin, gupitin sa maliliit na piraso na may isang lugar na 0.2-0.5 cm ². Ang mga cube ng balat ay incubated sa isang 0.5% solusyon ng disaspase sa isang balanced saline pospeyt-buffered solusyon sa 37 ° C para sa isang oras. Ang mga piraso ay pagkatapos ay inilipat sa pospeyt Dulbecco buffered saline at ang epidermis ay separated mula sa dermis. Ang epidermis ay incubated sa 0.125% trypsin solusyon para sa 10-15 minuto sa ilalim ng pagpapakilos sa isang bilis ng 50 magpatulin / min, kung saan pagkatapos, ang mga enzyme ay tumigil sa pamamagitan karagdagan ng 5% pangsanggol ng baka suwero. Isa ikatlo ng ang resultang cell suspensyon ay ginamit sa purong form para sa isa sa mga pagpipilian upang itanim sa ibang lugar scars, pangalawa ikatlong lumago sa domestic biocompatible film coating "Polipor", ang ikatlong - sa isang petri ulam na walang substrate. Operasyon dermabrasion nakuha pagkakapilat sa daga na may kasunod na transfer sa kanila epidermotsitov daga sa ilalim ng eter kawalan ng pakiramdam ay ginanap sa paggamit cautery.

Ang unang grupo ng mga rats pagkatapos ng dermabrasion sa pinakintab, hugasan na may asin at tuyo ibabaw payat unang sikmura superimposed piraso ng damuhan, na kung saan ay nadeposito scrambled allogeneic daga epidermotsitov slurry sa isang konsentrasyon ng 1.5 milyong cells per 1 ML (ayon sa Institute of Cytology). Ang mga piraso ng Batistovye ay nababagay sa pinakintab na peklat upang ang mga selyula ay nakahiga sa ibabaw ng peklat. Bendahe sa tuktok ng ilang mga layer ng tsisklos, na kung saan ay sewn sa mga gilid ng mga galos.

Ang bahagi ng nagresultang suspensyon ng cell ay plated sa Petri dishes sa sterile Polypore films na pinutol sa hugis ng tasa, ang iba pang bahagi sa mga pinggan ng Petri nang walang pelikula. Ang paglilinang ay isinasagawa sa isang daluyan ng FAD na binubuo ng isang timpla ng DMEM at F12 sa isang ratio ng 3:01. Kasama ang pagdaragdag ng 10% fetal bovine serum, 5 μg / ml insulin (Sigma), 0.5 μg / ml hydrocortisone hemisuccinate (Sigma). 10 μg / ml epidermal growth factor EGF (Institute of Cytology RAS, St. Petersburg). Ang pangalawa at pangatlong pangkat ng mga daga na may 7 na indibidwal ay pinatatakbo nang 6 na araw pagkatapos ng una. Sa panahong ito, ang multilayer strata ay nabuo mula sa suspensyon ng mga nahahaling na keratinocytes sa mga pagkaing petri, na inilipat sa mga daga. Ang ikalawang grupo ay inilipat sa epidermocytes sa pelikula, ang ikatlong grupo - na may isang multilayered layer na walang isang substrate. Pagkatapos ng 7 araw, ang multilayered layers ng alogic keratinocytes (MPALK), na nahasik sa mga pelikulang Polypore, ay inilipat sa kultura nang direkta sa ibabaw ng sugat. Sa itaas, ang pelikula, upang maiwasan ang pagkagupit nito, ay naayos na gamit ang isang multilayer na gown na dressing at naitahi sa balat ng mga daga.

Bago maglipat-tanim keratinocytes ikatlong grupo ng mga rats, nasa hustong gulang na walang ang substrate, na gumagawa ng paghihiwalay ng PAC mula sa ilalim ng Petri ulam dispase paggamot, pagkakaroon ng kakayahan upang nang pili masira ang dermo-ukol sa balat komunikasyon. Sa ilalim ng pagkilos ng isang multilayered reservoir dispase destroys ang koneksyon ng saligan cell layer sa ibaba ng Petri ulam at sa isang mas mababang lawak, ito ay nakakaapekto sa pagitan ng mga selula na komunikasyon, na ginagawang posible na "alisin" ang buong layer. Ang detachment ng multilayered cell stratum sa pamamagitan ng disposisyon ay isinasagawa bilang mga sumusunod. Mula Petri dish pinaghalo transport medium, ang cell sheet ay hugasan ng tatlong beses na may medium na naglalaman ng antibiotics, sa partikular - gentamicin (0.2 mg / ml). Multilayer layer ay ibinuhos 0125% dispase solusyon ( «Sigma») at inilagay sa isang incubator kung saan sila ay incubated sa t = 37 ° C para sa 20-30 minuto. Ang hitsura ng puting corolla, pagbabalat sa buong paligid ng reservoir - isang tagapagpahiwatig ng simula ng proseso ng paghihiwalay nito mula sa gilid at ibaba ng Petri dish. Ilang minuto pagkatapos ng simula ng paghihiwalay proseso, dispase solusyon ay emptied 2-3 beses epithelial layer ay hugasan na may medium. Sa ibabaw ng mga ukol sa balat layer ay inilapat, i-cut sa laki tasa piraso sterile sugat dressing "Leith-kulay, na kung saan ay dumidikit na pinaghihiwalay dispase pormasyon, karagdagang delamination ng ilalim ng tasa na may isang spatula. Ang paggamit ng optalmiko tweezers layer kasama ang coating ng napkin" Leith-color "(Russian ) sinira ang layo mula sa ilalim ng isang petri ulam at maingat na inilipat sa ang naghanda ibabaw ng peklat. Napkin "Lita-color" ay naglalaman ng sa kanyang komposisyon at gentamicin eksolin (collagen kunin), na kapag basa kapaligiran ay nananatiling sibol sa hinaharap Shem asin solusyon namaga at naging modernong sugat coating na nagbibigay ng mahusay na proteksyon mula sa panlabas na impeksiyon at mabilis na paglunas dahil sa bagu-bago pa wetness sa kaayusan.

