Mesenchymal stem cell

Sa mga rehiyonal na stem cell, ang isang espesyal na lugar ay inookupahan ng mesenchymal stem cells (MSCs), ang mga derivatives na bumubuo sa stromal matrix ng lahat ng mga organo at tisyu ng katawan ng tao. Ang priyoridad sa pananaliksik ng MSC ay kabilang sa mga kinatawan ng Russian biological science.

Sa kalagitnaan ng huling siglo, ang isang homogenous na kultura ng multipotent stromal stem cells ng bone marrow ay nahiwalay sa unang pagkakataon sa laboratoryo ng A. Friedenstein. Ang mga mesenchymal stem cell na nakakabit sa substrate ay nagpapanatili ng mataas na intensity ng paglaganap sa loob ng mahabang panahon, at sa mga kultura na may mababang density ng seeding pagkatapos ng pag-aayos sa substrate ay nabuo nila ang mga clone ng mga cell na tulad ng fibroblast na walang aktibidad na phagocytic. Ang pagtigil ng paglaganap ng MSC ay natapos sa kanilang kusang pagkita ng kaibahan sa vitro sa mga selula ng buto, taba, kartilago, kalamnan o nag-uugnay na tisyu. Ang mga karagdagang pag-aaral ay naging posible upang maitaguyod ang osteogenic na potensyal ng fibroblast-like na mga cell ng bone marrow stroma ng iba't ibang mammalian species, pati na rin ang kanilang aktibidad na bumubuo ng kolonya. Ipinakita ng mga eksperimento sa vivo na ang parehong hetero- at orthotopic na paglipat ng mga colony-forming fibroblast-like cells ay nagreresulta sa pagbuo ng buto, cartilage, fibrous at adipose tissue. Dahil ang bone marrow stromal stem cell ay nailalarawan sa pamamagitan ng isang mataas na kapasidad para sa self-renewal at multifaceted differentiation sa loob ng iisang cell line, ang mga ito ay tinatawag na multipotent mesenchymal progenitor cells.

Dapat tandaan na higit sa 45 taon ng pangunahing pananaliksik sa mesenchymal stem cell, ang mga tunay na kondisyon ay nilikha para sa paggamit ng kanilang mga derivatives sa klinikal na kasanayan.

Ngayon ay walang alinlangan na ang lahat ng mga tisyu ng katawan ng tao ay nabuo mula sa mga stem cell ng iba't ibang mga linya ng cell bilang resulta ng mga proseso ng paglaganap, paglipat, pagkita ng kaibhan at pagkahinog. Gayunpaman, hanggang kamakailan ay pinaniniwalaan na ang mga stem cell sa isang pang-adultong organismo ay tiyak sa tisyu, ibig sabihin, may kakayahang gumawa ng mga linya ng mga espesyal na selula lamang ng mga tisyu kung saan sila matatagpuan. Ang konseptong posisyon na ito ay pinabulaanan ng mga katotohanan ng pagbabago ng mga hematopoietic stem cell hindi lamang sa mga cellular na elemento ng peripheral na dugo, kundi pati na rin sa mga oval na selula ng atay. Bilang karagdagan, ang mga neural stem cell ay naging may kakayahang magbunga ng parehong mga neuron at glial elemento, pati na rin ang mga maagang nakatuon na linya ng mga hematopoietic progenitor cells. Kaugnay nito, ang mga mesenchymal stem cell, na kadalasang gumagawa ng mga cellular na elemento ng buto, cartilage at adipose tissue, ay may kakayahang mag-transform sa neural stem cells. Ipinapalagay na sa proseso ng paglago, physiological at reparative tissue regeneration, ang mga uncommitted progenitor cells ay nabuo mula sa tissue-non-specific stem reserves. Halimbawa, ang reparasyon ng tissue ng kalamnan ay maaaring maisakatuparan dahil sa mga mesenchymal stem cell na lumilipat mula sa bone marrow patungo sa mga skeletal na kalamnan.

Kahit na ang gayong cross-interchangeability ng mga stem cell ay hindi kinikilala ng lahat ng mga mananaliksik, ang posibilidad ng klinikal na paggamit ng mga mesenchymal stem cell bilang isang mapagkukunan para sa paglipat ng cell at isang cellular vector ng genetic na impormasyon ay hindi na pinagtatalunan ng sinuman, pati na rin ang multipotency ng bone marrow stromal stem cell, na maaaring medyo madaling ihiwalay at mapalawak sa vitro culture. Kasabay nito, ang mga ulat sa potensyal na pluripotency ng bone marrow stromal stem cell ay patuloy na lumilitaw sa siyentipikong panitikan. Bilang katibayan, ang mga protocol ng pananaliksik ay binanggit kung saan, sa ilalim ng impluwensya ng mga tiyak na transdifferentiation inducers, ang mga MSC ay binago sa mga nerve cell, cardiomyocytes at hepatocytes. Gayunpaman, ang ilang mga siyentipiko ay may malubhang pagdududa tungkol sa posibilidad ng paulit-ulit na pag-activate at pagpapahayag ng mga gene mula sa panahon ng maagang embryogenesis. Kasabay nito, nauunawaan ng lahat na kung ang mga kondisyon ay matatagpuan para sa pagpapalawak ng multipotency ng mesenchymal stem cell sa pluripotency ng ESCs, maraming etikal, moral, relihiyon at legal na mga problema sa regenerative plastic medicine ay awtomatikong malulutas. Bilang karagdagan, dahil sa kasong ito ang pinagmumulan ng regenerative stem potential ay nagiging autologous stromal cells ng pasyente, ang problema ng immune rejection ng cell transplant ay malulutas din. Ang malapit na hinaharap ay magpapakita kung gaano makatotohanan ang mga prospect na ito.

[ 1 ], [ 2 ]

Paggamit ng mesenchymal stem cell sa gamot

Sa klinika, ang paggamit ng mesenchymal stem cell derivatives ay pangunahing nauugnay sa pagpapanumbalik ng mga depekto sa tissue na nangyayari na may malawak at malalim na thermal lesyon sa balat. Sa preclinical stage, isang eksperimental na pagtatasa ng pagiging posible ng paggamit ng allogeneic fibroblast-like mesenchymal stem cell upang gamutin ang malalalim na paso ay isinagawa. Ipinakita na ang bone marrow fibroblast-like mesenchymal stem cells ay bumubuo ng isang monolayer sa kultura, na ginagawang posible na i-transplant ang mga ito upang ma-optimize ang mga proseso ng pagbabagong-buhay ng malalim na mga sugat sa paso. Napansin ng mga may-akda na ang mga embryonic fibroblast ay may katulad na pag-aari, ngunit ang kanilang klinikal na paggamit ay limitado sa pamamagitan ng umiiral na mga problema sa etika at legal. Ang isang malalim na thermal burn na may pinsala sa lahat ng mga layer ng balat ay ginawa sa mga daga ng Wistar. Ang lugar ng paso ay 18-20% ng kabuuang ibabaw ng balat. Kasama sa unang grupong pang-eksperimento ang mga daga na may malalim na thermal burn at paglipat ng allogeneic fibroblast-like mesenchymal stem cells. Ang pangalawang pangkat ay binubuo ng mga hayop na may malalim na thermal burn at paglipat ng mga allogeneic embryonic fibroblast. Ang ikatlong grupo ay kinakatawan ng mga control rats na may malalim na thermal burn na hindi sumailalim sa cell therapy. Ang isang suspensyon ng fibroblast-like mesenchymal stem cells at embryonic fibroblast ay inilapat sa ibabaw ng paso gamit ang isang pipette sa halagang 2 x 10 ⁴mga cell sa ika-2 araw pagkatapos ng pagmomodelo ng paso at pagtanggal ng nagresultang necrotic scab. Pagkatapos ng cell transplantation, ang ibabaw ng paso ay natatakpan ng gauze napkin na binasa ng isotonic sodium chloride solution na may gentamicin. Ang mga selula ng utak ng buto ay nakolekta upang makakuha ng mga MSC kasama ang kanilang kasunod na induction sa isang linya ng fibroblast-like mesenchymal stem cells mula sa mga adult Wistar rats mula sa femurs. Ang mga embryonic fibroblast ay nakuha mula sa mga baga ng 14-17-araw na mga embryo. Ang mga embryonic fibroblast at bone marrow cell para sa pagkuha ng mga MSC ay preliminarily na nilinang sa Petri dishes sa temperatura na 37°C sa isang CO2 incubator, sa isang kapaligiran na may 5% CO2 sa 95% na kahalumigmigan. Ang mga embryonic fibroblast ay nilinang sa loob ng 4-6 na araw, habang ang pagbuo ng isang monolayer ng MSC ay kinakailangan mula 14 hanggang 17 araw. Kasunod nito, ang mga MSC ay cryopreserved bilang mapagkukunan ng materyal para sa fibroblast-like mesenchymal stem cells, na nakuha sa pamamagitan ng pag-defrost at pag-culture ng mga MSC sa loob ng 4 na araw. Ang bilang ng mga fibroblast-like mesenchymal stem cell na nabuo ay higit sa 3 beses na mas mataas kaysa sa bilang ng mga embryonic fibroblast na nabuo sa parehong panahon ng paglilinang. Upang matukoy ang mga inilipat na selula sa mga sugat sa paso sa yugto ng paglilinang, ang kanilang genome ay nilagyan ng label gamit ang isang viral shuttle vector batay sa recombinant adenovirus type V na nagdadala ng 1ac-2 gene encoding E. coli ß-galactosidase. Ang mga live na cell sa iba't ibang oras pagkatapos ng paglipat ay nakitang immunohistochemically sa cryosections kasama ang pagdaragdag ng X-Gal substrate, na nagbibigay ng isang katangian na asul-berdeng mantsa. Bilang resulta ng dynamic na visual, planimetric at histological na pagtatasa ng kondisyon ng sugat sa paso, itinatag na sa ika-3 araw pagkatapos ng paglipat ng cell, ang mga makabuluhang pagkakaiba sa kurso ng proseso ng sugat ay lilitaw sa mga napiling grupo. Ang pagkakaibang ito ay naging partikular na naiiba sa ika-7 araw pagkatapos ng paglipat ng cell. Sa mga hayop ng unang pangkat, kung saan inilipat ang mga mesenchymal stem cell na tulad ng fibroblast, ang sugat ay nakakuha ng pantay na matinding kulay rosas, ang granulation tissue ay lumaki sa buong lugar nito sa antas ng epidermis, at ang ibabaw ng paso ay makabuluhang nabawasan ang laki. Ang collagen film na nabuo sa ibabaw ng sugat ay naging medyo manipis, ngunit patuloy itong sumasakop sa buong lugar ng paso. Sa mga hayop ng pangalawang pangkat, kung saan inilipat ang mga embryonic fibroblast, ang granulation tissue ay tumaas sa antas ng epidermis ng mga gilid ng sugat, ngunit sa mga lugar lamang, habang ang plasmorrhea mula sa sugat ay mas matindi kaysa sa 1st group, at ang paunang nabuo na collagen film ay halos nawala. Sa mga hayop na hindi nakatanggap ng cell therapy, sa ika-7 araw ang paso ay maputla, may pitted, necrotic tissue na natatakpan ng fibrin. Ang Plasmorea ay nabanggit sa buong ibabaw ng paso. Sa kasaysayan, ang mga hayop ng 1st at 2nd group ay nagpakita ng pagbaba sa cellular infiltration at pag-unlad ng vascular network,at ang mga palatandaang ito ng nagsisimulang proseso ng pagbabagong-buhay ay mas malinaw sa mga daga ng 1st group. Sa control group, ang mga palatandaan ng cellular infiltration ng sugat ay sinusunod, ang histological pattern ng mga bagong nabuo na mga sisidlan ay wala. Sa ika-15-30 araw ng pagmamasid, ang lugar ng paso sa ibabaw ng mga hayop ng 1st group ay makabuluhang mas maliit kaysa sa mga daga ng iba pang mga grupo, at ang granulating surface ay mas binuo. Sa mga hayop ng ika-2 pangkat, ang lugar ng ibabaw ng paso ay nabawasan din kumpara sa laki ng mga sugat sa paso sa mga daga ng control group, na naganap dahil sa marginal epithelialization. Sa control group, ang ibabaw ng paso ay nanatiling maputla sa mga lugar na may mga bihirang granulation, ang mga vascular asterisk ay lumitaw dito, may mga islet ng fibrinous plaque, ang katamtamang plasmorrhea ay nagpatuloy sa buong ibabaw ng paso, at isang scab na mahirap paghiwalayin ay nanatili sa ilang mga lugar. Sa pangkalahatan, sa mga hayop ng ika-3 pangkat, ang laki ng sugat ay nabawasan din, ngunit ang mga gilid ng sugat ay nanatiling nasira.

Kaya, sa panahon ng isang paghahambing na pag-aaral ng rate ng paggaling ng sugat gamit ang fibroblast-like mesenchymal stem cells at embryonic fibroblasts, pati na rin nang walang paggamit ng cell therapy, ang isang acceleration ng rate ng healing ng burn surface ay nabanggit bilang resulta ng paglipat ng fibroblast-like mesenchymal stem cells at embryonic fibroblasts. Gayunpaman, sa kaso ng paggamit ng allogeneic fibroblast-like mesenchymal stem cells, ang rate ng paggaling ng sugat ay mas mataas kaysa sa paglipat ng mga embryonic fibroblast. Ito ay ipinahayag sa pagpabilis ng pagbabago ng mga yugto ng proseso ng pagbabagong-buhay - ang mga tuntunin ng cellular infiltration ay nabawasan, ang rate ng paglago ng vascular network ay tumaas, pati na rin ang pagbuo ng granulation tissue.

Ang mga resulta ng dynamic na planimetry ay nagpapahiwatig na ang rate ng kusang paggaling ng sugat na paso (nang walang paggamit ng cell therapy) ay ang pinakamababa. Sa ika-15 at ika-30 araw pagkatapos ng paglipat ng allogeneic fibroblast-like mesenchymal stem cells, ang rate ng paggaling ng sugat ay mas mataas kaysa sa paglipat ng mga embryonic fibroblast. Ang histochemical method para sa pag-detect ng beta-galactosidase ay nagpakita na pagkatapos ng transplantation ng fibroblast-like mesenchymal stem cells at embryonic fibroblasts, ang mga transplanted cells ay nananatiling mabubuhay sa ibabaw at sa lalim ng regenerating na mga sugat sa buong panahon ng pagmamasid. Naniniwala ang mga may-akda na ang mas mataas na rate ng pagbabagong-buhay ng sugat sa paso sa paggamit ng mga mesenchymal stem cell na tulad ng fibroblast ay dahil sa pagpapalabas ng mga biologically active growth-stimulating factor ng mga cell na ito sa panahon ng proseso ng pagkahinog.

Ang paglipat ng mga auto- o allogeneic keratinocytes at allogeneic fibroblast para sa paggamot ng mga sugat sa paso ay ginamit din sa klinikal na kasanayan. Dapat pansinin na ang kirurhiko paggamot ng mga bata na may malawak na malalim na paso ay isang kumplikadong gawain dahil sa mataas na traumatikong kalikasan at maramihang mga interbensyon sa kirurhiko, makabuluhang pagkawala ng dugo, at iba't ibang mga reaksyon sa infusion media na ginamit. Ang mga pangunahing kahirapan sa pagsasagawa ng mga plastic surgery sa balat para sa malawak na malalalim na paso, na may lawak na lampas sa 40% ng ibabaw ng katawan, ay dahil sa kalubhaan ng kalagayan ng mga biktima at kakulangan ng mga mapagkukunan ng balat ng donor. Ang paggamit ng mga transplant na mesh na may mataas na koepisyent ng pagbubutas ay hindi malulutas ang problema, dahil ang mga cell na nabuo pagkatapos ng pagbubutas ay nag-epithelialize nang napakabagal, at ang balat ay madalas na nagli-lyse o natuyo. Ang mga panakip ng mga sugat na paso gaya ng xenoskin, cadaveric allografts, synthetic film coverings ay hindi palaging sapat na epektibo, samakatuwid ang mga bagong paraan ng pagtakip sa mga ibabaw ng paso na may mga layer ng kulturang keratinocytes at fibroblast ay binuo. Sa partikular, ang isang paraan ng pagtakip sa mga ibabaw ng paso sa tulong ng mga kulturang allofibroblast ay iminungkahi, na, kapag inilipat, ay may binibigkas na stimulating effect sa paglaganap ng mga epidermocytes na napanatili sa sugat sa borderline burns, pati na rin ang mga keratinocytes sa septa ng mesh transplants. Ang gawain ni L. Budkevich at mga kapwa may-akda (2000) ay nagpapakita ng mga resulta ng paggamit ng pamamaraang ito para sa pagpapagamot ng mga paso sa mga bata. Kasama sa pag-aaral ang 31 bata na may thermal trauma na may edad mula 1 taon hanggang 14 na taon. Sa tatlong bata, ang kabuuang lugar ng mga sugat sa paso ng mga grado IIIA-B - IV ay 40%, sa 25 - 50-70%, sa isa pang tatlo - 71-85% ng ibabaw ng katawan. Ang maagang surgical necrectomy ay pinagsama sa paglipat ng mga kulturang allofibroblast at autodermoplasty. Ang unang yugto ng paggamot ay nagsasangkot ng pag-alis ng mga necrotic tissue, ang pangalawang yugto ay nagsasangkot ng paglipat ng mga kulturang allofibroblast sa mga pelikula ng carrier, at ang ikatlong yugto (48 oras pagkatapos ng paglipat ng mga kulturang allofibroblast) ay nagsasangkot ng pag-alis ng matrix at autodermoplasty na may mga flap ng balat na may perforation ratio na 1:4. Tatlong pasyente na na-admit sa klinika na may malubhang sakit sa paso ay may mga kulturang allofibroblast na inilipat sa mga butil na sugat. Ang paglipat ng mga kulturang allofibroblast ay isinagawa isang beses sa 18 bata, dalawang beses sa 11 bata, at tatlong beses sa dalawang pasyente. Ang lugar ng ibabaw ng sugat na natatakpan ng cell culture ay mula 30 hanggang 3500 cm2. Ang pagiging epektibo ng mga kulturang allofibroblast ay nasuri ng kabuuang porsyento ng skin graft engraftment, mga oras ng pagpapagaling ng paso, at ang bilang ng mga nasawi mula sa matinding thermal trauma. Nakumpleto ang graft engraftment sa 86% ng mga pasyente. Ang bahagyang di-engraftment ng mga skin grafts ay nabanggit sa 14% ng mga kaso. Sa kabila ng paggamot, anim (19.3%) na bata ang namatay. Ang kabuuang lugar ng pinsala sa balat sa kanila ay mula 40 hanggang 70% ng ibabaw ng katawan.Ang paglipat ng mga kulturang allofibroblast ay hindi nauugnay sa dami ng namamatay sa pinsala sa paso sa sinumang pasyente.