Sa pelikula "Polipor" napkin "Leith-color" superimposed multilayer gasa dressings, na kung saan ay sewn sa balat ng daga sa kanilang mga mas malakas na pagkapirmi. Ang bawat daga ay nakatanim sa isang hiwalay na hawla, upang lumikha ng pinakamainam na kondisyon para sa pagpapanatili at pag-ukit ng mga transplanted keratinocytes. Bandages daga na transplanted pagsususpinde at multilayered reservoir epidermotsitov shot dispase, araw-araw ng ilang beses sa isang araw, na nilagyan ng sterile saline upang lumikha ng ang pinaka-kanais-nais na mga kondisyon ng mga cell para engraftment. Isinasaalang-alang na ang "Polipor" film ay hindi tatagusan sa tubig, ang mga daga ng ikalawang grupo humidification dressings hindi na gumana, na kung saan ay isa sa mga pakinabang ng mga pelikula nang walang paunang transplants. Pagkalipas ng 10 araw, inalis ang mga bendahe. Ang clinical larawan ng pagkakapilat sumusunod transplantation ng mga cell ay hindi naiiba magkano mula sa transplant na walang pagkakapilat, maliban sa isang kulay-rosas pangkulay sa kanila (sa pamamagitan ng dermabrasion) at higit pa pagbabalat. Ang katotohanang ito ay nagpapahiwatig na. Na kaagad matapos ang pagkawala ng coverings ng sugat sa IPC, walang mga pagbabago ang naganap sa rumen.

Pagkuha ng biopsy na materyal sa mga daga.

Matapos ang 1, 2, 5 at 9 na buwan matapos ang paglipat ng mga alogic keratinocytes sa lupa ng mga puting daga, ang materyal ay kinuha para sa mikroskopikong pagsusuri ng histological, cytomorphological at elektron. Bilang isang halimbawa ng kontrol ng normal na daga balat at peklat ay kinuha nang walang paglipat ng mga cell. Ang kawalan ng pakiramdam sa mga daga ay ginanap sa pamamagitan ng ether anesthesia.

Pagkatapos ng anesthesia, mula sa mga lugar na minarkahan, kung saan itinutulak ang mga keratinocytes, isang biopsy piercer na may diameter na 2 mm. Ang mga piraso ng peklat tissue ay kinuha at inilagay sa 2.5% glutaraldehyde solution upang maihanda ang materyal para sa mikroskopya ng elektron. Piraso ng tissue na kinuha para sa histological pagsusuri ay inilagay sa 10% neutral pormalin solusyon, na sinusundan ng pamamagitan sa pag-wire alcohols at napunan parapin, na sinusundan ng pag-cut ng mga seksyon ultrathin at pagtingin sa mga ito sa light-optical mikroskopyo.

Kontrolado I. Normal na balat ng daga.

Upang makita ang pagkakaiba sa pagitan ng microscopic larawan ng normal na peklat-binago daga balat at pagkakapilat pagkatapos ng isang tiyak na tagal pagkatapos ng paglipat ng IPC, mga larawan at mga paglalarawan ay ipinapakita sa kanila sa lahat ng phase ng pag-aaral.

Ang epidermis ng normal na balat ay binubuo ng 7-9 layers ng mga selula. Malaking layer ng katamtamang kapal. Sa mga lugar na ito ay binubuo ng 6-8 layers ng horny kaliskis. Ang saligan layer ay kinakatawan ng mga cell ng cylindrical hugis na may malaking liwanag, regular na nuclei at ilang nucleoli. Ang mga koneksyon sa pagitan ng mga selula at basal lamad ay malinaw na ipinahayag. Sa ilalim ng maayos na natukoy na saligan lamad na may pinong protuberances in subepidermal layer kasinungalingan Kahambing sa mga banayad na mga bundle ng collagen at elastin fibers, kabilang pahabang fibroblasts, maliit na sasakyang-dagat. Sa mas malalim na mga layer, ang mga bundle ng collagen at elastin fibers ay nasa iba't ibang direksyon. Kabilang sa mga ito ang maraming mga vessel na may manipis na pader ng parehong kalibre, cellular elemento (fibroblasts, mast cells, leukocytes). Sa isang malaking bilang ng mga hair follicles, sebaceous glands.

Pagkontrol 2. Pagsugpo ng isang daga 2 buwang gulang.

Klinikal na larawan. Scars maputla kulay rosas, na may pagbabalat, sa mga lugar na ang crusts mananatiling. Ang kanilang lugar ay nabawasan dahil sa ang pag-urong ng collagen fibers at maging humigit-kumulang 3.0-3.5 cm ^:. Ang mga attachment ng balat ay wala.