Sa pagsusuri sa mga resulta ng paggamot, napapansin ng mga may-akda na ang dating malalim na thermal na pinsala sa balat na sumasaklaw sa 35-40% ng ibabaw ng katawan ay itinuturing na hindi tugma sa buhay (para sa mas bata - hanggang 3 taong gulang - ang malalim na pagkasunog na sumasaklaw sa 30% ng ibabaw ng katawan ay kritikal, para sa mas matatandang mga bata - higit sa 40% ng ibabaw ng katawan). Kapag nagsasagawa ng surgical necrectomy na may paglipat ng mga kulturang allofibroblast at kasunod na autodermoplasty na may mga flap ng balat na may mataas na koepisyent ng pagbubutas, ang IIIB - IV degree burn ay nananatiling kritikal, ngunit sa kasalukuyan ay may mga prospect para sa pag-save ng buhay ng kahit na mga biktima sa maraming mga kaso. Ang surgical necrectomy kasabay ng paglipat ng mga kulturang allofibroblast at autodermoplasty sa mga batang may malalim na paso ay napatunayang epektibo lalo na sa mga pasyente na may malawak na mga sugat sa balat na may kakulangan ng mga donor site. Ang mga aktibong taktika sa operasyon at paglipat ng mga kulturang allofibroblast ay nag-aambag sa mabilis na pag-stabilize ng pangkalahatang kondisyon ng naturang mga pasyente, isang pagbawas sa bilang ng mga nakakahawang komplikasyon ng sakit sa paso, ang paglikha ng mga kanais-nais na kondisyon para sa pag-engraftment ng mga transplant, isang pagbawas sa oras ng pagpapanumbalik ng nawala na balat at ang tagal ng paggamot sa inpatient, isang pagbawas sa dalas ng matinding pagkasunog. Kaya, ang paglipat ng mga kulturang allofibroblast na may kasunod na autodermoplasty na may mga flap ng balat ay nagbibigay-daan para sa pagbawi sa mga bata na may malubhang pagkasunog, na dating itinuturing na tiyak na mapapahamak.

Karaniwang tinatanggap na ang pangunahing layunin ng paggamot sa sakit sa paso ay ang pinakakumpleto at mabilis na pagpapanumbalik ng nasirang balat upang maiwasan ang mga nakakalason na epekto, mga nakakahawang komplikasyon at dehydration. Ang mga resulta ng paggamit ng mga kulturang selula ay higit na nakasalalay sa kahandaan ng paso mismong sugat para sa paglipat. Sa mga kaso ng paglipat ng mga kulturang keratinocytes papunta sa ibabaw ng sugat pagkatapos ng surgical necrectomy, isang average ng 55% (ayon sa lugar) ng mga transplanted cell engraft, samantalang sa granulating na mga sugat ang engraftment rate ay bumababa sa 15%. Samakatuwid, ang matagumpay na paggamot ng malawak na malalim na paso sa balat ay nangangailangan, una sa lahat, mga aktibong taktika sa operasyon. Sa pagkakaroon ng mga sugat sa paso ng IIIB-IV degree, ang ibabaw ng paso ay agad na napalaya mula sa necrotic tissue upang mabawasan ang pagkalasing at mabawasan ang bilang ng mga komplikasyon ng sakit sa paso. Ang paggamit ng gayong mga taktika ay ang susi sa pagbawas ng oras mula sa sandali ng pagtanggap ng paso hanggang sa magsara ang mga sugat at ang haba ng pananatili ng mga pasyenteng may malawak na paso sa ospital, at makabuluhang bawasan din ang bilang ng mga nakamamatay na kinalabasan.

Ang mga unang ulat ng matagumpay na paggamit ng mga kulturang keratinocytes upang takpan ang mga ibabaw ng paso ay lumitaw noong unang bahagi ng 1980s. Kasunod nito, ang pagmamanipula na ito ay isinagawa gamit ang mga layer ng kulturang keratinocytes, kadalasang nakuha mula sa mga autocell, mas madalas mula sa allokeratinocytes. Gayunpaman, ang teknolohiya ng autokeratinocytoplasty ay hindi nagpapahintulot para sa paglikha ng isang cell bank, habang ang oras na kinakailangan upang makagawa ng isang keratinocyte transplant ng sapat na lugar ay mahaba at umaabot sa 3-4 na linggo. Sa panahong ito, ang panganib na magkaroon ng nakakahawa at iba pang mga komplikasyon ng sakit sa paso ay tumataas nang husto, na makabuluhang nagpapahaba sa kabuuang oras ng pananatili ng mga pasyente sa ospital. Bilang karagdagan, ang mga autokeratinocyte ay halos hindi nag-ugat kapag inilipat sa granulating burn wounds, at ang mataas na halaga ng espesyal na growth media at biologically active stimulators ng keratinocyte growth ay makabuluhang nililimitahan ang kanilang klinikal na paggamit. Ang iba pang mga biotechnological na pamamaraan, tulad ng collagenoplasty, paglipat ng cryopreserved xenoskin, at ang paggamit ng iba't ibang biopolymer coatings ay nagpapataas ng bisa ng paggamot sa malawak na mababaw, ngunit hindi malalim na pagkasunog. Ang paraan ng pagtakip sa ibabaw ng sugat na may mga kulturang fibroblast ay sa panimula ay naiiba dahil ang mga fibroblast, sa halip na mga keratinocytes, ay ginagamit bilang pangunahing bahagi ng kulturang layer ng cell.

Ang paunang kinakailangan para sa pagbuo ng pamamaraan ay ang data na ang mga pericyte na nakapalibot sa maliliit na sisidlan ay mga progenitor mesenchymal cells na may kakayahang mag-transform sa mga fibroblast na gumagawa ng maraming mga kadahilanan ng paglago at tinitiyak ang paggaling ng sugat dahil sa isang malakas na nakapagpapasigla na epekto sa paglaganap at pagdirikit ng mga keratinocytes. Ang paggamit ng mga kulturang fibroblast upang isara ang mga ibabaw ng sugat ay agad na nagsiwalat ng isang bilang ng mga makabuluhang pakinabang ng pamamaraang ito kumpara sa paggamit ng mga kulturang keratinocytes. Sa partikular, ang pagkuha ng fibroblast sa kultura ay hindi nangangailangan ng paggamit ng mga espesyal na nutrient media at growth stimulants, na binabawasan ang gastos ng transplant ng higit sa 10 beses kumpara sa halaga ng pagkuha ng keratinocytes. Ang mga fibroblast ay madaling ma-passivated, kung saan bahagyang nawawala ang mga antigen ng histocompatibility sa ibabaw, na nagbubukas naman ng posibilidad ng paggamit ng mga allogeneic cell para sa paggawa ng mga transplant at ang paglikha ng kanilang mga bangko. Ang oras na kinakailangan upang makakuha ng mga transplant na handa nang gamitin sa isang klinika ay binabawasan mula 3 linggo (para sa mga keratinocytes) hanggang 1-2 araw (para sa mga fibroblast). Ang isang pangunahing kultura ng fibroblast ay maaaring makuha sa pamamagitan ng pag-culture ng mga cell mula sa mga fragment ng balat na kinuha sa panahon ng autodermoplasty, at ang cell seeding density para sa pagkuha ng human fibroblast subcultures ay 20 x 10 ³ lamang bawat 1 cm ².

Upang pag-aralan ang epekto ng mga fibroblast at kanilang mga regulatory protein sa paglaganap at pagkita ng kaibhan ng mga keratinocytes, isang paghahambing na pagsusuri ng morpolohiya at paglaganap ng mga keratinocytes sa mga substrate ng mga uri ng collagen I at III, pati na rin ang fibronectin sa isang pinagsamang kultura na may mga fibroblast ng tao. Ang mga keratinocyte ng tao ay nakahiwalay sa mga fragment ng balat ng mga pasyente na may mga paso, na kinuha sa panahon ng autodermoplasty. Ang keratinocyte seeding density ay 50 x 103 cells bawat 1 cm2. Ang clinical efficacy ng cultured fibroblast transplantation ay nasuri sa 517 na mga pasyente. Ang lahat ng mga pasyente ay nahahati sa dalawang grupo: Pangkat 1 - mga biktima ng nasa hustong gulang na may mga paso ng IIA, B - IV degree; Pangkat 2 - mga batang may malalim na paso ng IIIB - IV degree. Ang pagsusuri ng dynamics ng istruktura at functional na organisasyon ng monolayer culture fibroblasts na isinasaalang-alang ang papel ng glycosaminoglycans, fibronectin at collagen sa mga proseso ng pagbabagong-buhay ay nagpapahintulot sa mga may-akda na matukoy ang ika-3 araw bilang ang pinaka-kanais-nais na panahon para sa paggamit ng mga kultura ng fibroblast upang gumawa ng mga transplant. Ang isang pag-aaral ng epekto ng fibroblast sa paglaganap at pagkita ng kaibhan ng mga keratinocytes ay nagpakita na sa vitro fibroblasts ay may binibigkas na stimulating effect, lalo na sa mga proseso ng keratinocyte adhesion, pagtaas ng bilang ng mga naka-attach na mga cell at ang rate ng kanilang pag-aayos ng higit sa 2 beses. Ang pagpapasigla ng mga proseso ng pagdirikit ay sinamahan ng isang pagtaas sa intensity ng synthesis ng DNA at ang antas ng paglaganap ng keratinocyte. Bilang karagdagan, ito ay lumabas na ang pagkakaroon ng mga fibroblast at ang extracellular matrix na nabuo sa kanila ay isang kinakailangang kondisyon para sa pagbuo ng tonofibrillar apparatus ng keratinocytes, intercellular connections at, sa huli, para sa pagkita ng kaibahan ng mga keratinocytes at pagbuo ng basal membrane. Sa paggamot ng mga bata na may malalim na pagkasunog, ang mataas na klinikal na kahusayan ng paglipat ng kultura ng allofibroblast ay naitatag, lalo na sa pangkat ng mga pasyente na may malawak na mga sugat sa balat sa mga kondisyon ng kakulangan ng donor site. Ang isang komprehensibong morphofunctional na pag-aaral ay nagpakita na ang mga transplant fibroblast ay nailalarawan sa pamamagitan ng aktibong synthesis ng DNA, pati na rin ang collagen, fibronectin at glycosaminoglycans, na bahagi ng extracellular matrix na nabuo ng mga cell. Itinuturo ng mga may-akda ang isang mataas na porsyento ng engraftment ng mga transplanted fibroblast (hanggang sa 96%), isang matalim na pagbawas sa oras ng kanilang pagtanggap (sa loob ng 24-48 na oras sa halip na 2-3 na linggo sa kaso ng paggamit ng mga keratinocytes), isang makabuluhang acceleration ng epithelialization ng burn surface, pati na rin ang isang makabuluhang pagbawas ng fibroblasts mula sa lumalagong teknolohiya mula sa 10 beses. kumpara sa keratinocyte transplantation. Ang paggamit ng paglipat ng mga kulturang allofibroblast ay ginagawang posible upang i-save ang buhay ng mga bata na may kritikal na pagkasunog - thermal pinsala sa higit sa 50% ng ibabaw ng katawan,na dating itinuturing na hindi tugma sa buhay. Dapat pansinin na sa paglipat ng mga allogeneic embryonic fibroblast, hindi lamang ang mas mabilis na pagbabagong-buhay ng sugat at paggaling ng mga pasyente na may iba't ibang antas at lugar ng pagkasunog, kundi pati na rin ang isang makabuluhang pagbawas sa kanilang dami ng namamatay ay napatunayan din na nakakumbinsi.

Ang mga autologous fibroblast ay ginagamit din sa isang kumplikadong lugar ng plastic surgery bilang reconstructive correction ng vocal cord injuries. Ang bovine collagen ay karaniwang ginagamit para sa layuning ito, ang tagal ng pagkilos nito ay limitado sa pamamagitan ng immunogenicity nito. Bilang isang dayuhang protina, ang bovine collagen ay sensitibo sa collagenase ng tatanggap at maaaring magdulot ng mga immune reaction, upang mabawasan ang panganib kung aling mga teknolohiya para sa pagkuha ng mga paghahanda ng collagen na naka-cross-link sa glutaraldehyde ay binuo. Ang kanilang kalamangan ay nakasalalay sa higit na katatagan at mas mababang immunogenicity, na natagpuan ang praktikal na aplikasyon sa pag-aalis ng mga depekto at pagkasayang ng vocal cords. Ang mga iniksyon ng autologous collagen ay unang ginamit noong 1995. Tiniyak ng pamamaraan ang pagpapanatili ng pangunahing istraktura ng mga autologous collagen fibers, kabilang ang intramolecular enzymatically catalyzed cross-links. Ang katotohanan ay ang natural na mga hibla ng collagen ay mas lumalaban sa pagkasira ng mga protease kaysa sa reconstituted collagen, kung saan ang mga telopeptides ay pinutol. Ang integridad ng telopeptides ay mahalaga para sa quaternary na istraktura ng collagen fibers at ang pagbuo ng mga cross-link sa pagitan ng mga katabing collagen molecule. Hindi tulad ng mga paghahanda ng bovine collagen, ang autologous collagen ay hindi nagdudulot ng mga immune reaction sa tatanggap, ngunit hindi ito sapat na epektibo bilang isang replenishing agent. Ang isang matatag na pagwawasto ay maaaring makamit sa pamamagitan ng lokal na produksyon ng collagen sa pamamagitan ng paglipat ng mga autologous fibroblast. Gayunpaman, ang ilang mga paghihirap ay natukoy sa panahon ng pag-aaral ng pagiging epektibo ng autologous fibroblast transplantation sa klinika. Sa unang bahagi ng panahon pagkatapos ng paglipat ng fibroblast, ang klinikal na epekto ay mas mahina kumpara sa pagkatapos ng pagpapakilala ng bovine collagen. Kapag nililinang ang mga autologous fibroblast, ang posibilidad ng pagbabagong-anyo ng mga normal na fibroblast sa mga pathological, ang tinatawag na myofibroblast, na responsable para sa pag-unlad ng fibrosis at pagbuo ng peklat, na pinatunayan ng pag-urong ng collagen gel na dulot ng partikular na pakikipag-ugnayan ng fibroblast at collagen fibrils, ay hindi maaaring maalis. Bilang karagdagan, pagkatapos ng serial passage sa vitro, ang mga fibroblast ay nawawalan ng kakayahang mag-synthesize ng mga extracellular matrix na protina.

Gayunpaman, ang isang pamamaraan para sa pag-kultura ng mga autologous na fibroblast ng tao ay binuo na ngayon ng eksperimento na nag-aalis ng mga nabanggit na pagkukulang at hindi nagreresulta sa oncogenic na pagbabagong-anyo ng mga normal na fibroblast. Ang mga autologous fibroblast na nakuha gamit ang pamamaraang ito ay ginagamit upang maibalik ang mga depekto sa malambot na mga tisyu ng mukha. Sa isang pag-aaral ni G. Keller et al. (2000), 20 pasyente na may edad 37 hanggang 61 taong gulang na may mga wrinkles at atrophic scars ang ginamot. Ang mga biopsy ng balat (4 mm) mula sa rehiyon ng retroauricular ay dinala sa laboratoryo sa mga sterile test tube na naglalaman ng 10 ml ng medium ng kultura (medium ng Eagle na may antibiotic, mycoseptic, pyruvate, at fetal calf serum). Ang materyal ay inilagay sa loob ng 3-5 na mga pagkaing pangkultura na 60 mm ang lapad at inilublob sa isang thermostat na may kapaligiran na naglalaman ng 5% CO2. Pagkatapos ng 1 linggo, ang mga cell ay tinanggal mula sa mga pinggan sa pamamagitan ng trypsinization at inilagay sa 25 cm2 vial. Ang mga cell ay na-injected sa mga pasyente sa isang halaga ng 4 x 107. Ang isang makabuluhang at paulit-ulit na klinikal na epekto ay na-obserbahan sa mga pasyente sa panahon ng pagwawasto ng nasolabial folds, pati na rin sa mga pasyente na may mga scars 7 at 12 buwan pagkatapos ng ikatlong paglipat ng autologous fibroblasts. Ayon sa flow cytometry, ang mga kulturang fibroblast ay gumawa ng malaking halaga ng type I collagen. Ang mga pag-aaral sa vitro ay nagpakita ng normal na pagkontrata ng mga iniksyon na fibroblast. Dalawang buwan pagkatapos ng subcutaneous na pangangasiwa ng mga kulturang fibroblast sa isang dosis na 4 x 107 na mga cell, walang mga tumor na nakita sa mga hubad na daga. Ang mga iniksyon na fibroblast ay hindi nagdulot ng pagkakapilat o nagkakalat na fibrosis sa mga pasyente. Ayon sa may-akda, ang mga naka-engraft na autologous fibroblast ay may kakayahang patuloy na gumawa ng collagen, na magbibigay ng cosmetic rejuvenation effect. Kasabay nito, dahil limitado ang haba ng buhay ng magkakaibang mga selula, ang mga fibroblast na kinuha mula sa isang batang pasyente ay mas epektibo kaysa sa nakuha mula sa mga matatandang tao. Sa hinaharap, ipinapalagay na posibleng i-cryopreserve ang isang kultura ng mga fibroblast na kinuha mula sa isang batang donor upang mailipat sa ibang pagkakataon ang kanyang sariling mga batang selula sa isang matatandang pasyente. Sa konklusyon, hindi ganap na tama upang tapusin na ang mga autologous fibroblast, sa kondisyon na ang mga ito ay napanatili sa pagganap, ay isang mainam na paraan ng pagwawasto ng mga depekto ng malambot na mga tisyu ng mukha. Kasabay nito, sinabi mismo ng may-akda na ang ilang mga problemang sitwasyon na may kaugnayan sa paggamit ng autologous fibroblast-collagen system ay lumitaw sa panahon ng pag-aaral. Ang klinikal na epekto ay madalas na mas mahina kaysa kapag gumagamit ng bovine collagen, na nagdulot ng pagkabigo sa mga pasyente.

Sa pangkalahatan, ang data ng panitikan sa mga prospect para sa klinikal na paggamit ng mga mesenchymal stem cell ay mukhang lubos na maasahin sa mabuti. Sinusubukang gamitin ang autologous bone marrow multipotent mesenchymal progenitor cells upang gamutin ang mga degenerative joint lesyon. Ang mga unang klinikal na pagsubok ng paggamit ng mga kulturang mesenchymal progenitor cells sa paggamot ng mga kumplikadong bali ng buto ay isinasagawa. Ang mga auto- at allogeneic mesenchymal bone marrow stromal cells ay ginagamit upang lumikha ng cartilage tissue para sa transplantation sa pagwawasto ng articular cartilage defects dahil sa trauma o autoimmune lesions. Ang mga pamamaraan ay binuo para sa klinikal na paggamit ng multipotent mesenchymal progenitor cells upang maalis ang mga depekto sa buto sa mga bata na may malubhang anyo ng hindi kumpletong osteogenesis na dulot ng mga mutasyon sa type I collagen gene. Pagkatapos ng myeloablation, ang mga batang tatanggap ay inililipat gamit ang bone marrow mula sa HLA-compatible na malusog na donor, dahil ang unfractionated bone marrow ay maaaring maglaman ng sapat na bilang ng mga mesenchymal stem cell upang mabayaran ang isang malubhang depekto sa buto. Pagkatapos ng paglipat ng allogeneic bone marrow, ang mga naturang bata ay nagpakita ng mga positibong pagbabago sa histological sa trabecular bones, isang pagtaas sa rate ng paglago, at isang pagbawas sa saklaw ng bone fractures. Sa ilang mga kaso, ang isang positibong klinikal na resulta ay nakakamit sa pamamagitan ng paglipat ng malapit na nauugnay na allogeneic bone marrow at osteoblast. Ginagamit din ang MSC transplantation upang gamutin ang congenital bone fragility na sanhi ng kawalan ng balanse ng mga osteoblast at osteoclast sa bone tissue. Sa kasong ito, ang pagpapanumbalik ng pagbuo ng buto ay nakamit sa pamamagitan ng chimerization ng pool ng stem at progenitor stromal cells sa bone tissue ng mga pasyente.

Ang pagpapabuti ng mga pamamaraan ng genetic modification ng donor mesenchymal stem cell para sa layunin ng pagwawasto ng genetic defects ng stromal tissues ay nagpapatuloy. Ipinapalagay na sa pinakamalapit na hinaharap na mga mesenchymal progenitor cells ay gagamitin sa neurolohiya para sa naka-target na chimerization ng mga selula ng utak at paglikha ng malusog na pool ng mga cell na may kakayahang bumuo ng kulang na enzyme o kadahilanan na responsable para sa mga klinikal na pagpapakita ng sakit. Ang paglipat ng mga mesenchymal stem cell ay maaaring gamitin para sa pagpapanumbalik ng bone marrow stroma sa mga pasyente ng cancer pagkatapos ng radio- at chemotherapy, at kasama ng bone marrow cells - para sa pagpapanumbalik ng hematopoiesis. Ang pagbuo ng replacement therapy na naglalayong alisin ang mga depekto ng musculoskeletal system sa tulong ng MSCs ay itinataguyod ng mga pag-unlad ng engineering sa larangan ng pagdidisenyo ng mga biomaterial ng matrix o biomimetics na bumubuo ng mga balangkas na pinaninirahan ng mga supling ng mesenchymal stem cell.

Mga mapagkukunan ng mesenchymal stem cell

Ang pangunahing pinagmumulan ng mga mesenchymal stem cell ay bone marrow, na ang mga hematopoietic stem cell sa katawan ng mga mammal ay patuloy na nag-iiba sa mga selula ng dugo at immune system, habang ang mga mesenchymal stem cell ay kinakatawan ng isang maliit na populasyon ng fibroblast-like na mga cell ng bone marrow stroma at nag-aambag sa pagpapanatili ng hindi nakikilalang estado ng mga hematopoietic stem cell. Sa ilang partikular na kundisyon, ang mga mesenchymal stem cell ay naiba sa cartilage at bone tissue cells. Kapag na-seed sa isang medium ng kultura sa ilalim ng mababang-densidad na mga kondisyon ng pagtatanim, ang mga mononuclear stromal cell ng bone marrow ay bumubuo ng mga kolonya ng mga adhesive cell, na kung saan ay, sa katunayan, fibroblast-like multipotent mesenchymal progenitor cells. Ang ilang mga may-akda ay naniniwala na ang hindi nakatalagang mesenchymal stem cell ay idineposito sa bone marrow, na, dahil sa kanilang kakayahang mag-renew ng sarili at mataas na potensyal ng pagkita ng kaibhan, ay nagbibigay sa lahat ng mga tisyu ng katawan ng mga mesenchymal precursors ng mga elemento ng stromal sa buong buhay ng mammalian organism.

Sa bone marrow, ang stromal cellular elements ay bumubuo ng isang network na pumupuno sa espasyo sa pagitan ng sinusoid at bone tissue. Ang nilalaman ng dormant MSCs sa bone marrow ng isang may sapat na gulang ay maihahambing sa dami ng hematopoietic stem cell at hindi lalampas sa 0.01-0.001%. Ang mga mesenchymal stem cell na nakahiwalay sa bone marrow at hindi napapailalim sa paglilinang ay walang mga molekula ng pagdirikit. Ang ganitong mga MSC ay hindi nagpapahayag ng CD34, ICAM, VCAM, mga uri ng collagen I at III, CD44 at CD29. Dahil dito, sa vitro, hindi mga mesenchymal stem cell ang naayos sa substrate ng kultura, ngunit mas advanced na progenitor derivatives ng mesenchymal stem cells na nabuo na ang mga bahagi ng cytoskeleton at ang receptor apparatus ng cell adhesion molecules. Ang mga stromal cell na may CD34 phenotype ay matatagpuan kahit sa peripheral blood, bagaman sa bone marrow ay may mas kaunting mga ito kaysa sa CD34-positive mononuclear cells. Ang mga cell ng CD34 ay nakahiwalay sa dugo at inilipat sa kultura na nakakabit sa substrate at bumubuo ng mga kolonya ng mga cell na tulad ng fibroblast.

Ito ay kilala na sa panahon ng embryonic ang stromal na batayan ng lahat ng mga organo at tisyu ng mga mammal at tao ay nagmumula sa isang karaniwang pool ng mga mesenchymal stem cell bago at sa yugto ng organogenesis. Samakatuwid, pinaniniwalaan na sa isang mature na organismo ang karamihan ng mga mesenchymal stem cell ay dapat nasa connective at bone tissue. Ito ay itinatag na ang pangunahing bahagi ng mga elemento ng cellular ng stroma ng maluwag na connective at bone tissue ay kinakatawan ng mga nakatuon na progenitor cells, na, gayunpaman, ay nagpapanatili ng kakayahang magparami at bumuo ng mga clone sa vitro. Kapag ang mga naturang cell ay ipinakilala sa pangkalahatang daloy ng dugo, higit sa 20% ng mga mesenchymal progenitor cells ay itinanim sa mga stromal na elemento ng hematopoietic tissue at parenchymatous na mga organo.

Ang isang potensyal na mapagkukunan ng mesenchymal stem cell ay adipose tissue, kabilang sa mga stem cell kung saan ang mga adipocyte precursor na nakatuon sa iba't ibang antas ay natukoy. Ang hindi bababa sa mature na mga elemento ng progenitor ng adipose tissue ay mga stromal-vascular cells, na, tulad ng multipotent mesenchymal precursor cells ng bone marrow, ay may kakayahang mag-iba sa adipocytes sa ilalim ng impluwensya ng glucocorticoids, insulin-like growth factor, at insulin. Sa kultura, ang mga selula ng stromal-vascular ay nag-iiba sa mga adipocytes at chondrocytes, at sa adipose tissue na pinagmulan ng bone marrow ay may mga cell na bumubuo ng adipocytes at osteoblast.

Ang mga stromal stem cell ay natagpuan din sa mga kalamnan. Sa pangunahing kultura ng mga cell na nakahiwalay sa kalamnan ng kalansay ng tao, ang mga stellate cell at multinucleated myotubes ay napansin. Sa pagkakaroon ng serum ng kabayo, ang mga selula ng stellate ay lumalaganap sa vitro nang walang mga palatandaan ng cytodifferentiation, at pagkatapos ng pagdaragdag ng dexamethasone sa nutrient medium, ang kanilang pagkita ay nailalarawan sa pamamagitan ng paglitaw ng mga elemento ng cellular na may phenotype ng skeletal at makinis na mga selula ng kalamnan, buto, cartilage, at adipose tissue. Samakatuwid, ang parehong nakatuon at hindi nakatuon na multipotent mesenchymal progenitor cells ay naroroon sa tissue ng kalamnan ng tao. Ipinakita na ang populasyon ng mga progenitor cells na naroroon sa skeletal muscle ay nagmula sa uncommitted multipotent mesenchymal progenitor cells ng bone marrow at naiiba sa myogenic satellite cells.

Ang mga malagkit na stellate cells na naaayon sa multipotent mesenchymal progenitor cells sa potensyal ng pagkita ng kaibhan ay natagpuan din sa myocardium ng mga bagong panganak na daga, dahil sa ilalim ng impluwensya ng dexamethasone ay naiba sila sa adipocytes, osteoblast, chondrocytes, makinis na mga selula ng kalamnan, myotubes ng kalamnan ng kalansay at cardiomyocytes. Ipinakita na ang mga vascular smooth na selula ng kalamnan (pericytes) ay mga derivatives ng mga hindi nakikilalang perivascular multipotent mesenchymal progenitor cells. Sa kultura, ang perivascular mesenchymal stem cell ay nagpapahayag ng makinis na kalamnan na a-actin at platelet-derived growth factor receptor at may kakayahang mag-iba kahit man lang sa makinis na mga selula ng kalamnan.

Ang isang espesyal na lugar, mula sa punto ng view ng mga stem reserves, ay inookupahan ng cartilaginous tissue, ang napakababang reparative potential nito ay pinaniniwalaan na dahil sa kakulangan ng multipotent mesenchymal progenitor cells o differentiation at growth factor. Ipinapalagay na ang multipotent mesenchymal progenitor cells na precommitted sa chondro- at osteogenesis ay pumapasok sa cartilaginous tissue mula sa iba pang tissue sources.

Ang pinagmulan ng tisyu at mga kondisyon ng pangako ng mesenchymal progenitor cells sa tendons ay hindi pa naitatag. Ang mga eksperimentong obserbasyon ay nagpapahiwatig na sa unang bahagi ng postnatal period, ang mga rabbit Achilles tendon cells sa mga pangunahing kultura at sa unang daanan ay nagpapanatili ng pagpapahayag ng type I collagen at decorin, ngunit sa karagdagang paglilinang nawala ang mga marker ng pagkita ng kaibhan ng mga tenocytes.

Dapat pansinin na ang sagot sa tanong kung ang mga multipotent mesenchymal progenitor cells na naisalokal sa iba't ibang mga tisyu ay talagang patuloy na naroroon sa kanilang stroma, o kung ang tissue pool ng mesenchymal stem cell ay napunan muli ng paglipat ng bone marrow stromal stem cell, ay hindi pa natatanggap.

Bilang karagdagan sa bone marrow at iba pang mesenchymal tissue zone ng isang adult na organismo, ang cord blood ay maaaring isa pang mapagkukunan ng mga MSC. Ipinakita na ang dugo ng pusod na ugat ay naglalaman ng mga selula na may magkatulad na morphological at antigenic na katangian na may multipotent mesenchymal progenitor cells, ay may kakayahang magdikit at hindi mas mababa sa multipotent mesenchymal progenitor cells ng bone marrow na pinagmulan sa potensyal ng pagkita ng kaibahan. Sa mga kultura ng mesenchymal stem cell ng umbilical cord blood, 5 hanggang 10% ng mga uncommitted multipotent mesenchymal progenitor cells ang natagpuan. Ito ay naka-out na ang kanilang numero sa cord blood ay inversely proportional sa gestational age, na hindi direktang nagpapahiwatig ng paglipat ng multipotent mesenchymal progenitor cells sa iba't ibang mga tisyu sa panahon ng pag-unlad ng pangsanggol. Ang unang impormasyon ay lumitaw sa klinikal na paggamit ng mga mesenchymal stem cell na nakahiwalay sa umbilical cord blood, gayundin sa mga nakuha mula sa embryonic biomaterial, na batay sa kilalang kakayahan ng mga fetal stem cell na magsama, mag-ukit, at gumana sa mga organ at tissue system ng mga adultong tatanggap.

Maghanap ng mga bagong mapagkukunan ng mesenchymal stem cell

Ang paggamit ng mga mesenchymal stem cell ng embryonic na pinagmulan, pati na rin ang iba pang mga fetal cell, ay lumilikha ng isang bilang ng mga etikal, legal, hudisyal at pambatasan na mga problema. Samakatuwid, ang paghahanap para sa extraembryonic donor cell material ay nagpapatuloy. Ang isang pagtatangka sa klinikal na paggamit ng mga fibroblast ng balat ng tao ay hindi matagumpay, na paunang natukoy hindi lamang ng mataas na kapasidad sa pananalapi ng teknolohiya, kundi pati na rin ng mabilis na pagkita ng kaibahan ng mga fibroblast sa mga fibrocytes, na may makabuluhang mas mababang potensyal na paglaganap at gumagawa ng isang limitadong bilang ng mga kadahilanan ng paglago. Ang karagdagang pag-unlad sa pag-aaral ng biology ng MSCs at multipotent mesenchymal progenitor cells ng bone marrow ay nagpapahintulot sa amin na bumuo ng isang diskarte para sa klinikal na paggamit ng autologous mesenchymal stem cells. Ang teknolohiya ng kanilang paghihiwalay, paglilinang, pagpaparami ng ex vivo at naka-target na pagkita ng kaibhan ay kinakailangan, una sa lahat, ang pag-aaral ng spectrum ng mga molecular marker ng MSCs. Ang kanilang pagsusuri ay nagpakita na ang mga pangunahing kultura ng tissue ng buto ng tao ay naglalaman ng ilang uri ng multipotent mesenchymal progenitor cells. Ang proosteoblast phenotype ay nakita sa mga cell na nagpapahayag ng marker ng stromal progenitor cells STRO-1, ngunit hindi nagdadala ng osteoblast marker - alkaline phosphatase. Ang ganitong mga cell ay nailalarawan sa pamamagitan ng isang mababang kakayahang bumuo ng mineralized bone matrix, pati na rin ang kawalan ng osteopontin at parathyroid hormone receptor expression. Ang mga derivatives ng STRO-1-positive na mga cell na hindi nagpapahayag ng alkaline phosphatase ay kinakatawan ng intermediately at ganap na pagkakaiba-iba ng mga osteoblast. Napag-alaman na ang mga cellular na elemento ng mga naka-clone na linya ng STRO-1-positibong human trabecular bone cells ay may kakayahang mag-iba sa mga mature na osteocytes at adipocytes. Ang direksyon ng pagkita ng kaibhan ng mga cell na ito ay nakasalalay sa epekto ng polyunsaturated fatty acids, proinflammatory cytokines - IL-1b at tumor necrosis factor a (TNF-a), pati na rin ang anti-inflammatory at immunosuppressive TGF-b.

Nang maglaon, natagpuan na ang mga multipotent mesenchymal progenitor cells ay kulang sa isang tiyak na phenotype na likas lamang sa kanila, ngunit nagpapahayag ng isang kumplikadong mga marker na katangian ng mesenchymal, endothelial, epithelial at muscle cells sa kawalan ng pagpapahayag ng immunophenotypic antigens ng hematopoietic cells - CD45, CD34 at CD14. Bilang karagdagan, ang mga mesenchymal stem cell ay constitutive at inducibly na gumagawa ng hematopoietic at non-hematopoietic growth factor, interleukins at chemokines, at mga receptor para sa ilang cytokine at growth factor ay ipinahayag sa multipotent mesenchymal progenitor cells. Ang mga dormant, o resting, na mga cell na may immunophenotype na halos magkapareho sa antigen profile ng 5-fluorouracil-untreated multipotent mesenchymal progenitor cells ay natagpuan sa mga cell ng stromal matrix ng katawan ng tao - ang parehong mga cell ay nagpapahayag ng CD117, na nagmamarka ng "pang-adultong" stem cell.

Kaya, ang isang cell marker na natatangi sa mesenchymal stem cells ay hindi pa nakikilala. Ipinapalagay na ang mga quiescent cell ay kumakatawan sa isang populasyon ng mga uncommitted multipotent mesenchymal progenitor cells, dahil hindi sila nagpapahayag ng mga marker ng mga cell na nakatuon sa osteo- (Cbfa-1) o adipogenesis (PPAR-y-2). Ang matagal na pagkakalantad ng dahan-dahang lumalaganap na mga tahimik na selula sa fetal bovine serum ay humahantong sa pagbuo ng terminally differentiating committed progenitors na nailalarawan sa mabilis na paglaki. Ang pagpapalawak ng clonal ng naturang mesenchymal stem cells ay sinusuportahan ng FGF2. Tila ang genome ng stromal stem cell ay medyo mahigpit na "sarado". Mayroong mga ulat ng kawalan ng kusang pagkita ng kaibhan sa mga MSC - nang walang mga espesyal na kondisyon para sa pangako, hindi sila nagbabago kahit na sa mga cell ng mesenchymal lineage.