Microscopic picture. Epidermis ay binubuo ng 3-5 mga layer ng mga cell, may pileges, kinakatawan ng bilugan basal cell, isang hilera subulate, 1-2 mga hilera keratohyalin maliit na butil na may butil sa itaas na layer, may mga bahagi ng intracellular edema. Ang corneal layer ay heterogeneously nagbago mula sa napaka manipis sa thickened. May isang natitiklop na rumen dahil sa (contraction) ng scar tissue. Ang folds tumagos sa papillary layer at bigyan ang impression ng papillae. Ang hangganan sa pagitan ng mga epidermis at dermis ay isang tuwid na linya. Ang basal lamad ay hindi maaaring masubaybayan saan man. Sa mas mababang bahagi ng subepidermal at mas malalim na mga layer - mga sisidlan na may makapal, hagdan na pader, maraming mga desyerto, na may stasis phenomena. Sa paligid ng mga vessel - isang kumpol ng macrophages, fibroblasts. Ang mga macrophage ay pumapalibot sa mga erythrocyte na lumilitaw mula sa mga capillary at phagocytize sa kanila. Sa mas mababaw na layers - maliliit na capillaries. Sa ilalim ng epidermis, ang mga fibre ng collagen ay maluwag. Sa mas malalim na layer ng rumen - magaspang na bundle ng mga fibre ng collagen kung saan maraming mga fibroblast.

Pagkakasira ng isang daga sa isang buwan pagkatapos ng paglipat ng MPAl rat rat keratinocytes.

Klinikal na larawan. Scars pink, ang kanilang lugar ay nabawasan, lalo na sa diameter at katamtaman 2.5-3 cm ². Ang mga glandula ng buhok at mataba ay wala.

Ang mga mikroskopiko pagsusuri ng mga materyal na nakuha mula sa daga na may transfer MPAlK MPAlK sa film at ang substrate na walang malaki-laking magkapareho. Gayunpaman, technically, trabaho na may MPAlK hindi suportadong mas mahirap at matrabaho kaysa sa kapag nasa hustong gulang na MPAlK sa substrate, kaya ang higit pang pag-aaral ng ang isyu sa transplant kertainotsitov scars ginamit namin bilang batayan para sa paglilinang ( "substrate") layered lawn.

Microscopic picture. Mayroong isang pampalapot ng epidermis sa 15-20 layers, halos sa gitna kung saan ang keratinocytes ay may makitid, haba, vertical na hugis at isang compact na pagsasaayos. Ang mga basal na selula ay nakaayos sa isang hindi pantay na linya. Ang kanilang nuclei ay ilaw, malaki, may hugis sa isa o dalawang nucleoli, na nagpapahiwatig ng kanilang mataas na sintetiko at proliferative na aktibidad. Ang hangganan sa pagitan ng mga epidermis at dermis ay isang tuwid na linya. Ang matinong layer ay mahusay na binuo, ay binubuo ng 3-5 layers ng mga cell ng round hugis, mayroong 2 nucleolus cells.

Kaagad sa ilalim ng basal na lamad - ang makapal na nakikitang manipis na mga bundle ng mga fibre ng collagen, kahanay sa kanila ang isang malaking bilang ng mga walang laman na vessel, ang mas malalalim na mga fibre ng collagen ay mas malala, na nakolekta sa siksik na mga bundle. Maraming mga malalaking fibroblasts, mast cells (2-3 sa larangan ng pangitain), mga macrophage, leukocytes at mga walang laman na sisidlan, ang mga pader na kung saan ay naluluwag, sa paligid ng mga ito ay maluwag na matatagpuan sa collagen fibers. Sa ilang mga vessels - stasis, diapedesis ng uniporme elemento. Sa paligid ng mga vessel - fibroblasts, solong lymphocytes. Ang mga attachment ng balat ay wala.

Kapag ang isang keratinocyte suspension ay transplanted sa isang makinis na peklat, ang mikroskopiko larawan ay naiiba mula sa nakaraang isa. Sa karamihan ng mga hayop - ang epidermis ay manipis, binubuo ng 5-6 layers ng mga cell. Ang mas mababang layer ay binubuo ng mga cell ng irregular, polygonal na hugis na may bilugan-irregularly shaped nuclei. Ang kalagayan ng subepidermal layer ay katulad ng sa grupo ng mga hayop na walang transplantation.

Sa kasong ito, ang isa ay maaaring magsalita ng alinman sa pagkaantala ng mga proseso na kasama ng paglipat ng cell, o ng isang malaking pagkawala ng mga selulang transplanted sa anyo ng isang suspensyon. Kaya, isang konklusyon na ginawa na ang pagwawasto ng pagkakapilat sa pamamagitan ng paglipat ng keratinocyte sa anyo ng isang suspensyon ay hindi naaangkop.

Pagkasira ng daga 2 buwan matapos ang paglipat ng MPAl rat rat keratinocytes.

Klinikal na larawan. Ang peklat ay mukhang manipis, malambot. Sa mga lugar ay may isang ecdysis, kaliskis.

Mga mikroskopikong larawan. Ang stratum corneum ay thickened, sa mga lugar - hyperkeratosis. Ang epidermis ay thickened, ito ay binubuo ng 12-20 hanay ng mga cell. Ang hangganan sa pagitan ng mga epidermis at dermis ay isang tuwid na linya. Ang pinong collagen fibers sa ilalim ng epidermis ay ganap na mahigpit. Sa mas malalim na mga layer ng rumen sila ay nakolekta sa magaspang malaking bundle. Sa subepidermal layer, lumilitaw ang isang bagong pagbuo ng mga vessel. Sa mas mababang mga layer ng peklat tissue - maraming mga walang laman na vessel, na matatagpuan parallel sa ibabaw ng panlabas na bahagi ng balat. Ang mga malalaking fibroblasts ay pantay na ipinamamahagi sa kapal ng rumen, mayroong mga giant, multifaceted, maraming macrophage.

Pagkasira ng daga 5 buwan matapos ang paglipat ng MP ng mga spermocytes ng daga.

Klinikal na larawan. Scar mukhang makinis, makinis, nang walang pagbabalat, may mga single buhok man ng kanilang mas mataas na density sa paligid ng mga galos, na nagpapahiwatig sa gilid pasalingsing buhok follicles sa unang sikmura at maga ng mga follicles ng buhok. Ang lugar ng mga scars ay patuloy na bumaba.