Upang pag-aralan ang istraktura ng populasyon ng mesenchymal stem cell derivatives, ang paghahanap para sa mga protina ng pagkita ng pagkakaiba ay isinasagawa sa mga linya ng stromal cell at sa mga pangunahing kultura. Ang in vitro clonal analysis ng bone marrow colony-forming cells ay nagpakita na ang EGF ay nagpapataas ng average na laki ng kolonya at nagpapababa ng clonal expression ng alkaline phosphatase kapag inilapat sa mga pangunahing kultura, habang ang pagdaragdag ng hydrocortisone ay nagpapagana ng pagpapahayag ng alkaline phosphatase, na isang marker ng osteogenic na direksyon ng MSC differentiation. Ginawang posible ng mga monoclonal antibodies sa STRO-1 na paghiwalayin at pag-aralan ang populasyon ng STRO-1-positive adhesive cells sa isang heterogenous na sistema ng mga kultura ng Dexter. Natukoy ang isang spectrum ng mga cytokine na kumokontrol hindi lamang sa paglaganap at pagkita ng kaibahan ng mga hematopoietic at lymphoid cells, ngunit nakikilahok din sa pagbuo, pagbuo at resorption ng mga skeletal tissue sa pamamagitan ng para-, auto- at endocrine na mga mekanismo. Ginagamit din ang receptor-mediated release ng mga pangalawang messenger gaya ng cAMP, diacylglycerol, inositol triphosphate at Ca2+ para sa marker analysis ng iba't ibang kategorya ng stromal tissue cells na nagpapahayag ng kaukulang mga receptor. Ang paggamit ng mga monoclonal antibodies bilang mga marker ay naging posible upang maitaguyod ang pag-aari ng mga reticular cells ng stroma ng mga lymphoid organ sa T- at B-dependent zone.

Sa loob ng ilang panahon, nagpatuloy ang mga siyentipikong debate sa paligid ng tanong ng posibilidad ng pinagmulan ng MSC mula sa isang hematopoietic stem cell. Sa katunayan, kapag ang mga suspensyon ng selula ng utak ng buto ay inilipat sa mga kulturang monolayer, ang mga discrete colonies ng fibroblast ay lumalaki sa kanila. Gayunpaman, ipinakita na ang pagkakaroon ng mga precursor ng fibroblast colonies at iba't ibang mga sprouts ng hematopoietic tissue differentiation sa bone marrow ay hindi katibayan ng kanilang karaniwang pinagmulan mula sa isang hematopoietic stem cell. Gamit ang discriminant analysis ng bone marrow stem cells, itinatag na ang microenvironment sa panahon ng heterotopic bone marrow transplantation ay hindi inililipat ng hematopoietic cells, na nagpapatunay ng pagkakaroon ng populasyon ng MSC sa bone marrow na histogenetically independent ng hematopoietic cells.

Bilang karagdagan, ginawang posible ng selective cloning method na makilala ang isang bagong kategorya ng stromal progenitor cells sa mga monolayer na kultura ng bone marrow cells, matukoy ang kanilang mga numero, at pag-aralan ang kanilang mga katangian, proliferative at differentiating potentials. Lumalabas na ang mga selulang tulad ng stromal fibroblast ay dumami sa vitro at bumubuo ng mga diploid na kolonya, na, kapag inilipat pabalik sa katawan, ay nagbibigay para sa pagbuo ng mga bagong hematopoietic na organo. Ang mga resulta ng pag-aaral ng mga indibidwal na clone ay nagpapahiwatig na sa mga stromal progenitor cells mayroong isang populasyon ng mga cell na, sa pamamagitan ng kanilang proliferative at differentiating potential, ay maaaring mag-claim ng papel ng mga stem cell ng stromal tissue, histogenetically independent ng hematopoietic stem cells. Ang mga selula ng populasyon na ito ay nailalarawan sa pamamagitan ng paglaki ng sarili at naiba sa mga elemento ng progenitor cell ng buto, kartilago at reticular tissue ng bone marrow.

Malaking interes ang mga resulta ng mga pag-aaral ni R. Chailakhyan at mga kapwa may-akda (1997-2001), na naglinang ng bone marrow stromal progenitor cells mula sa mga rabbits, guinea pig, at mice sa a-MEM nutrient medium na may karagdagan ng fetal calf serum. Ang mga may-akda ay nagsagawa ng explantation na may paunang density na 2-4 x 103 bone marrow cells bawat 1 cm2. Ang homologous o heterologous radiation-inactivated bone marrow cells ay ginamit bilang feeder sa isang dosis na nagpapanatili ng feeder effect ngunit ganap na hinarangan ang kanilang paglaganap. Ang dalawang linggong gulang na pangunahing discrete colonies ng fibroblasts ay na-trypsinize upang makakuha ng mga monoclonal strain. Ang katibayan ng clonal na pinagmulan ng mga kolonya ay nakuha gamit ang isang chromosomal marker sa halo-halong bone marrow na kultura ng lalaki at babae na guinea pig, time-lapse photography ng mga live na kultura, at sa halo-halong kultura ng syngeneic bone marrow ng CBA at CBAT6T6 mice. Ang paglipat ng isang suspensyon ng mga bagong nakahiwalay na bone marrow cells o in vitro grown stromal fibroblasts sa ilalim ng kidney capsule ay isinagawa sa ivalon o gelatin porous scaffolds, pati na rin ang inactivated rabbit spongy bone matrix. Para sa paglipat ng mga clone sa isang kaluban ng buto, ang mga guinea pig femur ay nilinis ng malambot na tisyu at periosteum, ang mga epiphyses ay pinutol, at ang utak ng buto ay lubusang hinugasan. Ang buto ay pinutol sa mga fragment (3-5 mm), pinatuyo, at pinailaw sa isang dosis na 60 Gy. Ang mga indibidwal na kolonya ng fibroblast ay inilagay sa mga kaluban ng buto at itinanim sa intramuscularly. Para sa intraperitoneal transplantation ng stromal fibroblast na lumago sa vitro, ginamit ang mga diffusion chamber ng mga uri A (V=0.015 cm3, h=0.1 mm) at O (V=0.15 cm3, h=2 mm).

Kapag pinag-aaralan ang dynamics ng paglago ng clonal strains, R. Chailakhyan et al. (2001) natagpuan na ang mga indibidwal na mga cell na bumubuo ng mga kolonya ng fibroblast, pati na rin ang kanilang mga inapo, ay may napakalaking potensyal na proliferative. Sa ika-10 na sipi, ang bilang ng mga fibroblast sa ilang mga strain ay 1.2-7.2 x 10 ⁹ na mga cell. Sa kanilang pag-unlad, nagsagawa sila ng hanggang 31-34 na pagdodoble ng cell. Sa kasong ito, ang heterotopic transplantation ng bone marrow-derived strains na nabuo ng stromal precursors ng ilang dosenang clone ay nagresulta sa paglipat ng bone marrow microenvironment at pagbuo ng bagong hematopoietic organ sa transplantation zone. Ang mga may-akda ay nagtanong kung ang mga indibidwal na clone ay may kakayahang ilipat ang bone marrow microenvironment ng mga stromal cells o kung ang pakikipagtulungan ng maraming iba't ibang mga clonogenic stromal precursor ay kinakailangan para dito? At kung ang mga indibidwal na clone ay may kakayahang maglipat ng microenvironment, magiging kumpleto ba ito para sa lahat ng tatlong hematopoietic sprouts, o ang iba't ibang clone ay nagbibigay ng pagbuo ng microenvironment para sa iba't ibang hematopoietic sprouts? Upang malutas ang mga isyung ito, binuo ang isang teknolohiya para sa pag-kultura ng mga stromal progenitor cells sa isang collagen gel, na nagpapahintulot sa mga lumalagong kolonya ng fibroblast na alisin mula sa ibabaw para sa kasunod na heterotopic transplantation. Ang mga indibidwal na clone ng stromal fibroblast na lumaki mula sa bone marrow cells ng CBA mice at guinea pig ay inalis kasama ng isang fragment ng gel coating at heterotopically transplanted - sa ilalim ng kidney capsule ng syngeneic mice o sa tiyan ng kalamnan ng autologous guinea pig. Kapag inilipat sa kalamnan, ang mga kolonya sa gel ay inilagay sa mga kaluban ng buto.

Nalaman ng mga may-akda na 50-90 araw pagkatapos ng paglipat ng mga kolonya ng bone marrow fibroblast, ang pag-unlad ng buto o buto at hematopoietic tissue ay naobserbahan sa transplantation zone sa 20% ng mga kaso. Sa 5% ng mga hayop na tumatanggap, ang nabuong foci ng bone tissue ay naglalaman ng isang lukab na puno ng bone marrow. Sa loob ng mga silindro ng buto, ang naturang foci ay may bilugan na hugis at isang kapsula na gawa sa tissue ng buto na may mga osteocytes at isang mahusay na nabuong osteoblastic layer. Ang bone marrow cavity ay naglalaman ng reticular tissue na may myeloid at erythroid cells, ang proporsyonal na relasyon na hindi naiiba sa normal na bone marrow. Sa kidney, ang transplant ay isang tipikal na bone marrow organ na nabuo sa panahon ng paglipat ng native bone marrow, na ang bone capsule ay sumasakop sa bone marrow cavity mula lamang sa gilid ng renal capsule. Kasama sa hematopoietic tissue ang myeloid, erythroid at megakaryocytic na mga elemento. Ang stroma ng bone marrow cavity ay may mahusay na binuo na sinus system at naglalaman ng mga tipikal na fat cells. Kasabay nito, ang tissue ng buto na walang mga palatandaan ng hematopoiesis ay natagpuan sa transplantation zone ng ilang mga kolonya sa ilalim ng kapsula ng bato. Ang pag-aaral ng proliferative at differentiating potentials ng mga indibidwal na clone ay ipinagpatuloy sa monoclonal bone marrow strains ng mga rabbits, ang mga cell nito ay muling nasuspinde sa isang nutrient medium at sa isang hiwalay na ivalon sponge na may mass na 1-2 mg ay inilipat sa ilalim ng renal capsule ng isang rabbit-bone marrow donor. Ang mga cell ng 21 monoclonal strains ay sumailalim sa naturang autotransplantation. Ang mga resulta ay kinuha sa account pagkatapos ng 2-3 buwan. Natuklasan ng mga may-akda na sa 14% ng mga kaso, ang na-transplant na monoclonal strains ay bumubuo ng bone marrow organ na binubuo ng bone tissue at isang bone marrow cavity na puno ng hematopoietic cells. Sa 33% ng mga kaso, ang mga na-transplant na strain ay bumubuo ng isang compact na buto na may iba't ibang laki na may mga osteocytes na immured sa mga cavity at isang nabuo na osteoblastic layer. Sa ilang mga kaso, ang reticular tissue na walang buto o hematopoietic na elemento ay nabuo sa mga espongha na may mga transplanted clone. Minsan, nabuo ang reticular stroma na may mahusay na binuo na network ng mga sinusoid, ngunit hindi napuno ng mga hematopoietic na selula. Kaya, ang mga nakuha na resulta ay katulad ng data na nakuha sa panahon ng clone transplantation sa collagen gel. Gayunpaman, kung ang paglipat ng mga clone na lumago sa isang substrate ay nagresulta sa pagbuo ng bone marrow tissue sa 5% ng mga kaso, bone tissue sa 15% at reticular tissue sa 80% ng mga kaso, pagkatapos ay sa paglipat ng monoclonal strains, ang pagbuo ng mga elemento ng bone marrow ay sinusunod sa 14% ng mga kaso, bone tissue sa 53% at reticular tissue sa 53% ng mga kaso. Ayon sa mga may-akda, ipinapahiwatig nito na ang mga kondisyon para sa pagpapatupad ng proliferative at pagkakaiba-iba ng potensyal ng stromal fibroblast sa panahon ng paglipat sa mga porous scaffold ay mas pinakamainam kaysa sa panahon ng kanilang paglipat sa mga buto ng buto at sa isang collagen substrate.Posible na ang paggamit ng mas advanced na mga pamamaraan ng pag-culture at reverse transplantation ng mga clone ay maaaring mapabuti ang mga kondisyon para sa pagsasakatuparan ng kanilang potensyal na pagkita ng kaibhan sa pamamagitan ng mga clone at baguhin ang mga ratios na ito. Isang paraan o iba pa, ngunit ang pangunahing kahalagahan ng isinagawang pag-aaral ay ang ilang mga clone ng stromal cells ay may kakayahang bumuo ng tissue ng buto at sabay na nagbibigay ng stromal hematopoietic microenvironment para sa tatlong sprouts ng bone marrow hematopoiesis nang sabay-sabay: erythroid, myeloid at megakaryocytic, na lumilikha ng medyo malalaking platform ng hematopoietic tissue at ilang bone mass tissue.

Pagkatapos ay tinalakay ng mga may-akda ang isyu ng kakayahan ng mga indibidwal na clonogenic stromal progenitor cells na sumailalim sa mga ganitong uri ng pagkakaiba-iba ng cell sa isang saradong sistema ng mga diffusion chamber. Bilang karagdagan, kinakailangan upang matukoy kung ang mga indibidwal na clone ay nagtataglay ng polypotency o kung ang pagpapakita ng potensyal ng pagkita ng kaibhan ay nangangailangan ng kooperatiba na pakikipag-ugnayan ng ilang mga clone na may isang nakapirming katangian ng cytodifferentiation, ang iba't ibang mga ratios kung saan tinutukoy ang kagustuhan na pagbuo ng buto, reticular, o cartilaginous tissue. Sa pamamagitan ng pagsasama-sama ng dalawang pamamaraang pamamaraan - pagkuha ng mga monoclonal strains ng bone marrow stromal progenitor cells at paglipat ng mga ito sa diffusion chambers - R. Chailakhyan at co-authors (2001) ay nakakuha ng mga resulta na nagpapahintulot sa kanila na lumapit sa pag-unawa sa istrukturang organisasyon ng bone marrow stroma. Ang paglipat ng mga monoclonal strain ng stromal progenitor cells sa mga O-type na kamara ay nagresulta sa pagbuo ng parehong buto at cartilage tissue, na nagpapahiwatig ng kakayahan ng mga inapo ng isang solong stromal colony-forming cell na sabay-sabay na bumuo ng buto at cartilage tissue. Ang pagpapalagay na ang buto at cartilage tissue ay nagmula sa isang karaniwang stromal progenitor cell ay paulit-ulit na inilagay. Gayunpaman, ang hypothesis na ito ay walang tamang pang-eksperimentong kumpirmasyon. Ang pagbuo ng buto at kartilago sa mga silid ng pagsasabog ay ang kinakailangang patunay ng pagkakaroon ng isang karaniwang progenitor cell para sa dalawang uri ng tissue na ito sa mga bone marrow stromal stem cell.

Pagkatapos 29 clonal strains ng pangalawang-ikatlong mga sipi na nakuha mula sa mga pangunahing kultura ng utak ng buto ng kuneho ay inilagay sa mga silid ng pagsasabog at itinanim sa intraperitoneally sa mga homologous na hayop. Ipinakita ng mga pag-aaral na 45% ng bone marrow monoclonal strains ay nagtataglay ng potensyal na osteogenic. Ang siyam na silid ay naglalaman ng eksklusibong reticular tissue, ngunit ito ay naroroon kasama ng buto at kartilago tissue sa 13 higit pang mga silid, na bumubuo ng 76% ng lahat ng mga strain. Sa mga silid ng uri ng O, kung saan posible ang pagkita ng kaibahan ng buto at kartilago tissue, 16 na mga strain ang pinag-aralan. Sa apat na silid (25%) parehong buto at kartilago tissue ay nabuo. Dapat pansinin muli na sa mga pag-aaral ni R. Chailakhyan et al. (2001), ang mga indibidwal na progenitor cells ay sumailalim sa 31 hanggang 34 na pagdodoble sa loob ng isang cell strain, at ang kanilang progeny ay binubuo ng 0.9-2.0 x 10 ⁹ na mga cell. Ang bilang ng mga mitoses na pinagdaanan ng mga progenitor cells ng polyclonal strains ay halos magkapareho sa monoclonal strains. Ang rate ng pag-unlad ng polyclonal strains, lalo na sa unang yugto ng kanilang pagbuo, ay nakasalalay sa isang makabuluhang lawak sa bilang ng mga kolonya na ginamit upang simulan ang mga strain. Ang mga diploid na strain ng human embryonic fibroblast (WI-38), kapag na-reclone sa ika-12-15 na antas ng pagdodoble, ay bumuo din ng mga kolonya na naiiba sa diameter at nilalaman ng cell. Ang mga malalaking kolonya na naglalaman ng higit sa 103 mga selula ay bumubuo lamang ng 5-10%. Sa pagtaas ng bilang ng mga dibisyon, bumaba ang porsyento ng malalaking kolonya. Ang mga mono- at polyclonal na strain ng bone marrow stromal fibroblast ay nagpapanatili ng isang diploid na hanay ng mga chromosome pagkatapos ng 20 o higit pang mga pagdodoble, at ang tendensya ng kanilang pag-unlad ay maihahambing sa dinamika ng pag-unlad ng mga diploid na strain ng mga embryonic fibroblast. Ang pagsusuri sa potensyal ng pagkita ng kaibhan ng indibidwal na bone marrow stromal progenitor cells, na isinagawa sa pamamagitan ng paglipat ng mga monoclonal strain sa mga diffusion chamber, ay nagpakita na kalahati sa kanila ay osteogenic. Ang malalaking kolonya ay umabot sa 10% ng kanilang kabuuang bilang. Dahil dito, ang bilang ng mga osteogenic colony-forming cells ay tumutugma sa humigit-kumulang 5% ng kanilang kabuuang populasyon. Ang kabuuang masa ng osteogenic progenitor cells na kinilala ng mga may-akda ay kasama ang mga cell na may kakayahang sabay na bumubuo ng buto at kartilago tissue. Bukod dito, ito ay itinatag sa unang pagkakataon na ang dalawang uri ng tissue na ito sa isang adult na organismo ay may isang karaniwang progenitor cell: 25% ng mga nasubok na clone ay nilikha ng naturang mga cell, at ang kanilang bilang sa kabuuang populasyon ng mga progenitor cell ay hindi bababa sa 2.5%.

Kaya, ang heterotopic na paglipat ng mga indibidwal na clone ng bone marrow fibroblast ay nagsiwalat ng mga bagong aspeto ng istrukturang organisasyon ng populasyon ng mesenchymal progenitor cells. Ang mga stromal progenitor cells ay natagpuan na may kakayahang maglipat ng isang tiyak na microenvironment para sa lahat ng hematopoietic sprouts nang sabay-sabay, ang bilang nito sa mga malalaking clone na pinag-aralan sa iba't ibang mga modelo ay umaabot mula 5 hanggang 15% (0.5-1.5% ng kabuuang bilang ng mga progenitor cells na nakita). Kasama ng mga clone na naglilipat ng kumpletong microenvironment ng bone marrow, may mga progenitor cells na tinutukoy lamang sa osteogenesis, na, kapag inilipat sa isang bukas na sistema, bumubuo ng bone tissue na hindi sumusuporta sa pagbuo ng hematopoiesis. Ang kanilang bilang mula sa kabuuang bilang ng mga progenitor cell ay 1.5-3%. Ang ilan sa mga selulang ito ay may kakayahang bumuo ng tissue ng buto na may limitadong panahon ng pagpapanatili sa sarili. Dahil dito, ang populasyon ng mga stromal progenitor cells ay heterogenous sa potensyal ng pagkita ng kaibhan nito. Kabilang sa mga ito, mayroong isang kategorya ng mga selula na nagsasabing mga stromal stem cell, na may kakayahang magkaiba sa lahat ng tatlong direksyon na katangian ng bone marrow stromal tissue, na bumubuo ng buto, cartilage, at reticular tissue. Ang ipinakita na data ay nagpapahintulot sa amin na umasa na, gamit ang iba't ibang mga marker ng cell, posible na matukoy ang kontribusyon ng bawat uri ng mga stromal cells sa organisasyon ng isang tiyak na microenvironment at suporta ng hematopoiesis sa mga kultura ng Dexter.

Mga tampok ng mesenchymal stem cell

Sa mga nagdaang taon, naitatag na sa mga nakatigil na kultura ng bone marrow, ang mga multipotent mesenchymal progenitor cells ay kinakatawan ng isang limitadong populasyon ng mga maliliit na agranular cells (RS-1 cells) na nailalarawan sa pamamagitan ng mababang kapasidad na bumubuo ng kolonya at ang kawalan ng pagpapahayag ng Ki-67 antigen na tiyak para sa proliferating cells. Ang mga antigenic na parameter ng dormant RS-1 cells ay naiiba sa spectrum ng antigens ng mabilis na paglaganap ng mga stromal progenitor cells. Ito ay itinatag na ang isang mataas na rate ng paglaganap ng nakatuon na mga selula ng ninuno ay sinusunod lamang sa pagkakaroon ng mga selulang RS-1. Sa turn, pinapataas ng mga cell ng RS-1 ang kanilang rate ng paglago sa ilalim ng impluwensya ng mga kadahilanan na itinago ng mga pinaka-mature na derivatives ng multipotent mesenchymal progenitor cells. Tila ang mga cell ng RS-1 ay isang subclass ng mga hindi nakatuon na MSC na may kakayahang mag-recycle. Sa vitro, ang 5-fluorouracil-resistant bone marrow stromal progenitor cells ay nailalarawan sa mababang nilalaman ng RNA at mataas na pagpapahayag ng ornithine decarboxylase gene, isang marker ng mga di-proliferating na mga cell.

Ang intensive proliferation ng stromal progenitor cells ay nagsisimula pagkatapos ng kanilang fixation sa substrate. Sa kasong ito, ang profile ng marker ng mahinang pagkakaiba-iba ng mga cell ay ipinahayag: SH2 (TGF-(3) receptor), SH3 (signaling protein domain), collagen type I at III, fibronectin, adhesion receptors VCAM-1 (CD106) at ICAM (CD54), cadherin-11, CD44, CD01 (transferin, CD21 receptor) at CD14, ng CD201 (transferin receptor na walang CD14) katangian na mga marker ng hematopoietic stem cells (CD34, CD14, CD45). Ginagawang posible ng clonal growth na paulit-ulit na dumaan ang mesenchymal stem cells na may pagbuo ng maraming genetically homogeneous stromal progenitor pluripotent cells sa kultura. Pagkatapos ng 2-3 mga sipi, ang kanilang bilang ay umabot sa 50-300 milyon. Sa isang kultura na may sapat na density, pagkatapos na huminto ang paglaganap, ang mga stromal progenitor cells, hindi katulad ng hematopoietic tissue fibroblasts, ay naiba sa adipocytes, myocytes, cartilage at bone cells. Isang kumbinasyon ng tatlong regulatory differentiation signal, kabilang ang 1-methyl-isobutylxanthine (isang inducer ng intracellular cAMP formation), dexamethasone (isang inhibitor ng phospholipases A at C) at indomethacin (isang inhibitor ng cyclooxygenase, na binabawasan din ang aktibidad ng thromboxane synthase), na nagko-convert ng hanggang sa 95% ng mga selula ng prochygenitor mepochymal ng prophylaxis. Ang pagbuo ng mga adipocytes mula sa mga immature na elemento ng stromal ay nakumpirma ng pagpapahayag ng lipoprotein lipase gene, histochemical detection ng apolipoproteins at peroxisomal receptors. Ang mga cell ng parehong clone sa ilalim ng impluwensya ng TGF-b sa isang serum-free medium ay lumikha ng isang homogenous na populasyon ng chondrocytes. Ang multilayer cell culture ng cartilaginous tissue na ito ay nailalarawan sa pamamagitan ng nabuong intercellular matrix na binubuo ng proteoglycan at type II collagen. Sa isang nutrient medium na may 10% Ang epekto ng isang differentiation signal complex na binubuo ng b-glycerophosphate (isang inorganic phosphate donor), ascorbic acid at dexamethasone sa parehong kultura ng stromal progenitor cells ay humahantong sa pagbuo ng mga cellular aggregates. Sa ganitong mga cell, ang isang progresibong pagtaas sa aktibidad ng alkaline phosphatase at mga antas ng osteopontin ay sinusunod, na nagpapahiwatig ng pagbuo ng tissue ng buto, ang mineralization ng mga cell na kung saan ay nakumpirma ng isang progresibong pagtaas sa intracellular calcium na nilalaman.

Ayon sa ilang data, ang kakayahan ng mesenchymal stem cell sa walang limitasyong paghahati at pagpaparami ng iba't ibang uri ng mga cell ng mesenchymal differentiation line ay pinagsama sa isang mataas na antas ng plasticity. Kapag ipinasok sa ventricles o white matter ng utak, ang mga mesenchymal stem cell ay lumilipat sa parenchyma ng nervous tissue at nagkakaiba sa mga derivatives ng glial o neuronal cell line. Bilang karagdagan, mayroong impormasyon sa transdifferentiation ng mga MSC sa hematopoietic stem cells kapwa sa vitro at sa vivo. Ang isang mas malalim na pagsusuri sa ilang mga pag-aaral ay natukoy ang isang napakataas na plasticity ng mga MSC, na ipinakita sa kanilang kakayahang mag-iba sa mga astrocytes, oligodendrocytes, neuron, cardiomyocytes, makinis na mga selula ng kalamnan at mga selula ng kalamnan ng kalansay. Ang isang bilang ng mga pag-aaral sa potensyal ng transdifferentiation ng MSCs in vitro at in vivo ay nagtatag na ang multipotent mesenchymal progenitor cells ng bone marrow na pinagmulan ay tuluyang nagkakaiba sa mga cell line na bumubuo ng buto, cartilage, kalamnan, nerve at adipose tissue, pati na rin ang mga tendon at stroma na sumusuporta sa hematopoiesis.

Gayunpaman, nabigo ang iba pang mga pag-aaral na ipakita ang anumang mga palatandaan ng paghihigpit ng pluripotency ng mesenchymal stem cell genome at mga populasyon ng progenitor ng mga stromal cells, bagaman higit sa 200 mga clone ng MSC na nakahiwalay sa isang pangunahing kultura ay pinag-aralan upang subukan ang posibleng pluripotency ng mga stromal cells. Ang napakaraming mga clone sa vitro ay nagpapanatili ng kakayahang mag-iba sa mga direksyon ng osteogenic, chondrogenic, at adipogenic. Kapag hindi kasama ang posibilidad ng paglipat ng cell ng tatanggap sa pamamagitan ng paglipat ng mga mesenchymal stem cell sa ilalim ng kapsula ng bato o sa mga silid ng pagsasabog, lumabas na ang mga stromal progenitor cells sa situ ay nagpapanatili ng isang heterogenous na phenotype, na nagpapahiwatig ng alinman sa kawalan ng mga kadahilanan ng paghihigpit sa transplantation zone o ang kawalan ng MSC pluripotency tulad nito. Kasabay nito, ang pagkakaroon ng isang bihirang uri ng somatic pluripotent stem cell, na karaniwang mga precursor ng lahat ng adult stem cell, ay pinapayagan.

Ang multi-, ngunit hindi pluripotency, ng tunay na mesenchymal stem cell, na bumubuo ng napakaliit na proporsyon ng bone marrow cells at may kakayahang magparami sa ilalim ng ilang mga kundisyon sa panahon ng in vitro cultivation nang walang pagkakaiba, ay pinatunayan ng kanilang sapilitan na pangako sa buto, cartilage, adipose, muscle tissue cells, pati na rin ang mga tenocytes at stromal elements na sumusuporta sa hematopoiesis. Bilang isang patakaran, ang matagal na pagkakalantad sa isang medium ng kultura na may fetal calf serum ay naghihikayat sa pagpapalabas ng mga MSC sa mga nakatuong stromal progenitor cells, na ang mga supling nito ay sumasailalim sa kusang pagkita ng kaibahan ng terminal. Sa vitro, posibleng makamit ang target na pagbuo ng mga osteoblast sa pamamagitan ng pagdaragdag ng dexamethasone, ß-glycerophosphate, at ascorbic acid sa conditioning medium, habang ang kumbinasyon ng dexamethasone at mga signal ng pagkakaiba-iba ng insulin ay nag-uudyok sa pagbuo ng adipocytes.

Naitatag na bago pumasok sa yugto ng pagkita ng kaibahan ng terminal, ang mga bone marrow MSC ay una nang naiba sa fibroblast-like mesenchymal stem cells sa ilalim ng ilang mga kundisyon ng kultura. Ang mga derivatives ng mga cell na ito sa vivo ay nakikilahok sa pagbuo ng mga buto, cartilage, tendon, adipose at tissue ng kalamnan, pati na rin ang stroma na sumusuporta sa hematopoiesis. Naiintindihan ng maraming may-akda ang terminong "multipotent mesenchymal progenitor cells" na ang ibig sabihin ay parehong MSCs mismo at committed stromal progenitor cells ng bone marrow at mesenchymal tissues. Ang clonal analysis ng multipotent mesenchymal progenitor cells na pinagmulan ng bone marrow ay nagpakita na bahagyang higit sa isang-katlo ng lahat ng mga clone ay naiiba sa osteo-, chondro- at adipocytes, habang ang mga cell ng natitirang mga clone ay may potensyal na osteogenic lamang at bumubuo lamang ng chondro- at osteocytes. Ang isang clone ng multipotent mesenchymal progenitor cells gaya ng BMC-9, sa ilalim ng naaangkop na microenvironmental na kondisyon, ay nag-iiba sa mga cell na may phenotype at functional na katangian ng hindi lamang mga osteoblast, chondrocytes, at adipocytes, kundi pati na rin sa mga stromal cells na sumusuporta sa hematopoiesis. Ang isang clone ng RCJ3.1 cells na nakahiwalay sa rat fetal bone marrow ay nag-iba sa mga mesenchymal cells ng iba't ibang phenotypes. Sa ilalim ng pinagsamang pagkilos ng ascorbic acid, b-glycerophosphate, at dexamethasone, ang cellular elements ng clone na ito ay unang bumubuo ng multinuclear myocytes, at pagkatapos, sunud-sunod, adipocytes, chondrocytes, at islets ng mineralized bone tissue. Ang populasyon ng mga butil na selula mula sa periosteum ng mga fetus ng daga ay tumutugma sa hindi nakatalagang multipotent mesenchymal progenitor cells, dahil ito ay nailalarawan sa pamamagitan ng isang mababang rate ng paglaganap, hindi nagpapahayag ng mga marker ng pagkita ng kaibhan, at sa ilalim ng mga kondisyon ng kultura ay nag-iiba upang bumuo ng chondro-, osteo-, at adipocytes, pati na rin ang makinis na mga selula ng kalamnan.

Kaya, dapat itong kilalanin na ang tanong ng pluri- o multipotency ng genome ng mesenchymal stem cell ay nananatiling bukas, na, nang naaayon, ay nakakaapekto rin sa mga ideya tungkol sa potensyal ng pagkita ng kaibhan ng stromal progenitor cells, na hindi pa rin tiyak na itinatag.

Ang isang eksperimento na napatunayan at mahalagang katangian ng mesenchymal stem cell ay ang kanilang kakayahang umalis sa tissue niche at magpalipat-lipat sa pangkalahatang daluyan ng dugo. Upang i-activate ang genetic differentiation program, ang mga naturang circulating stem cell ay dapat pumasok sa naaangkop na microenvironment. Ipinakita na sa sistematikong pagpasok ng mga MSC sa daluyan ng dugo ng mga hayop na tumatanggap, ang mga hindi pa nabubuong selula ay itinatanim sa iba't ibang mga organo at tisyu, pagkatapos ay nag-iiba sa mga selula ng dugo, myocytes, adipocytes, chondrocytes, at fibroblast. Dahil dito, sa mga lokal na tissue zone, ang mga pakikipag-ugnayan ng signal-regulatory ay nagaganap sa pagitan ng uncommitted at committed na stromal progenitor cells, gayundin sa pagitan nila at ng nakapalibot na mga mature na selula. Ipinapalagay na ang pagkita ng kaibhan ay sapilitan ng paracrine regulatory factor ng mesenchymal at non-mesenchymal na pinagmulan (growth factor, eicosanoids, extracellular matrix molecules), na nagbibigay ng spatial at temporal na koneksyon sa microenvironment ng multipotent mesenchymal progenitor cells. Samakatuwid, ang lokal na pinsala sa mesenchymal tissue ay dapat na humantong sa pagbuo ng mga zone ng microenvironment ng multipotent mesenchymal progenitor cells na qualitatively naiiba mula sa complex ng regulatory signal ng buo tissues, kung saan ang physiological sa halip na reparative regeneration na mga proseso ay nangyayari. Ang pagkakaibang ito ay lubhang mahalaga sa mga tuntunin ng pagdadalubhasa ng cellular phenotype sa normal at pinsala-sapilitan na microenvironment.

Ayon sa mga konsepto, narito na ang mga mekanismo ng pangunahing pagkakaiba sa pagitan ng dalawang kilalang proseso - physiological regeneration at inflammatory proliferation - ay naka-embed. Ang una sa kanila ay nagtatapos sa pagpapanumbalik ng dalubhasang komposisyon ng cellular ng tissue at ang pag-andar nito, habang ang resulta ng pagpapatupad ng proseso ng paglaganap ay ang pagbuo ng mga mature na nag-uugnay na mga elemento ng tissue at ang pagkawala ng pag-andar ng nasirang tissue zone. Kaya, upang bumuo ng pinakamainam na mga programa para sa paggamit ng mga multipotent mesenchymal progenitor cells sa regenerative-plastic na gamot, isang masusing pag-aaral ng mga tampok ng epekto ng microenvironmental na mga kadahilanan sa pagkita ng kaibahan ng mga MSC ay kinakailangan.

Ang pag-asa ng istraktura ng stem cell compartment sa cellular para- at autocrine regulators, ang pagpapahayag nito ay na-modulate ng mga panlabas na signal, ay walang pag-aalinlangan. Kabilang sa mga function ng regulatory factor, ang pinakamahalaga ay ang kontrol ng asymmetric division ng MSCs at pagpapahayag ng mga gene na tumutukoy sa mga yugto ng commitment at ang bilang ng mga cell division. Ang mga panlabas na signal, kung saan nakasalalay ang karagdagang pag-unlad ng mga MSC, ay ibinibigay ng kanilang microenvironment. Sa isang immature na estado, ang mga MSC ay lumalaganap nang mahabang panahon, habang pinapanatili ang kakayahang mag-iba sa mga linya ng adipocytes, myofibroblast, hematogenous tissue stroma, cartilage at bone cells. Ito ay itinatag na ang isang limitadong populasyon ng CD34-negatibong stromal cellular elements na nagpapalipat-lipat sa dugo ay bumabalik mula sa pangkalahatang daluyan ng dugo patungo sa bone marrow stroma, kung saan ito ay binago sa mga linya ng CD34-positive hematopoietic stem cells. Iminumungkahi ng mga obserbasyong ito na ang recirculation ng progenitor mesenchymal cells sa bloodstream ay nagpapanatili ng balanse ng tissue ng stromal stem cells sa iba't ibang organo sa pamamagitan ng pagpapakilos ng isang karaniwang pool ng mga hindi pa nabubuong stromal na elemento ng bone marrow. Ang pagkita ng kaibhan ng mga MSC sa mga cell na may maraming mesenchymal phenotypes at ang kanilang pakikilahok sa pagbabagong-buhay o pag-aayos ng buto, cartilage, adipose tissue at tendons sa vivo ay napatunayan gamit ang adoptive transfer models sa mga eksperimentong hayop. Ayon sa iba pang mga may-akda, ang malayong paglipat ng mga MSC sa kahabaan ng vascular bed ay pinagsama sa maikling distansya o lokal na paggalaw ng multipotent mesenchymal progenitor cells sa loob ng tissue sa panahon ng pag-aayos ng cartilage, pagbabagong-buhay ng kalamnan at iba pang mga proseso ng pagpapanumbalik.

Ang mga lokal na reserbang stem ng stromal tissue base ay kumikilos bilang isang mapagkukunan ng mga cell sa mga proseso ng pagbabagong-buhay ng physiological tissue at pinupunan ng malayong transportasyon ng mga MSC habang ang mga mapagkukunan ng stem ng stromal-tissue ay natupok. Gayunpaman, sa mga kondisyon ng pangangailangan para sa emerhensiyang pagpapakilos ng reparative cellular potential, halimbawa, sa kaso ng polytrauma, ang buong echelon ng MSC ay nakikibahagi sa mga proseso ng reparative regeneration, at ang mesenchymal progenitor cells ng bone marrow ay na-recruit sa periphery sa pamamagitan ng pangkalahatang daloy ng dugo.