Microscopic picture. Ang epidermis ay pa rin ang makapal (15-20 layers, kung minsan hanggang sa 30) sa itaas na layer ay puno ng keratogialin butil. Ang basal lamad ay malinaw na nakikita. Sa ilalim ng kanyang fibers fibers namamalagi maluwag. Sa mas mababang mga layer - ang collagen ay mas malakas at mahigpit na nakaimpake. Kabilang sa mga beams ng collagen ay mayroong maraming mga capillaries .. Sa itaas na mga layer ang bilang ng mga walang laman vessels nabawasan. Ang epidermis at dermis ay bahagyang kulot. May malalim na mga panlabas na epidermal sa tisyu ng peklat. Kabilang sa mga fibers ng collagen ay nakikita ang mga bagong nabuo na mga sisidlan. Lumitaw ang mga solong follicles ng buhok at mga sebaceous na glandula.

Pagkapira ng daga 9 buwan matapos ang paglipat ng IPA rat rat epidermocytes.

Klinikal na larawan. Ang mga scars ay naging mas maliit sa paghahambing sa mas maaga na mga termino, ang kanilang mga lugar na katamtaman ang tungkol sa 1.5-2.0 cm ². Ang mga scars ay hindi pantay na sakop ng manipis na buhok, lalo na sa paligid ng paligid. Ang maliliit na maliliit na plato ay pinapanatili.

Microscopic picture.

Ang epidermis ay naging mas payat, na kinakatawan mula sa 6-8 na hanay ng mga selula, nakapagpapaalaala sa epidermal na istraktura ng normal na balat ng mga daga, lamang ang density ng mga cell ng 1 mm. Mas mataas at mas maliit ang mga ito. Ang basal layer ay binubuo ng mga maliliit na selula ng round-cylindrical na hugis. Ang saligan lamad ay mahusay na tinukoy, ang hemidesmosomes ay malinaw na nakikita. Ang pagkakaroon ng epidermal outgrowths sa subepidermal layer ay nabanggit. Ang papillary layer ay ipinahayag kasama ang buong haba ng peklat. Ang mga katotohanang ito ay nagpapakita na sa panahong ito ang pagdirikit ng mga transplanted keratinocytes ay naging mas matibay sa mga pinagbabatayan ng mga tisyu ng rumen. Dahil dito, ang pag-aalaga ng mga scars ng mga tao na may MALC transplantation 9 buwan pagkatapos ng IPC transplantation ay maaaring tradisyonal. Sa ilalim ng epidermis ay mas pinong collagen fibers kaysa sa malalim na layers. Maraming mga barko, lalo na sa mababaw na lugar. Sa mas malaking mga sisidlan, ang mga dingding ay tumangkilik. Mga follicle ng buhok at sebaceous glands sa malalaking dami. Ang microscopic pattern ay kahawig ng isang tissue ng balat.

Mga resulta ng eksperimentong trabaho at kanilang talakayan.

Sa panahon na ito ng trabaho sa artificial balat scars ng rats pagkatapos ng operasyon dermabrasion, transplanted keratinocytes sa iba't-ibang formah- sa mga sugat ibabaw, bilang isang suspensyon sa cambric at layered pormasyon walang substrate. Ang gawain ay ginawa upang makuha ang data ng morphological sa epekto ng transplanted allogenic keratinocytes sa mga scars, pati na rin ang pagtukoy ng pinakamainam na mga variant na transplant.

Ito ay natagpuan na ang lahat ng tatlong mga paraan ng transplanting tunay na, ngunit walang transplantation Mpaka substrate - isang napaka-nakapapagod na proseso, sa panahon na kung saan Mpaka ay maaaring nasugatan, ay masasalamin sa mga resulta ng transplant. Bukod dito, ang paraan ng pag-transplant na ito ay nagbubukod sa trabaho sa mga malalaking ibabaw.

Transplantation keratinocyte suspension - ay makabuluhang mas magastos na paraan ay hindi nangangailangan ng isang mahabang culturing cells at simpleng sa kasalukuyan sagisag, contact gamit ang isterilisadong cambric preforms, ang mga sukat ng kung saan tumutugma sa ang halaga ng pagkakapilat. Backlog therapeutic epekto kapag transplanting ang cell suspensyon para sa tungkol sa isang buwan, kumpara sa IPC sa sugat dressing - hindi isang makabuluhang sandali kapag ang tagal ng paggamot na halaga sa maraming buwan. Ito ay kilala na sa panahon ng paglipat ng IPC upang magsunog ng mga pasyente, ang pagbabagong-anyo ng balat istraktura ng estado nang paunti-unti at para sa maraming mga taon. Ang paglipat ng kultura ng keratinocyte sa coverings ng sugat ay ang pinaka-maginhawa at maaasahang pamamaraan, gayunpaman, ito ay mas mahal din. Sa karagdagan, na nangangailangan ang search para sa araw na pinabuting variant coatings, na dapat ay sunud-sunuran, hygroscopic, mayroon bacteriostatic o bactericidal katangian at upang maging biologically neutral para sa mga cell. Ang film "Polipor" - isang intermediate na bersyon ng domestic film sugat coverage, sa kabila ng ilang mga pagkukulang, ay pinahintulutan kami na mag-aral pagtuklas keratinocyte transplantation daga sa scars at upang gumuhit ng mga konklusyon tungkol sa pagiging epektibo ng mga ito direksyon akit pagkakapilat.

Mga May-akda na ginanap ang transplant sa IPC sugat nasunog, mapapansin na sa panahon ng unang linggo pagkatapos ng paglipat ng multilayered reservoir keratinocytes sa sugat sanitized, ang epidermis thickens at nagsasapin-sapin. Ang lahat ng mga layer ng epidermis ay mahusay na tinukoy. Ito ay kagiliw-giliw na ang bilang ng mga layers ng cell sa mga transplant ay 10-30% na mas malaki kaysa sa mga biopsy na specimens ng balat. Ang mga may-akda ay nakilala ang hitsura ng granules ng keratogialin sa ika-5 araw pagkatapos ng paglipat ng MPA, ang basal lamad at hemidesmosomes - na nasa ikatlong araw.

J.Rives et al. (L994), Paramonov BA (1996); NM Kuznetsov et al. (1998) na natagpuan na sa panahon ng unang bahagi ng panahon mga sumusunod transplantation BMD pasyente na may polnosloynymi balat depekto matapos Burns, komunikasyon sa pagitan ng dermis at epidermis ay napaka-mahina at ito ay isang tuwid na linya, papilyari layer ay absent. Sa pamamagitan ng dulo ng ika-2 buwan ay nagsisimula sa pagbuo ng mababaw na papillae at balat appendages, komunikasyon dermis at epidermis ay nagiging mas malakas. Literature data govoryato transplant allogeneic keratinocytes para sa sugat burn pasyente bilang promising paraan. Sa kabila ng katotohanan na ang pagtanggi ng allogeneic keratinocytes nangyayari isinumite sa pamamagitan ng iba't-ibang mga may-akda sa panahon mula sa 10 araw sa 3 buwan, gayunpaman, mayroon sila ng isang papel sa healing ng sugat ibabaw, ilalabas ang paglago kadahilanan at nang wala sa loob hindi isinasara ang depekto. Ito ay pinaniniwalaan na MPAlK ay nabawasan antigenic aktibidad, pati na kapag may pinag-aralan sa vitro mawalan ng Langerhans cell na nagpapahintulot sa kanila na umiiral para sa isang mahabang oras sa katawan ng tatanggap. Sa karagdagan, allogeneic kulturang nagmula sa balat ng malusog na mga kabataan ay may mas higit na biological mga potensyal na kaysa sa autologous kultura ng mga pasyente pagkatapos ng trauma.

Ang pangunahing layunin ng aming pag-aaral ay upang malaman kung ang allogenic keratinocytes ay mabubuhay sa mga scars at kung ano ang mga pagbabago sa peklat tissue sa ilalim ng impluwensya ng naturang biologically aktibong "sugat patong". Sa kaso ng isang positibong resulta, gawin ang pinaka-epektibo at hindi bababa sa labor intensive na teknolohiya sa lugar na ito ng rehabilitation medicine.

Ang data na nakuha sa amin sa maraming aspeto ay naging pareho sa data ng panitikan sa mga pagbabago sa morphological na nagaganap sa epidermis ng tao matapos ang paglipat ng allogenic keratinocytes upang sumunog sa mga sugat. Ngunit may mga makabuluhang pagkakaiba, pareho sa mga tuntunin ng morphological substrate, na kung saan ay transplanted, at sa mga tuntunin ng teknolohiya. So. Pagbuo ng saligan lamad at balat-ukol sa balat Bonds (poludesmosom, papillae) nangyayari sa ibang pagkakataon kumpara sa paglipat ng mga keratinocytes sa sugat ibabaw nang walang pagkakapilat. Lumilitaw na ito ay dahil sa mahinang nutrisyon ng mga tisyu ng rumen kumpara sa mga dermis o kalamnan na fascia. Ang peklat, lalo na ang matanda, ay isang siksik na nag-uugnay na tisyu na may napakaliit na bilang ng mga sisidlan, sa ilalim ng sugat sa pagkasunog ay isang granulation tissue na mayaman sa mga vessel ng dugo. Kaya, malinaw na ang mga kondisyon kung saan ang paglipat at pag-ukit ng mga keratinocytes nangyari ay lubos na naiiba. Nang mas vascularized ang lugar ng paglipat ng mga cell, mas madali ito ay upang iproseso ang mga ito. Mula sa layuning ito ay may isang konklusyon tungkol sa kagustuhan para sa pagtatrabaho sa mga batang scars, kung saan ang nag-uugnay tissue ay pa rin malubay sapat at mayaman sa dugo vessels.

Bilang resulta ng gawaing pang-eksperimentong ito, pinatutunayan nito na:

1. Posible ang paglipat ng MALK sa mga scars. 
2. Ang pinakamainam na paraan ng paglipat ay ang transplantation ng keratinocytes sa cover ng sugat.
3. Ang ibabaw ng peklat ay dapat na lupa gamit ang isang operative dermabrasion gamit ang laser Schumann o isang pamutol.
4. Sa ilalim ng impluwensya ng MPALK, ang mabilis na epithelization ng ibabaw ng lupa ay nangyayari.
5. Ang mas mahusay na vascularized peklat tissue, iyon ay, ang mas bata ang peklat, ang mas mahusay ang mga resulta ng keratinocyte transplantation.
6. Ang peklat tissue sa ilalim ng impluwensya ng transplanted keratinocytes ay unti-unti na transformed at nagiging isang dermal-tulad ng (mas malabong peklat tissue na may appendages ng balat).
7. Ang unti-unting pag-loosening ng scar tissue ay nagsisimula sa subepidermal layer. Nagpapabuti ng vascularization nito, ang mga bundle ng fibers ng collagen sa itaas at mas mababang bahagi ng rumen ay kumukuha ng mas madaling pag-ihip ng lokasyon kaysa sa tisyu ng peklat na walang transplantasyon ng mga selula. May buhok follicles at sebaceous glands. Ang epidermis sa istraktura nito, pagkatapos na ipasa ang bahagi ng hypertrophy, ay papalapit sa epidermis ng normal na balat.
8. Ang sinusunod pagbabago ay may kaugnayan sa keratinocytes secreted paglago kadahilanan, cytokines na pagpapabuti trophism ng mga galos tissue mag-ambag sa pagbabagong-anyo nito mula sa isang matigas mahibla tissue sa isang looser, na kung saan ay humantong sa isang pagpapabuti ng peklat.