Paglipat ng mesenchymal stem cell

Ang ilang mga parallel ay maaaring masubaybayan sa pagitan ng mga proseso ng physiological tissue regeneration at ang kanilang pagbuo sa panahon ng intrauterine development. Sa embryogenesis ng tao at mammalian, ang pagbuo ng iba't ibang uri ng mga espesyal na selula ay nangyayari mula sa ecto-, meso-, at endodermal pool ng mga layer ng mikrobyo, ngunit may obligadong partisipasyon ng mesenchyme. Ang maluwag na cellular network ng embryonic mesenchymal tissue ay gumaganap ng maraming regulatory, metabolic, framework, at morphogenetic function. Ang pagtula ng mga provisional organ ay nangyayari lamang pagkatapos ng condensation ng mesenchyme dahil sa clonogenic growth ng progenitor cells, na bumubuo ng pangunahing morphogenetic signal ng organogenesis. Ang mga stromal derivatives ng embryonic mesenchyme ay lumilikha ng cellular framework ng mga pansamantalang organo at bumubuo ng batayan para sa kanilang hinaharap na supply ng enerhiya-plastic dahil sa paglaki ng pangunahing mga daluyan ng dugo at lymphatic. Sa madaling salita, ang mga elemento ng stromal ng microcirculatory unit ng fetal organ ay lumitaw bago ang pagbuo ng kanilang mga istruktura at functional unit. Bilang karagdagan, ang aktibong paglipat ng mga mesenchymal cells sa panahon ng organogenesis ay nagbibigay ng spatial na oryentasyon ng pagbuo ng mga organo sa pamamagitan ng pagmamarka ng kanilang mga hangganan ng dami sa pamamagitan ng paghihigpit ng mga homeotic na Hox-type. Ang stromal framework ay nagsisilbi rin bilang batayan para sa pagpupulong ng mga istruktura at functional na mga yunit ng parenchymatous organ, na kadalasang kinabibilangan ng morphogenetically at functionally ganap na magkakaibang mga cell. Dahil dito, sa panahon ng embryogenesis, ang mga pag-andar ng mesenchyme ay pangunahin at natanto sa pamamagitan ng pagbuo ng mga signal ng regulasyon na nagpapagana ng rehiyonal na paglaganap at pagkita ng kaibahan ng mga progenitor epithelial cells. Ang mga embryonic mesenchyme cells ay gumagawa ng mga growth factor tulad ng HGF-b, HGF-b, CSF, kung saan ang mga parenchymal progenitor cells ay may kaukulang mga receptor. Sa iba't ibang mature na tissue ng isang adult na organismo, ang stromal network ng mga cell ay bumubuo rin ng mga signal upang mapanatili ang posibilidad at paglaganap ng mga progenitor cells na hindi mesenchymal na pinagmulan. Gayunpaman, ang spectrum ng stromal regulatory signal sa postnatal ontogenesis ay iba (SCF, HGF, IL-6, IL-1, IL-8, IL-11, IL-12, IL-14, IL-15, GM-CSF, flt-3, LIF, atbp.) at naglalayong tiyakin ang physiological regeneration ng tissue o repairs. Bukod dito, ang mga spectral na katangian ng stromal regulatory factor sa bawat uri ng tissue at maging sa loob ng isang organ ay magkakaiba. Sa partikular, ang hematopoiesis at lymphopoiesis na may paglaganap at pagkita ng kaibhan ng hematopoietic at immunocompetent na mga cell ay nangyayari lamang sa ilang mga organo, sa loob ng mga hangganan kung saan gumagana ang stromal microenvironment, na nagbibigay ng mga kondisyon para sa pagkahinog ng hematopoietic at lymphoid cells. Ang kakayahan ng mga hematopoietic at lymphoid cells na muling mapunan ang isang partikular na organ, dumami at mature sa mga microstructural niches nito ay nakasalalay sa mga regulatory factor ng microenvironment.

Kabilang sa mga bahagi ng extracellular matrix na gumagawa ng multipotent mesenchymal progenitor cells, fibronectin, laminin, collagen at proteoglycans, pati na rin ang CD44 (hyaluronan at osteopontin receptor), ay dapat pansinin, na may malaking bahagi sa pag-aayos ng mga intercellular na pakikipag-ugnayan at pagbuo ng extracellular matrix sa bone marrow at bone tissue. Napatunayan na ang bone marrow multipotent mesenchymal progenitor cells ay lumikha ng stromal microenvironment na nagbibigay ng inductive at regulatory signal hindi lamang sa mga MSC, kundi pati na rin sa mga hematopoietic progenitor at iba pang non-mesenchymal stem cell ng bone marrow. Ito ay kilala na ang pakikilahok ng mga MSC sa hematopoiesis ay tinutukoy ng kanilang kakayahang mag-iba sa mga stromal cells na sumusuporta sa hematopoiesis, at ang nakapagtuturong signal na ito ay natanggap ng mga MSC nang direkta mula sa mga hematopoietic stem cell. Ito ang dahilan kung bakit sa kultura ang network ng stromal progenitor cells ay nagsisilbing feeder base para sa pagbuo ng lahat ng clone ng hematopoietic cells.

Sa isang mature na organismo, ang intensity ng hemo- at lymphopoiesis ay nasa isang estado ng dinamikong equilibrium na may "paggasta" ng mga mature na selula ng dugo at mga selula ng immune system sa paligid. Dahil ang mga stromal cells ng bone marrow at lymphoid organs ay napakabihirang na-renew, ang makabuluhang restructuring ng stromal structures sa kanila ay hindi nagaganap. Ang sistema ay maaaring alisin sa dynamic na ekwilibriyo sa pamamagitan ng mekanikal na pinsala sa alinman sa mga organo ng hemo- o lymphopoiesis, na humahantong sa magkatulad na mga pagbabago sa pagkakasunud-sunod na hindi lamang at hindi lamang sa hematopoietic o lymphoid na mga elemento bilang mga stromal na istruktura ng nasirang organ. Sa proseso ng reparative regeneration, ang stromal base ay unang nabuo, na pagkatapos ay repopulated ng hematopoietic o immunocompetent cells. Ang matagal nang kilalang katotohanang ito ay gumagawa ng post-traumatic regeneration na isang maginhawang modelo para sa pag-aaral ng stromal microenvironment ng hematopoietic organs. Sa partikular, ang mekanikal na pag-alis ng laman ng medullary cavity ng tubular bones ay ginagamit upang pag-aralan ang reparative regeneration ng bone marrow - curettage, na nagbibigay-daan para sa mabilis at epektibong pag-alis ng hematopoietic tissue mula sa estado ng dynamic na balanse. Kapag pinag-aaralan ang mga proseso ng reparative regeneration ng hematopoietic at stromal na bahagi ng bone marrow pagkatapos ng mekanikal na pag-alis ng medullary cavity ng tibia ng guinea pig, natagpuan na walang direktang ugnayan sa pagitan ng mga indeks ng pagbabagong-buhay ng hematopoietic at stromal cells (ang bilang ng mga hematopoietic cells, ang konsentrasyon at bilang ng mga stromal cells). Bilang karagdagan, ito ay naka-out na ang isang pagtaas sa populasyon ng stromal progenitor cells ay nangyayari sa isang mas maagang oras pagkatapos ng curettage, at ang stromal fibroblasts mismo ay nagiging phosphatase-positive, na tipikal ng osteogenic tissue. Napag-alaman din na ang curettage ng 3-5 tubular bones ay humahantong sa paglaki ng populasyon ng cell na ito sa bone marrow ng mga di-operated bones at maging sa spleen, na sa guinea pig ay isang eksklusibong lymphopoietic organ.

Ang morphological na larawan ng mga proseso ng reparative sa bone marrow ng curetted tibiae ng guinea pig sa pangkalahatan ay tumutugma sa data na inilarawan sa panitikan na nakuha sa mga eksperimento sa mga hayop ng iba pang mga species, at ang dynamics ng mga pagbabago na nagaganap pagkatapos ng pag-alis ng hematopoietic tissue ay pareho para sa lahat ng mga species ng hayop at ang pagkakaiba ay may kinalaman lamang sa mga parameter ng oras. Morphologically, ang phase order ng hematopoiesis restoration sa emptied medullary cavity ay binubuo ng sunud-sunod na proseso ng blood clot organization, pagbuo ng coarse fibrous bone tissue, resorption nito, pag-unlad ng sinusoids at pagbuo ng reticular stroma, na kasunod na repopulated ng hematopoietic elements. Sa kasong ito, ang bilang ng mga progenitor hematopoietic cells sa proseso ng bone marrow tissue regeneration ay tumataas kasabay ng pagtaas ng nilalaman ng hematopoietic stem cells.

Yu. Inihambing ni Gerasimov at mga co-authors (2001) ang mga pagbabago sa bilang ng mga hematopoietic na selula at ang bilang ng mga stromal progenitor cells sa mga indibidwal na yugto ng proseso ng pagbabagong-buhay. Ito ay lumabas na ang dami ng mga pagbabago sa mga selula ng utak ng buto sa curetteted bone ay tumutugma sa dinamika ng mga morphological na katangian ng pagbabagong-buhay. Iniuugnay ng mga may-akda ang pagbaba sa nilalaman ng cellular sa regenerate sa unang tatlong araw sa pagkamatay ng mga hematopoietic cells dahil sa hindi kanais-nais na epekto ng microenvironment na nilikha ng proliferating reticular tissue sa napanatili na bone marrow sa rehiyon ng epiphysis, pati na rin sa pagbuo ng osteoid tissue foci sa huli at pinsala sa vascular sa panahon ng curettage. Sa ika-7-12 na araw, ang pagtaas sa antas ng mga nucleated na selula ay kasabay ng paglitaw ng indibidwal na foci ng myeloid hematopoiesis sa mga zone ng paglaganap ng mga elemento ng stromal. Sa ika-20 araw, lumilitaw ang mga makabuluhang lugar ng regenerated bone marrow at well-developed sinuses, na sinamahan ng isang makabuluhang pagtaas sa kabuuang bilang ng mga cell. Gayunpaman, ang bilang ng mga elemento ng hematopoietic sa panahong ito ay 68% ng antas ng kontrol. Ito ay pare-pareho sa naunang nai-publish na data na ang bilang ng mga hematopoietic na selula pagkatapos ng curettage ay umabot sa pamantayan lamang sa ika-35-40 araw pagkatapos ng operasyon.

Sa unang bahagi ng post-traumatic period, ang pangunahing mapagkukunan para sa pagpapanumbalik ng hematopoiesis ay mga lokal na elemento ng cellular na napanatili sa panahon ng curettage. Sa mga huling yugto, ang pangunahing pinagmumulan ng pagbabagong-buhay ng bone marrow hematopoietic tissue ay ang mga stem cell na nagpapanumbalik ng mga libreng stromal zone. Tulad ng para sa mga indibidwal na kategorya ng mga stromal cells (endothelial, reticular at osteogenic), ang mga mapagkukunan na nagsisiguro ng kanilang pagbuo sa panahon ng muling pag-aayos ng bone marrow cavity ay nananatiling hindi maliwanag. Ang mga resulta ng pag-aaral ni Yu. Ipinapahiwatig ni V. Gerasimov at mga kapwa may-akda (2001) na sa bone marrow na napanatili pagkatapos ng curettage, ang konsentrasyon ng mga cell na bumubuo ng mga kolonya ng fibroblast ay makabuluhang mas mataas kaysa sa normal na bone marrow. Naniniwala ang mga may-akda na ang curettage ay nagreresulta sa isang mas masinsinang selective washout ng hematopoietic cells kumpara sa colony-forming stromal cells, na lumalahok sa pagbuo ng stroma at mas malakas na nauugnay sa pangunahing substance nito kaysa sa hematopoietic cells.

Ang dynamics ng pagbabago sa bilang ng mga cell na bumubuo ng mga kolonya ng fibroblast ay nauugnay sa intensity ng mga proseso ng osteogenesis, kasunod na resorption ng bone trabeculae at pagbuo ng reticular stroma, na kung saan ay populated ng hematopoietic cells. Karamihan sa mga stromal progenitor cells sa tinukoy na mga tuntunin ng pagbabagong-buhay ay bumubuo ng magaspang na fibrous bone tissue at reticular stroma. Sa kaso ng femoral fractures sa ilalim ng mga kondisyon ng matagal na osteosynthesis, sa ika-5 araw sa regeneration zone ang konsentrasyon at bilang ng mga cell na bumubuo ng fibroblast colonies ay tumataas, at sa panahon ng intensive bone formation ang kanilang bilang ay tumataas ng 6 na beses. Ito ay kilala na ang mga selula ng utak ng buto na bumubuo ng mga kolonya ng fibroblast ay may mga katangian ng osteogenic. Ang bilang ng mga stromal progenitor cells ay tumataas bago ang settlement ng curetted bone marrow na teritoryo ng hematopoietic cells. Ito ay nasa mabuting pagsang-ayon sa data na ang mga stromal cells ay nagbibigay ng pagbuo ng isang hematopoietic microenvironment. Tila, ang paglikha ng isang hematopoietic microenvironment ay tumutugma sa isang tiyak na antas ng pagbabagong-buhay ng stromal tissue, at ang bilang ng mga hematopoietic cell ay tumataas sa pagpapalawak ng stromal platform na angkop para sa hematopoiesis.

Ang pinakamalaking interes ay ang data ng mga may-akda na kaagad pagkatapos ng curettage ang bilang ng mga stromal progenitor cells sa malalayong bahagi ng balangkas ay tumataas. Simula sa ikaanim na oras at hanggang sa ikadalawampung araw kasama, ang isang higit sa dalawang beses na pagtaas sa parehong konsentrasyon at ang bilang ng mga cell na bumubuo ng mga kolonya ng fibroblast ay sinusunod sa contralateral tibia. Ang mekanismo ng hindi pangkaraniwang bagay na ito ay malamang na nauugnay sa katotohanan na ang napakalaking pinsala sa utak ng buto ay humahantong sa pagbuo ng isang malaking bilang ng mga clots ng dugo na may sabay-sabay na pagkasira ng isang makabuluhang bilang ng mga platelet at ang paglabas ng platelet-derived growth factor (PDGF) sa dugo, na kilala na nagiging sanhi ng paglaganap ng mga selula na bumubuo ng mga kolonya ng fibroblast na matatagpuan sa katawan sa labas ng proliferative pool. Sa mga eksperimento sa mga kuneho, ang lokal na pangangasiwa ng mga MSC ay nagtataguyod ng pagpapanumbalik ng tisyu ng kartilago ng kasukasuan ng tuhod na nasira sa operasyon, na maaaring maiugnay sa pagbuo ng mga chondrocytes na nagmula sa mga iniksyon na MSC. Gayunpaman, ang reparative regeneration ng mga depekto sa buto sa mga daga ng laboratoryo ay makabuluhang pinahusay sa pamamagitan ng paggamit ng mga mesenchymal stem cell na nakapaloob sa isang ceramic framework. Samakatuwid, maaari itong ipagpalagay na kung hindi RBOC, kung gayon ang ilang iba pang kadahilanan na nagmula sa mga nasirang stromal cells ay nagdudulot ng isang malayong nakapagpapasigla na epekto sa paglaganap ng mga mesenchymal progenitor cells sa mga buo na bone marrow zone at pinasisigla ang kanilang paglipat sa lugar ng depekto sa bone marrow. Kaugnay nito, ito ay sinasalungat ng data ng panitikan mula sa mga nakaraang taon na nagpapahiwatig na ang mga stromal cells na responsable para sa microenvironment, hindi tulad ng mga hematopoietic cells, ay hindi may kakayahang lumipat at nagmula sa mga lokal na mapagkukunan.

Gayunpaman, ang mga resulta ng pag-aaral ni Yu. Ipinapahiwatig ni Gerasimov at co-authors (2001) na ang mekanikal na trauma ay nagdudulot hindi lamang ng isang matalim na muling pagsasaayos ng stromal tissue sa curetted bone, kundi pati na rin ang mga makabuluhang pagbabago sa stroma sa malayong buo na buto, ibig sabihin, mayroong isang sistematikong tugon ng stromal tissue sa lokal na trauma. Bukod dito, kapag ang polytrauma ay naidulot - maramihang curettage - ang reaksyong ito ay pinahusay at sinusunod hindi lamang sa pinaandar na buto at malalayong bahagi ng balangkas, kundi pati na rin sa mga lymphoid organ, lalo na sa pali. Ang mekanismo ng naturang sistematikong tugon ng stromal tissue ng bone marrow at spleen sa lokal na trauma at polytrauma ay nananatiling hindi kilala. Ipinapalagay na ang prosesong ito ay nauugnay sa pagkilos ng isang humoral factor na itinago ng mesenchymal stroma ng medullary cavity ng bone marrow. Ang posibilidad ng paggawa ng mga stromal cells ng bone marrow at spleen ng isang organ-nonspecific humoral factor na responsable para sa paglaganap ng mga cell na bumubuo ng fibroblast colonies ay napatunayan ng data sa kanilang aktibidad na nagpapasigla sa kolonya sa mga monolayer na kultura ng bone marrow.

Sa pagsasaalang-alang na ito, nararapat na tandaan na sa systemic na pangangasiwa ng mga multipotent mesenchymal progenitor cells, ang kanilang mga derivatives ay muling namumulaklak hindi lamang sa utak ng buto, kundi pati na rin sa iba pang mga tisyu, na ginagamit, lalo na, para sa gene therapy. Ipinakita na sa intravenous administration ng malalaking dami ng MSCs na may wild-type na genome sa mga daga na may mutation sa collagen I gene, pinapalitan ng mga donor cell ang hanggang 30% ng mga cell sa buto at cartilage tissue ng mga tatanggap, at ang inilipat na mouse mesenchymal stem cells na naglalabas ng IL-3 ng tao ay epektibong sumusuporta sa hematopoiesis na mga cell ng tao sa loob ng 9 na buwan. immunodeficient na mga daga.

[ 3 ], [ 4 ], [ 5 ], [ 6 ], [ 7 ], [ 8 ], [ 9 ], [ 10 ]

Ang genetic modification ng mesenchymal stem cells

Kabilang sa mga tagumpay ng eksperimentong genetic modification ng MSCs, nararapat na tandaan ang paglipat ng factor IX gene sa mga MSC ng tao na may kasunod na paglipat ng mga transfectant cell sa immunodeficient na mga daga, na humahantong sa paglitaw ng antihemophilic factor B sa dugo sa loob ng 8 linggo pagkatapos ng paglipat. Sa eksperimentong ito, ang post-translational modification ng factor IX ng y-glutamyl carboxylase ay isinagawa sa mga nailipat na cell. Ang transduction ng MSCs na may retroviral vector encoding human factor IX ay hindi gaanong matagumpay - ang kasunod na pangangasiwa ng mga cell na ito sa isang aso na may hemophilia B ay nagbigay ng therapeutic level ng factor IX, na nagpapanatili ng normal na intensity ng coagulation hemostasis, sa loob lamang ng 12 araw.