Sa gayon, batay sa pag-aaral na ito, maaari nating mapagtanto na ang kapaki-pakinabang na epekto ng mga transplanted keratinocytes sa scar tissue, na maaaring maging praktikal na kahalagahan para sa rehabilitasyon ng mga pasyente na may iba't ibang uri ng mga scars.

Ang gawaing ito sa mga daga ay pinahihintulutang magbalangkas ng mga kinakailangan. Upang ang coverings ng sugat, kung saan ang mga keratinocytes ay lumago.

Ang mga sugat na sugat ay dapat na:

• biocompatible sa mga cell,
• breathable,
• magkaroon ng isang nababanat, form-gusali base,
• maging hydrophilic,
• Ang mga nakapagpapagaling na additives ay naglalaman ng antibacterial na gamot at antioxidant ay hindi nakakalason sa mga selulang pinag-aralan.

Mga klinikal na resulta ng biotechnological na paggamot ng mga scars.

Mas maaga, N. Carver et al. (1993) natagpuan na ang occlusive dressings ay pinakamainam para sa paglakip sa sugat at kaligtasan ng mga keratinocytes, ngunit huwag pahintulutan ang pagbuo ng isang stratified (mature) epidermis. Upang bumuo ng nakagagaling na epidermis, kinakailangan ang isang kapaligiran sa himpapawid. Samakatuwid, pagkatapos ng paglakip sa multilayered layer, isang occlusive covering covering ang iminungkahing pagkatapos ng 7-10 upang alisin at magsagawa ng mga sugat sa ilalim ng dry bandages o nalulusaw na tubig ointments. Maaari naming sabihin na ang kalidad at katangian ng "substrate" na kung saan ang mga cell ay lumago ay napakahalaga para sa pagiging epektibo ng paglipat ng cellular na materyal, at dahil dito para sa mga resulta ng trabaho ng mga doktor. Ngunit ang ideal na sugat sarsa para sa araw na ito ay hindi, sa kabila ng kasaganaan ng ang ipinanukalang mga pagpipilian (artipisyal na katad, non-pinagtagpi tela ng carboxymethyl selulusa, fibrin Pintura, semi-natatagusan polyurethane pelikula). Ang hindi mahalaga na sandali sa bagay na ito ay ang halaga ng "substrates" (espesyal na sugat na sugat), dahil ang kanilang mataas na gastos ay nagdaragdag sa kabuuang halaga ng biotechnological treatment.

Ang pagiging epektibo ng mga cell na teknolohiya sa petsa pinatunayan, ngunit, sa kasamaang-palad, ang mga ito na teknolohiya ay napaka-mahal, lalo na sa mga bansa kung saan walang pang-industriya produksyon ng cellular komposisyon. Gayunman, ang mga bansa tulad ng sa Estados Unidos ay may mahabang itinatag industriya para sa produksyon ng cellular materyal para sa transplantation sinunog. Sa partikular, ang kumpanya BioSurface Technology Inc, dahil 1989, itinaas 37,000 laminated layer ng keratinocytes, na kung saan ay nai-ginagamit para sa paggamot ng 240 mga pasyente sa 79 bansa sa buong mundo (R.Odessey, 1992) na may 1 cm ² cell kultura gastos tungkol sa 7-8 $ US.

Ang teknolohiya ng pagpapagamot sa iba't ibang mga sakit at mga problema sa balat ay may maraming mga pagkakaiba, ngunit sa gitna ng anumang paggamot na may mga cell ay ang produksyon ng materyal sa kalidad ng cell at paglipat nito.

Ang prosesong ito ay binubuo ng mga sumusunod na hakbang:

• pagpili ng balat mula sa mga apektadong (o mula sa mga donor),
• transportasyon ng mga flaps sa balat sa biotechnology center,
• ang paghihiwalay ng mga selula ng basal layer at ang kanilang pagpaparami,
• build-up ng multilayered layers ng keratinocytes (IPC).
• paglipat ng mga kultura ng selula.

Ang pangunahing problema sa paggamot sa paglipat ng multilayered keratinocyte strata ay ang pangangailangan para sa mabubuhay na mga selula sa lahat ng mga yugto ng paglipat ng selula. Ang mga piraso ng balat para sa paghihiwalay ng mga autologous o allogeneic na mga selula ay dapat na maging manipis hangga't maaari, dahil sa kasong ito ay mas madali silang paghiwalayin ang paggamit ng mga mekanikal at enzymatic na mga pamamaraan at upang makakuha ng isang suspensyon ng mga cell ng buhay para sa paglago. Maaari silang makuha sa pamamagitan ng pagputol sa dermatome o paggamit ng balat ng eyelids, ang balat ng masama, ang panloob na ibabaw ng balikat. Given na ang mga cell ay sensitibo sa halogens (kloro, yodo), hydrogen peroxide, hindi nila maaaring gamitin sa paggamot ng balat sa oras ng pagkuha ng materyal.

Ang dami at husay na ani ng mga selula mula sa balat ng grafts at ang pagiging epektibo ng kanilang paglilinang ay nakasalalay din sa kalagayan ng kalusugan at edad ng donor. Bilang karagdagan, ang mga biopsy na specimen ay dapat maihatid sa laboratoryo sa lalong madaling panahon at sa mga angkop na kondisyon (kapaligiran, temperatura) na ibinigay sa isang sertipikadong at accredited laboratoryo.

Daluyan o daluyan ng Eagle sa pamamagitan ng pagdaragdag ng 10% ng serum ng baka, ang daluyan ng DMEM na may kasamang 5% fetal bovine serum at antibiotics ay maaaring magamit upang mag-imbak at magdala ng mga flap ng balat.

Sa cytological laboratory dermal byopsya ay unang nang wala sa loob pinaghihiwalay sa maliliit na piraso, na sinusundan ng paggamot ng mga piraso ng balat gamit enzymes: trypsin, collagenase, dispase, at iba pa.

Sa ilalim ng pagkilos ng mga enzymes, ang pagkawasak ng desmosomes ay nagaganap at ang mga keratinocytes ay inilabas sa daluyan bilang hiwalay na mga selula o mga aggregate na binubuo ng iba't ibang mga bilang ng mga selula. Para sa kultura, ang mga basal keratinocytes lamang ang ginagamit na lumalaki sa espesyal na media sa mga incubator na naglalaman ng 5% CO., Sa mga piling petri o sa mga vial sa t = 37 ° C. Sa loob ng 48 oras, ang pagbubuo ng mga kolonya ng keratinocyte ay sinusunod, na unti-unting nagtatagpo sa isang monolayer. Matapos makuha ang sapat na bilang ng mga selula, ang nagresultang suspensyon ay kumakalat sa mga sugat sa sugat na inihanda para sa layuning ito at inilagay sa mga pinggan ng Petri. Mula sa suspensyon, unang isang monolayer at pagkatapos ay isang multilayered layer ng keratinocytes ay nabuo. Sa panimula, ang mga yugto ng proseso ng paglilinang ng keratinocyte ay ipinapakita sa Lar. 12 (33.43.54.65).

Ang pagbuo ng multilayer keratinocyte formation na angkop para sa paglipat ay karaniwang tumatagal ng 7-10 araw. Minsan ang panahong ito ay mas mahaba, na depende sa kalidad ng pinagmulang materyal (edad, kalusugan ng donor, katumpakan ng materyal, kalidad ng media na ginamit, atbp.). Kung ang multilayered layer ay sumobra, pagkatapos ay sa ibabaw nito ay maaaring may mga cell na may apoptosis phenomena na hindi angkop para sa transplantation. Ang mga pinggan ng Petri, na lumaki sa kanila sa coverings ng sugat sa pamamagitan ng multilayered layers ng keratinocytes (IPC), ay ibinibigay sa klinika sa mga espesyal na lalagyan sa isang temperatura na hindi mas mababa sa + 15 ° C.

Ang binagong pamamaraan ng Green para sa pagpapalaki ng IPC

Sa aming trabaho bilang isang patong ng sugat, gumamit kami ng isang multi-layered cambric, na iniiwan ang mga polypore film na kung saan nagsimula kaming magtrabaho sa isang eksperimento sa mga daga. Kaya, ang multilayered keratinocyte strata ay lumaki sa amin sa prefat at sterile batiste, bagaman hindi rin ito ang pinakamainam na takip sa sugat.

Ang mga klinikal na pag-aaral ay isinasagawa sa mga boluntaryo na may pagtalima sa mga kinakailangang kaugalian ng etika: pagpirma ng kasunduan at kaalamang pahintulot.

1. Ang kultura ng sariling (autologous) at kinuha mula sa mga cell ng bangko (allogenic) keratinocytes ay inilapat.
2. Ang mga sariling keratinocytes ay nakuha mula sa isang piraso ng pagputol ng balat mula sa loob ng balikat ng mga pasyente.
3. Ang operasyon ng dermabrasion ng scars ay natupad sa tulong ng thermocoupling, umiinog disks at erbium laser.
4. Ang mga grupo ng mga pasyente na may mga normotropiko, hypotropic at hypertrophic scars ay kinuha.

Ang teknolohikal na proseso para sa aplikasyon ng cellular technology upang mapabuti ang uri ng scars ng balat ay binubuo ng mga sumusunod na yugto:

1. Pagpipili ng mga pasyente.
2. Ipaliwanag ang kakanyahan ng paggamot, ang tiyempo ng pagkuha ng inaasahang mga resulta, ang pag-sign ng isang kasunduan at alam na pahintulot.
3. Paghirang ng mga pasyente para sa 2-3 linggo bago ang operasyon selmevit para sa 1t. 3 beses sa isang araw, zinkteral sa 1t. 3 beses sa isang araw.
4. Ang pagkuha ng isang piraso ng balat ay 2.0 cm ang haba at 0.7-1.0 ang lapad mula sa panloob na ibabaw ng balikat, mataas, halos sa ilalim ng axillary region, upang makakuha ng autologous keratinocytes.
5. Sa kaso ng mga pasyenteng tinatanggihan na ihiwalay ang kanilang sariling mga keratinocytes dahil sa posibilidad ng pagkuha ng isang linear na peklat sa panloob na ibabaw ng balikat, ang cellular na materyal ay kinuha mula sa isang cell bank (allogenic keratinocytes).
6. Ang mga Keratinocytes ay nakahiwalay at lumaki sa mga kondisyon ng isang laboratoryo na sertipikado para sa ganitong uri ng trabaho.
7. Matapos matanggap ang isang IPC sapat para sa paglipat, isang araw ng operasyon ay ibinibigay sa mga scars sa klinika, kung saan ang materyal ay dinala sa mga espesyal na lalagyan sa mga pagkain ng petri.
8. Ang pagpapatakbo ng dermabrasion ng rumen, haemostasis ay natupad, ang ibabaw ng lupa ay hugasan ng sterile na solusyon ng asin, pinatuyong, pagkatapos na inilipat ang IPC sa sterile batiste na "mga cell down". Iyon ay, ang mga selula na nasa taas sa MIC ay mas mababa, katabi ng pinakintab na ibabaw.
9. Ang isang sterile film ay superimposed sa itaas, na kung saan ay naayos na sa balat na may isang nababanat bendahe o Omnifix nababanat band-aid. Sa halip na ang pelikula, ang mga sugat na walang malasakit na sugat na naglalaman ng silicone, halimbawa, Mepitel, Mepiform, silicone gel plates, ay maaari ding gamitin.