Ang paglipat ng mga mesenchymal stem cell sa parenkayma ng utak ng mga hayop ay nagpakita na ang mga donor na wala pa sa gulang na mga cell ay binago sa parehong neuronal at glial na populasyon. Ang engraftment ng neuronal derivatives ng malusog na donor na mesenchymal tissue ay theoretically na ginagawang posible na iwasto ang genetic abnormalities ng metabolismo ng utak sa mga pasyente na may Gaucher disease at iba pang mga karamdaman ng lipid, ganglioside, o carbohydrate metabolism.

Ang pang-eksperimentong paghahanap para sa mga kondisyon para sa transdifferentiation ng bone marrow stromal stem cells sa neural at liver tissue progenitor cells ay nagpapatuloy. Ang atensyon ng mga mananaliksik ay nakatuon sa mga kumbinasyon ng mga inducer ng pagkita ng kaibhan at espesyal na nakakondisyon na media. Sa partikular, upang ihiwalay ang pangunahing kultura ng mga stromal cells, ang mga cell ng bone marrow ay hinugasan at muling sinuspinde sa DMEM/F12 (1/1) na medium ng kultura na may 10% na fetal calf serum ay ibinuhos sa density na 200,000/cm2. Pagkatapos ng 24 na oras, ang mga hindi nakadikit na mga cell ay aalisin, at ang mga tulad ng fibroblast na mga cell na nakakabit sa plastic ay itinatanim sa loob ng isang linggo. Para sa pagkita ng kaibahan ng bone marrow stromal cells sa mga neuroblast, ginagamit ang isang nakakondisyon na medium na nakuha sa pamamagitan ng tatlong araw na paglilinang ng pangunahing kultura ng mouse embryonic fibroblasts, pati na rin ang DMEM/F12 medium (1/1) na may 2% fetal calf serum at ang pagdaragdag ng 20 ng/ml NF o 10-6 M na retinoinducers ng mouse ay ginagamit para sa iba't ibang neuroinducers ng mouse. embryonic stem cells). Ang pagkita ng kaibhan ng bone marrow stromal cells sa hepatocyte precursor cells ay na-induce sa isang conditioned medium na nilikha bilang resulta ng tatlong araw na paglilinang ng pangunahing kultura ng mouse embryonic liver cells sa DMEM/F12 medium (1/1) kasama ang pagdaragdag ng 10% fetal calf serum.

Dito dapat tandaan muli na ang mga selulang bumubuo ng kolonya ng bone marrow stroma ay heteromorphic at maaaring nahahati sa dalawang uri. Kasama sa unang uri ang mga selulang tulad ng fibroblast na bumubuo ng filopodia na may malalaking nuclei at isa o dalawang nucleoli. Ang pangalawang uri ay kinakatawan ng maliliit na hugis spindle na mga cell. Kapag nililinang ang mga cell ng parehong uri sa isang nakakondisyon na medium na nakuha sa isang feeder layer ng pangunahing mouse embryonic fibroblast, ang mga cell na katulad ng mga neuroblast ay lilitaw sa kultura sa ika-3 hanggang ika-4 na araw. Sa yugtong ito, kadalasan ay mayroon silang hugis spindle na may isa o dalawang mahabang proseso na nagtatapos sa filopodia. Hindi gaanong karaniwan ang mga pyramidal o stellate na mga cell na may maikling dendrite. Ang mga dendrite ng ilang neuroblast ay may mga katangiang pagpapalawak (growth buds) at mga sanga sa kanilang distal na bahagi, habang ang iba ay may natatanging growth cone na may filopodia, kung saan lumalaki ang mga dendrite. Ang mga magkatulad na tampok na morphological (mga buds at growth cones na may filopodia) na likas sa mga neuroblast na naiiba sa mga neuron ay inilarawan nang detalyado sa mga pag-aaral sa neurogenesis. Batay dito, ang ilang mga may-akda ay naghihinuha na ang mga selulang natagpuan nila sa kultura ay mga neuroblast. Sa partikular, sina E. Shchegelskaya at mga kapwa may-akda (2002) pagkatapos mag-kultura ng isang pangunahing kultura ng mga stromal cells sa loob ng dalawang linggo sa isang nakakondisyon na daluyan ay nagbago tuwing ika-3 hanggang ika-4 na araw ay natagpuan na ang ilan sa mga selula ay dumami habang pinapanatili ang isang hindi nakikilalang estado. Sa panlabas, ang mga naturang cell ay kahawig ng mga fibroblast at nakita sa kultura kasama ang pagkakaiba-iba ng mga neuroblast. Ang karamihan ng mga cell (mga 80%) ay nasa iba't ibang yugto ng pagkita ng kaibhan sa mga selula ng nervous tissue, pangunahin sa mga neuron. Ang mga dendritik na proseso ng mga cell na ito ay malapit na nakikipag-ugnayan sa isa't isa, kaya't ang mga cell ay unti-unting nabuo ang mga seksyon ng nervous network sa substrate sa anyo ng mahabang multicellular strands. Ang mga dendritik na proseso ng mga neuroblast ay naging mas mahaba, ang ilan sa kanila ay lumampas sa haba ng katawan ng neuron mismo ng 8-10 beses. Unti-unting tumaas ang proporsyon ng mga pyramidal at stellate cells. Nagsanga ang mga dendrite ng mga stellate cells. Ayon sa mga may-akda, ang mamaya pagkita ng kaibhan ng pyramidal at stellate cells kumpara sa spindle-shaped na mga cell ay tumutugma sa pagkakasunud-sunod ng mga yugto ng normal na neurogenesis sa mga hayop. Bilang resulta, napagpasyahan ng mga may-akda na ang bone marrow stromal stem cells ay sumasailalim sa sapilitan na neurogenesis, kung saan ang lahat ng tatlong pangunahing uri ng mga neuron ay nabuo mula sa mga neuroblast sa vitro. Natuklasan din ang mga pasimula ng nerve cell sa panahon ng paglilinang ng bone marrow stromal cells sa loob ng 3-4 na araw sa isang daluyan na may 2% fetal serum at 20 ng/ml LIF. Ngunit sa kasong ito, ang mga stem cell ay nahahati nang napakabagal, ang pagkakaiba-iba ng neuroblast ay naganap lamang sa 30% ng mga kaso at hindi sila bumubuo ng mga neuronal network. Paggamit ng retinoic acid bilang isa sa mga inducers ng nerve cell differentiation, Ang mga may-akda ay nakakuha ng hanggang 25-30% ng nerve cells sa kultura,na may mga elemento ng glial na nakararami - mga astrocytes at oligodendrocytes. Ang mga neuron ay bumubuo lamang ng isang katlo ng lahat ng mga selula ng nerbiyos, bagama't sila ay kinakatawan ng lahat ng tatlong uri: hugis spindle, pyramidal at stellate na mga cell. Sa ika-6 na araw ng pag-culture ng mga stromal cells sa isang daluyan na may retinoic acid, ang mga nerve cell ay naging mas naiiba, at ang mga axon ay natagpuan sa mga indibidwal na pyramidal neuron, na sa normal na neuroontogenesis ay lumilitaw sa ibang pagkakataon kaysa sa pagbuo ng mga dendritik na proseso. Ayon sa mga may-akda, sa kabila ng mababang ani ng mga nerve cell, ang retinoic acid induction method ay may mga pakinabang nito: ang mga oligodendrocytes at astrocytes ay nagsasagawa ng myelinating at nutritional function sa panahon ng paglaki ng mga dendrite at axon at kinakailangan para sa normal na pagbuo ng nerve tissue. Samakatuwid, para sa pag-aayos ng mga nasirang lugar nito sa vivo, mas mainam na gumamit ng suspensyon ng mga neuron na pinayaman ng mga glial cells.

Sa ikalawang serye ng mga eksperimento, tinangka ng mga may-akda na himukin ang pagkakaiba-iba ng mga selula ng stromal ng utak ng buto sa mga selula ng atay. Pagkatapos ng tatlong araw ng pag-culture ng bone marrow stromal stem cell sa isang nakakondisyon na medium na nakuha sa pamamagitan ng pag-incubate ng mouse embryonic hepatocytes, malaki, spherical cell ang natagpuan, kadalasang binuclear, na may mga cytoplasmic inclusion na may iba't ibang laki. Ang mga cell na ito ay nasa iba't ibang yugto ng pagkita ng kaibhan at naiiba sa laki, bilang ng mga nuclei, at mga pagsasama sa cytoplasm. Ang Glycogen ay nakita sa karamihan ng mga cell na ito, sa batayan kung saan kinilala sila ng mga may-akda bilang mga hepatocyte precursor cells. Dahil walang mga cell na katulad ng mga neuroblast ang natagpuan sa kultura, napagpasyahan na ang nakakondisyon na daluyan na nakuha bilang isang resulta ng pag-culture ng mga embryonic hepatocytes ay kulang sa pagkakaiba-iba ng mga kadahilanan ng mga selula ng nerbiyos at, sa kabaligtaran, ay naglalaman ng mga kadahilanan na nag-uudyok sa pagkita ng kaibahan ng mga cell ng bone marrow stromal sa mga cell ng hepatocyte precursor. Sa konklusyon, iminumungkahi ng mga may-akda ang pagkakaroon ng pluripotency sa bone marrow stromal cells, dahil nagkakaiba sila sa vitro sa nerve o liver tissue cells depende sa partikular na nakakondisyon na media at inducers na ginamit.

Ang ilang mga pag-aaral ay talagang naipakita nang tama ang pagkita ng kaibahan ng bone marrow stromal cells sa mga cardiomyocytes, cartilage, bone at nerve tissue cells. Mayroong katibayan na sa mga selula ng utak ng buto ay may mga populasyon ng mga stem cell na may kakayahang mag-iba sa mga hepatocytes. Sa liwanag ng mga datos na ito, ang mga resulta ng mga eksperimento sa itaas sa mga daga ay maaari pa ring isaalang-alang na karagdagang kumpirmasyon ng presensya sa bone marrow ng pluripotent mesenchymal stem cells na may kakayahang mag-iba sa mga cell ng iba't ibang mga tisyu ng isang pang-adultong organismo.

Paglipat ng mesenchymal stem cell

Sa klinikal na transplantology, ang mga mesenchymal stem cell ng tao ay maaaring gamitin upang matiyak ang pagpapalawak ng mga hematopoietic stem cell, pati na rin ang kanilang mga maagang precommitted na inapo. Sa partikular, ang pagpapakilala ng mga autologous hematopoietic stem cell at MSC sa mga pasyente ng cancer pagkatapos ng high-dosis na chemotherapy ay nagpapabilis sa pagpapanumbalik ng bilang ng mga neutrophil at platelet sa peripheral na dugo. Ang mga allo- at autologous transplant ng mesenchymal stem cell ay ginagamit upang gamutin ang maramihang myeloma, aplastic anemia at spontaneous thrombocytopenia - mga sakit na nauugnay sa isang pangunahing depekto sa stroma ng hematopoietic tissue. Ang kahusayan ng cell therapy sa oncohematological patolohiya ay sa maraming mga kaso na mas mataas na may sabay-sabay na pagpapakilala ng stromal at hematopoietic stem cell, na kung saan ay ipinahayag sa pamamagitan ng isang pagbawas sa postoperative panahon ng hematopoiesis restoration, isang pagbawas sa bilang ng mga nakamamatay na kinalabasan dahil sa non-pumipili pagkawasak ng rehiyon at nagpapalipat-lipat na mga selula ng kanser, kung saan ang mga selula ng progenitor hematopoie ng pasyente ay nagmamay-ari din. Ang mga prospect ng paggamit ng mga MSC at iba pang multipotent mesenchymal progenitor cells sa klinikal na kasanayan ay dahil sa kamag-anak na kadalian ng pagkuha ng mga ito mula sa bone marrow aspirates, pagpapalawak sa kultura at paglipat ng mga therapeutic genes. Kasabay nito, ang lokal na pagtatanim ng multipotent mesenchymal progenitor cells ay maaaring gamitin upang mabawi ang mga lokal na depekto sa tissue, at sa kaso ng systemic dysfunctions ng mga tisyu ng mesenchymal na pinagmulan, ang kanilang pagpapakilala sa pangkalahatang daluyan ng dugo ay hindi ibinubukod.

Ang mga may-akda ng mga gawa, kung saan ang mga prospect para sa paggamit ng mga MSC para sa lokal, systemic transplantation at gene therapy ay sinusuri mula sa punto ng view ng stromal cell biology, ay mas maingat sa kanilang pangangatwiran. Ang postnatal bone marrow ay tradisyonal na itinuturing bilang isang organ na binubuo ng dalawang pangunahing sistema ng malinaw na tinukoy na mga linya ng cell - ang hematopoietic tissue mismo at ang sumusuportang stroma na nauugnay dito. Samakatuwid, ang bone marrow mesenchymal stem cells ay una na itinuturing na eksklusibo bilang isang mapagkukunan ng stromal na batayan para sa paggawa ng mga regulatory factor ng hematopoietic microenvironment. Pagkatapos ang atensyon ng mga mananaliksik ay lumipat sa pag-aaral ng papel ng mga MSC bilang isang stem source ng skeletal tissues. Ang pinakabagong data ay nagpapahiwatig ng isang hindi inaasahang potensyal para sa pagkita ng kaibahan ng bone marrow stromal cells na may pagbuo ng neural o muscle tissue. Sa madaling salita, ang mga mesenchymal stem cell ay nagpapakita ng transgermal plasticity - ang kakayahang mag-iba sa mga uri ng cell na phenotypical na hindi nauugnay sa mga cell ng orihinal na tissue. Kasabay nito, ang ilang mga aspeto ng biology ng bone marrow stromal cells ay nananatiling hindi malinaw at hindi nalutas pareho sa pangkalahatang biological na termino at sa mga indibidwal na detalye, kabilang ang pagkakakilanlan, kalikasan, pinagmulan, pag-unlad at pag-andar sa vivo ng bone marrow stromal cells, pati na rin ang pinahihintulutang pagkita ng kaibhan potensyal ex vivo at ang mga posibilidad ng therapeutic na paggamit sa vivo. Ang data na nakuha sa potensyal ng mga MSC, pati na rin ang mga resulta ng mga pag-aaral ng pagbabagong-buhay na potensyal ng iba pang mga stem cell, ay nasa matalim na pagkakasalungatan sa mga dogma na itinatag sa biology.

Kapag na-culture sa mababang density, ang bone marrow stromal stem cell ay bumubuo ng mga natatanging kolonya, bawat isa ay nagmula sa iisang progenitor cell. Ang porsyento ng mga stromal progenitor cells sa nucleated bone marrow cells, na tinutukoy ng kakayahan sa pagbuo ng kolonya, ay lubos na nakadepende sa parehong mga kondisyon ng kultura at MSC species. Halimbawa, sa mga rodent, ang pagkakaroon ng mga irradiated bone marrow feeder cells at serum sa kultura ay ganap na kinakailangan upang makuha ang maximum na bilang ng mga stromal progenitor cells, samantalang sa mga tao, ang kahusayan sa pagbuo ng kolonya ng mesenchymal stem cell ay independiyente sa parehong feeder at medium ng kultura. Limitado ang bilang ng mga kilalang mitogenic factor na nagpapasigla sa paglaganap ng stromal progenitor cell. Kabilang dito ang PDGF, EGF, FGF, TGF-b, at IGF1. Sa ilalim ng pinakamainam na kondisyon ng kultura, ang mga polyclonal MSC na linya ay maaaring makatiis ng higit sa 50 cell division sa vitro, na ginagawang posible na makakuha ng bilyun-bilyong bone marrow stromal cells mula sa 1 ml ng aspirate nito.

Gayunpaman, ang populasyon ng bone marrow stromal cells ay heterogenous, na ipinakikita ng parehong pagkakaiba-iba sa mga laki ng kolonya, iba't ibang mga rate ng kanilang pagbuo, at iba't ibang cellular morphology, na sumasaklaw sa hanay mula sa fibroblast-like spindle-shaped hanggang sa malalaking flat cells. Sa panahon ng pag-unlad ng naturang mga kultura, ang phenotypic heterogeneity ay nabanggit din pagkatapos ng 20 araw. Ang ilang mga kolonya ay nailalarawan sa pamamagitan ng mataas na pagpapahayag ng alkaline phosphatase, ang iba ay hindi ipinapahayag ito sa lahat, at ang mga kolonya ng ikatlong uri ay phosphatase-positibo sa gitnang rehiyon at phosphatase-negatibo sa paligid. Ang mga indibidwal na kolonya ay bumubuo ng mga nodule ng bone tissue (ang simula ng matrix mineralization ay minarkahan sa pamamagitan ng paglamlam ng alizarin red o para sa calcium ayon kay Van Koss). Sa iba pang mga kolonya, nangyayari ang akumulasyon ng taba, na kinilala sa pamamagitan ng G-staining na may pula ng langis. Mas madalas, ang mga kolonya ng mesenchymal stem cell ay bumubuo ng mga cartilage na nabahiran ng Alcian blue).

Pagkatapos ng ectopic transplantation sa mga eksperimentong hayop, ang polyclonal MGK lines ay bumubuo ng ectopic bone na may reticular stroma na nauugnay sa myelopoiesis at adipocytes, at, mas madalas, na may cartilage tissue. Kapag ang mga monoclonal na linya ng bone marrow stromal cells ay inilipat, ang chimerism ay sinusunod sa ilang mga kaso, kung saan ang de novo bone ay binubuo ng bone tissue cells, naglalaman ng stroma at adipocytes ng donor origin, habang ang mga cell ng hematopoietic lineage at ang vascular system ay nagmula sa tatanggap.