Pagkatapos ng 5-7 araw, ang film o silicone coating ay aalisin. Sa panahong ito, ang lahat ng mga keratinocytes ay kailangang mag-crawl papunta sa pinakintab na peklat at mag-attach sa ibabaw nito.

10. Ang basa na kapaligiran na nilikha sa ilalim ng film at silicone coating ay aktibong nag-aambag dito. Ang bautista na natitira sa peklat mula sa puntong ito ay maaaring pinapagbinhi ng curiose o chitosan gel. Bilang isang resulta, sa ika-2 araw, ang isang siksikan na crust ay nilikha, kung saan, para sa kaginhawahan ng pasyente, mas mahusay na ayusin sa isang nababanat, air-permeable plaster, halimbawa Omnifix. Ang breathable crust ay nagpapahintulot sa bagong nabuo na epidermis upang makilala at maging isang mature.

Depende sa uri ng peklat at ang lalim ng paggiling, ang pagbibihis ay tinanggihan pagkatapos ng 8-10 araw. Ang epidermis sa oras na ito ay may 30-40% na mas maraming cellular layers kaysa sa normal na balat. Ang basal lamad ay hindi nabuo. Ang mga keratinocytes ng thickened epidermis ay naglalabas ng mass ng biologically active molecules sa scar tissue.

Ang tagumpay ng biotechnological na paggamot ng mga scars ay higit sa lahat ay depende sa paraan ng pangangalaga sa kanila sa panahon ng operasyon. Ang mga kultura ng selula ay isang "malambot" na uri ng takip ng sugat at sa maagang mga panahon pagkatapos ng paglipat, ang BMD ay madaling nakahiwalay sa mga pinagbabatayan ng mga tisyu. Samakatuwid, ang mga pasyente ay pinapayuhan na pangalagaan ang mga peklat pagkatapos ng operasyon. Para sa 8-9 na buwan, huwag kuskusin at madaling magtrabaho kasama ang malamig na pinakuluang tubig upang maiwasan ang pagputol ng isang manipis, bagong nilikha na epidermis na walang mahigpit na mahigpit na pagkakahawak sa mga pinagbabatayan na tisyu.

Tandaan:

Bago surgery at sa panahon ng dermabrasion paggamit ng halogenated oxidants at preservatives (yodopiron, sulyodopiron, iodinol, yodinat, chlorhexidine, hydrogen peroxide) ay pinapayagan bago transplanting kletok- ganap na kontraindikado dahil sa kanilang mga cytotoxic epekto. Ang nakakalason sa mga selula ay methylene blue. Makikinang na berde.

Upang maiwasan ang impeksiyon, lalo na kapag nagtatrabaho sa hypertrophic scars, posible na gamutin ang operating field na may neomycin sulfate, polymyxin o gentamicin. Hindi sila nagsasagawa ng isang cytotoxic effect sa keratinocytes.

Bilang resulta ng paggamot na ito, nakakamit ang triple effect.

1. Alignment ng ibabaw ng rumen.
2. Lumikha ng isang layer sa itaas nito ng isang bagong epidermis, normal na kapal.
3. Conversion ng mga galos tissue sa dermopodobnuyu pamamagitan ng pagkilos ng cytokines, paglago kadahilanan at iba pang mga bioactive molecules secreted sa pamamagitan ng transplanted cell at keratinocytes stimulated sa pamamagitan ng mga ito, fibroblasts at macrophages.

Ang peklat ay nagiging hindi gaanong kapansin-pansin, mas nababanat, lumilitaw ang mga pores dito, buhok na puff, maaaring maibalik ang pigmentation dahil sa pagkakaroon ng mga melanocytes sa MPC.

Gayunpaman, ang lahat ng mga positibong sandali sa cicatrix ay hindi kaagad dumating. Sa pagsasaalang-alang na ito, kinakailangan upang balaan ang mga pasyente. Na ang proseso ng pagbabagong-anyo ng peklat tissue sa dermis ay mabagal at ang pinakamainam na resulta ng naturang paggamot ay maaaring inaasahan na hindi mas maaga kaysa sa 10-14 na buwan. Kaagad pagkatapos matanggihan ang sarsa, ang makinis na ibabaw ay may binibigkas na polychrome, mas maliwanag ang proseso ng paggiling. Ang hindi bababa sa pinsala sa balat ay nangyayari kapag nakakagiling ang normotrophic scars na may erbium laser. Ang kulay ng mga scars at nakapaligid na balat ay naibalik sa panahon mula 3 hanggang 8 na linggo. Sa kabila ng naturang mga pag-iingat, kung minsan may postoperative hyperpigmentation, na maaaring mag-isa nang nakapag-iisa sa loob ng ilang buwan.

[1], [2], [3], [4], [5], [6], [7], [8], [9], [10], [11]