Kinumpirma ng mga resulta ng mga pag-aaral na ito ang stem nature ng bone marrow stromal progenitor cell kung saan nagmula ang clonal line. Ipinapahiwatig din nila na hindi lahat ng mga cell clonogenic sa kultura ay tunay na multipotent stem cell. Naniniwala ang ilang mananaliksik, at ibinabahagi namin ang kanilang opinyon, na ang pinaka-maaasahang impormasyon sa tunay na potensyal ng pagkakaiba-iba ng mga indibidwal na clone ay makukuha lamang sa vivo pagkatapos ng paglipat, at hindi sa pamamagitan ng pagtukoy sa phenotype ng kanilang mga derivatives sa vitro. Ang pagpapahayag sa kultura ng mga phenotypic marker ng osteo-, chondro-, o adipogenesis (na tinutukoy ng mRNA o ng histochemical techniques) at maging ang produksyon ng mineralized matrix ay hindi sumasalamin sa antas ng pluripotency ng isang indibidwal na clone sa vivo. Samakatuwid, ang pagkakakilanlan ng mga stem cell sa isang pangkat ng mga stromal cells ay posible lamang sa isang posteriori, sa ilalim ng naaangkop na mga kondisyon ng isang biological transplantation assay. Sa partikular, ang chondrogenesis ay napakabihirang sinusunod sa mga bukas na sistema ng paglipat, samantalang ang pagbuo ng kartilago ay malayo sa hindi pangkaraniwan sa mga saradong sistema tulad ng mga silid ng pagsasabog o in vitro micromass na mga kultura ng mga stromal cells, kung saan nakamit ang lokal na mababang pag-igting ng oxygen, na nagtataguyod ng pagbuo ng tissue ng cartilage. Samakatuwid, kahit na ang pamamaraan ng paglipat, pati na rin ang hindi tiyak na mga kondisyon ng kultura ng vitro, ay makabuluhang nakakaapekto sa saklaw ng pagkakaiba-iba ng MSC.

Ang pang-eksperimentong paglipat sa ilalim ng tinukoy na mga kundisyong pang-eksperimento ay ang pamantayang ginto para sa pagtukoy sa potensyal ng pagkita ng kaibhan ng bone marrow stromal cells at isang pangunahing elemento sa kanilang pagkakakilanlan. Sa kasaysayan, ang mga pag-aaral sa bone marrow stromal cell transplantation ay nauugnay sa pangkalahatang problema ng bone marrow transplantation. Ito ay itinatag na ang hematopoietic microenvironment ay nilikha sa pamamagitan ng paglipat ng bone marrow stromal cell lines at nagbibigay ng ectopic development ng hematopoietic tissue sa transplantation zone. Ang pinagmulan ng microenvironment mula sa donor, at ang hematopoietic tissue mula sa host ay nagpapahintulot sa amin na isaalang-alang ang ectopic bone bilang isang tunay na "inverted" bone marrow transplantation. Ang lokal na paglipat ng bone marrow stromal cells ay nagtataguyod ng epektibong pagwawasto ng mga depekto sa buto, na mas malinaw kaysa sa kusang reparative regeneration. Ang ilang mga preclinical na pag-aaral sa mga eksperimentong modelo ay nakakumbinsi na nagpakita ng posibilidad ng paggamit ng bone marrow stromal cell transplants sa orthopedics, kahit na ang pinakamaingat na trabaho at pagsusuri ay kinakailangan upang ma-optimize ang mga pamamaraang ito, kahit na sa pinakasimpleng mga kaso. Sa partikular, ang pinakamainam na kondisyon para sa pagpapalawak ng osteogenic stromal cells ex vivo ay hindi pa naitatag, ang istraktura at komposisyon ng perpektong carrier, pati na rin ang bilang ng mga cell na kinakailangan para sa volumetric bone regeneration, ay nananatiling hindi nabuo.

Bilang karagdagan sa paggamit ng ex vivo na pinalawak na bone marrow stromal cells para sa pagbabagong-buhay ng mga tisyu ng mesenchymal na pinagmulan, ang unorthodox plasticity ng MSCs ay nagbubukas ng mga potensyal na aplikasyon para sa pagbabagong-buhay ng mga neural cells o ang paghahatid ng mga produkto ng gene sa CNS. Sa prinsipyo, pinapasimple nito ang cell therapy para sa pinsala sa nervous system, dahil hindi na kailangang kumuha ng autologous human neural stem cells. Ang mga potensyal na aplikasyon ng mga cell ng bone marrow para sa pagbuo ng mga cardiomyocytes at myogenic progenitor cells ng parehong tunay na stromal at extrastromal na pinagmulan ay naiulat.

Ang mga eksperimento ay isinasagawa sa systemic transplantation ng bone marrow stromal cells para sa paggamot ng mga karaniwang skeletal disease. Walang alinlangan na ang bone marrow stromal cells ay ang populasyon na responsable para sa genetic disorder sa skeletal disease, na kung saan ay mahusay na inilarawan ng vector transfer ng genetic na impormasyon gamit ang mga cell na ito, na humahantong sa pagbuo ng pathological bone tissue sa mga eksperimentong hayop. Gayunpaman, ang kakayahan ng mga stromal cell na magtanim, mag-ukit, mag-proliferate at mag-iba sa mga buto ng kalansay pagkatapos ng pagpapakilala sa pangkalahatang daluyan ng dugo ay hindi pa napatunayan.

Ito ay bahagyang dahil sa karaniwang bone marrow transplantation ang stroma ay hindi inilipat kasama ng hematopoietic tissue, kaya mahigpit na pamantayan para sa pagtatasa ng matagumpay na pag-engraftment ng systemically administered stromal cells ay hindi pa nabubuo. Dapat alalahanin na ang pagkakaroon ng mga marker gene sa mga extract ng tissue o ang paghihiwalay ng mga cell ng donor na pinagmulan sa kultura ay hindi nagpapahiwatig ng engraftment ng mga cell, ngunit ang kanilang kaligtasan lamang. Kahit na ang intra-arterial injection ng bone marrow stromal cells sa isang mouse limb ay maaaring humantong sa halos zero engraftment, sa kabila ng katotohanan na ang mga cell na pinagmulan ng donor ay matatagpuan sa malaking bilang sa loob ng bone marrow microvasculature. Sa kasamaang palad, ang mga naturang cell ay karaniwang inilarawan bilang "naka-engraft" sa batayan lamang ng pagtuklas ng mga marker genes para sa mga donor cell sa ex vivo culture. Bilang karagdagan, ang nakakumbinsi na katibayan ng pangmatagalang pagsasama ng magkakaibang at gumaganang aktibong mga selula ng pinagmulan ng donor sa mga tisyu na pinag-aaralan ay dapat ibigay. Sa maraming nai-publish na mga papeles na nag-uulat sa pag-ukit ng bone marrow stromal cells sa skeleton, ang kawalan ng malinaw na data ng ganitong uri ay kapansin-pansin. Gayunpaman, dapat tandaan na ang ilang mga tamang eksperimento sa hayop ay talagang nagtatag ng isang limitado ngunit tunay na pag-ukit ng mga stromal progenitor cells pagkatapos ng kanilang sistematikong pangangasiwa.

Ang mga datos na ito ay pare-pareho sa mga resulta ng mga pag-aaral sa posibilidad ng paghahatid ng bone marrow myogenic progenitor cells sa kalamnan sa pamamagitan ng vascular system. Gayunpaman, hindi dapat kalimutan na ang parehong skeletal at muscle tissue ay nabuo sa panahon ng pag-unlad at paglaki batay sa extravascular cell movements na gumagamit ng mga proseso ng migration na walang kinalaman sa sirkulasyon ng dugo. Kung ang isang independiyenteng circulatory pathway para sa paghahatid ng mga progenitor cells sa solid phase tissue ay umiiral, posible bang ipalagay ang pagkakaroon ng physiologically circulating mesenchymal progenitor cells? Ano ang pinagmulan ng mga cell na ito sa parehong pagbuo at postnatal na organismo, at paano sila tumagos sa vascular wall? Ang solusyon sa mga tanong na ito ay tila ganap na kinakailangan at nangangailangan ng pinakamaingat na preclinical analysis. Kahit na matapos mahanap ang mga sagot sa mga tanong na ito, ang mga may problemang kinetic na aspeto na nauugnay sa paglaki ng skeletal at pag-remodel ng connective tissue ay mananatiling hindi nalutas. Kasabay nito, ang paggamot ng mga karamdaman sa osteogenesis sa pamamagitan ng pagpapalit ng buong populasyon ng mga mutated skeletal progenitor cells na may malusog na mga elemento ng stromal ay lumilitaw na isang tunay na klinikal na pag-asa. Sa kasong ito, ang mga lokal na fracture zone o mga deformasyon dahil sa pathological osteogenesis, pati na rin ang mga mapanirang pagbabago sa bone tissue, ay maaaring itama gamit ang stromal stem cell na naka-culture sa vitro. Samakatuwid, ipinapayong ituon ang pananaliksik sa hinaharap sa mga problema ng pagbabago o genetic correction ng autologous mutated osteogenic progenitor cells ex vivo.

Ang genetic engineering ng mga cell, panandalian o permanente, ay naging batayan ng cellular at molecular biology, ang pinagmulan ng maraming siyentipikong pagtuklas tungkol sa papel ng mga indibidwal na protina sa cellular metabolism sa vitro at in vivo. Ang paggamit ng mga teknolohiyang molekular para sa pagwawasto ng namamana na patolohiya at mga sakit ng tao ay napaka-promising para sa praktikal na gamot, dahil ang mga katangian ng bone marrow stromal stem cell ay ginagawang posible na bumuo ng mga natatanging pamamaraan ng paglipat para sa pagwawasto ng mga genetic na sakit ng balangkas. Kasabay nito, ang mga mesenchymal precursor cells ay madaling makuha mula sa hinaharap na tatanggap, sila ay pumapayag sa genetic manipulation at may kakayahang dumami sa maraming dami sa isang maikling panahon. Ang paggamit ng mesenchymal stem cell ay nagbibigay-daan sa isa na maiwasan ang mga limitasyon at panganib na nauugnay sa paghahatid ng genetic information material nang direkta sa pasyente sa pamamagitan ng intravascular vector constructs. Ang isang katulad na diskarte ay naaangkop sa mga embryonic stem cell, ngunit ang mga autologous postnatal bone marrow stromal cells ay isang mas kanais-nais na materyal, dahil ang kanilang pagpapakilala ay hindi kasama ang mga posibleng immunological post-transplant na komplikasyon. Upang makamit ang isang panandaliang epekto, halimbawa, upang mapabilis ang pagbabagong-buhay ng buto, ang pinakamainam na paraan ay ang genetic modification ng mesenchymal stem cells gamit ang electroporation, chemical fusion, lipofection, plasmids at adenoviral constructs. Sa partikular, ang paglipat ng viral sa bone marrow stromal cells BMP-2 ay napatunayang epektibo sa pagpapabilis ng pagbabagong-buhay ng buto sa eksperimentong polytrauma. Ang paglikha ng mga adenoviral vector constructs ay lalong kanais-nais dahil sa kawalan ng toxicity. Gayunpaman, ang genetic modification ng bone marrow stromal cells sa kasong ito ay nailalarawan sa pamamagitan ng napakababang katatagan. Bilang karagdagan, ang normal na transformed bone marrow stromal cells ay nangangailangan ng paggamit ng mga vector carrier ng genetic na impormasyon na 10 beses na mas nakakahawa kaysa sa iba pang mga uri ng cell, na makabuluhang pinatataas ang porsyento ng pagkamatay ng mga nailipat na mga cell.

Ang paggamot sa mga recessive na sakit na dulot ng mababa o zero na biological na aktibidad ng ilang partikular na gene ay nangangailangan ng pangmatagalan o permanenteng pagbabago ng mesenchymal stem cell, na nangangailangan ng paggamit ng mga virus na nauugnay sa adeno, retrovirus, lentivirus o adeno-retroviral chimera. Ang mga transport region ng mga virus na ito ay may kakayahang maglipat ng malalaking DNA transfects (hanggang 8 kb). Ang siyentipikong panitikan ay naiulat na sa exogenous biological na aktibidad ng bone marrow stromal cells na inilipat sa retroviral constructs na nag-encode ng synthesis ng regulatory at marker molecules - IL-3, CD2, factor VIII, pati na rin ang mga enzyme na kasangkot sa synthesis ng L-DOPA. Gayunpaman, kahit na sa mga pag-aaral na ito, itinuro ng mga may-akda ang ilang mga limitasyon na kailangang malampasan bago ang praktikal na aplikasyon ng teknolohiyang ito. Ang unang problema ay ang pag-optimize ng proseso ng MSC modification ex vivo. Ito ay kilala na ang pangmatagalang (3-4 na linggo) na paglaganap ng bone marrow stromal cells sa vitro ay binabawasan ang kanilang paglipat. Kasabay nito, upang makamit ang isang mataas na antas ng genetic modification ng MSCs, kinakailangan na magsagawa ng ilang mga transfection cycle. Ang pangalawang problema ay nauugnay sa tagal ng therapeutic gene expression, na hindi lalampas sa apat na buwan pa. Ang natural na pagbaba sa epektibong pagpapahayag ng gene ay dahil sa hindi aktibo ng promoter at pagkamatay ng mga binagong selula. Sa pangkalahatang mga prospect ng paglilipat ng genetic na impormasyon gamit ang mesenchymal stem cells, ang mga resulta ng mga paunang pag-aaral ay nagpapahiwatig ng pangangailangan para sa karagdagang pag-optimize ng mga ex vivo transfection na pamamaraan, ang pagpili ng isang sapat na promoter na kumokontrol sa biological na aktibidad sa nais na direksyon, at isang pagtaas sa kakayahan ng binagong bone marrow stromal cells sa pagpapanatili ng sarili sa vivo pagkatapos ng paglipat. Dapat pansinin na ang paggamit ng mga retroviral construct para sa pagbabago ng bone marrow stromal cells sa nais na direksyon ay hindi palaging nangangailangan ng kanilang ipinag-uutos na engraftment. Ang mga nailipat na mesenchymal stem cell ay maaaring magsagawa ng corrective function laban sa background ng stable residency at walang ipinag-uutos na aktibong pisikal na pagsasama at gumagana sa connective tissue. Sa kasong ito, dapat silang isaalang-alang bilang isang biological mini-pump na gumagawa sa vivo isang kadahilanan, ang kakulangan nito ay tumutukoy sa pagpapakita ng genetic pathology.

Ang paggamit ng mga nabagong bone marrow stromal cells para sa paggamot ng nangingibabaw na genetic pathology, na kung saan ay nailalarawan sa pamamagitan ng pagpapahayag ng isang gene na may pathological o abnormal na biological na aktibidad, ay mas may problema, dahil sa kasong ito kinakailangan upang harangan ang paglipat o pagpapatupad ng pangit na impormasyon ng genetic. Ang isa sa mga pamamaraan ng genetic engineering ay homologous recombination ng mga embryonic stem cell upang makalikha ng mga transgenic na hayop. Gayunpaman, ang napakababang antas ng homologous recombination kasama ang mga problema sa pagkilala, paghihiwalay at pagpapalawak ng naturang mga recombinant ay malamang na hindi makatutulong sa malawakang paggamit ng pamamaraang ito sa malapit na hinaharap, kahit na ang mga bagong teknolohikal na pamamaraan ay binuo. Ang pangalawang diskarte sa gene therapy ng nangingibabaw na patolohiya ay batay sa awtomatikong pagwawasto ng nasirang DNA, dahil ang genetic mutations ay maaaring itama sa pamamagitan ng pagpapakilala ng exogenous DNA na may nais na pagkakasunod-sunod (maikling DNA oligonucleotides o chimeric RNA/DNA oligonucleotides), na nagbubuklod sa mga homologue sa nasirang genome. Ang ikatlong opsyon ay nagsasangkot ng pagharang sa paghahatid ng pathological na impormasyon, na nakakamit sa pamamagitan ng paggamit ng mga partikular na idinisenyong oligonucleotides na nagbubuklod sa isang partikular na gene upang bumuo ng isang ternary helical na istraktura na nag-aalis ng posibilidad ng transkripsyon.

Bagama't ang pagwawasto ng isang genetic na sakit sa antas ng genome ay nananatiling pinakamainam at ginustong therapeutic method, ang mRNA ay isa ring promising vector (posibleng mas madaling ma-access) para sa pagharang sa isang nangingibabaw na negatibong gene. Ang mga molekula ng protina na may antisense oligonucleotide o kumpletong mga pagkakasunud-sunod na humaharang sa mRNA na nagbubuklod sa cellular biosynthetic apparatus ay matagal nang ginagamit upang pigilan ang pagsasalin at/o pataasin ang pagkasira ng mRNA. Bilang karagdagan, ang double-stranded na RNA ay nag-uudyok ng mabilis na pagkasira ng mRNA, ang mekanismo nito ay nananatiling hindi maliwanag. Gayunpaman, hindi malamang na ang pag-aalis lamang ng mga mRNA na na-transcribe mula sa isang mutant allele na may maikli o solong mutasyon ay magtataguyod ng pagpapahayag ng mRNA ng normal na allele. Ang isang alternatibo ay ang paggamit ng hammerhead at hairpin ribosynthesis, na may kakayahang magbigkis sa mga partikular na rehiyon ng mRNA na may kasunod na induction ng kanilang cleavage at inactivation sa panahon ng pagsasalin. Ang posibilidad ng paggamit ng pamamaraang ito sa therapy ng pathological osteogenesis ay kasalukuyang pinag-aaralan. Anuman ang eksaktong target - genomic o cytoplasmic na mga elemento, ang tagumpay ng mga bagong teknolohiya ng gene therapy ay matutukoy sa pamamagitan ng kahusayan ng pagsasama ng mga reagents sa bone marrow stromal cells ex vivo, ang pinakamainam na pagpili ng isang tiyak na vector at ang matatag na kakayahan ng mesenchymal stem cell na ipahayag ang mga kinakailangang kadahilanan sa vivo.

Kaya, ang pagtuklas ng mga mesenchymal stem cell na may kanilang mga hindi inaasahang katangian ay lumilikha ng isang bagong haka-haka na pamamaraan para sa pagbuo ng mga linya ng cell. Gayunpaman, ang karagdagang interdisciplinary na pananaliksik ay kinakailangan upang maunawaan ang biological na papel ng stromal stem cell, ang kanilang kalikasan, ang kanilang kakayahang mag-transdifferentiate o mag-dedifferentiate, ang kanilang pisyolohikal na kahalagahan sa panahon ng pag-unlad ng embryonic, postnatal growth, maturation at pagtanda, pati na rin sa mga sakit ng tao.