Ang nonviral gene therapy ay nag-aalok ng pag-asa para sa talamak na sakit sa likod

Sa isang kamakailang pag-aaral na inilathala sa journal Biomaterials, ang mga mananaliksik ay bumuo ng isang nobelang non-viral gene therapy upang gamutin ang discogenic back pain (DBP) sa pamamagitan ng paghahatid ng transcription factor na Forkhead Box F1 ( FOXF1) gamit ang engineered extracellular vesicles (eEVs) sa degenerative intervertebral discs (IVDs) in vivo.

Ang

Chronic low back pain (LBP) ay isang lumalaking pandaigdigang problema dahil sa tumatanda nang populasyon at lumalalang mga problema sa opioid. Kasama sa mga kasalukuyang paggamot ang panandaliang lunas o mamahaling operasyon, na nagbibigay-diin sa pangangailangan para sa mga hindi nakakahumaling at hindi gaanong invasive na mga therapy.

Ang mga kasalukuyang biological na therapies, kabilang ang growth factor administration, cell therapy, at viral gene therapies, ay maaaring mabawasan ang degeneration sa mga modelo ng hayop at tao. Gayunpaman, ang mga alalahanin tulad ng panandaliang epekto, mahinang pangmatagalang bisa, at hindi kinakailangang immunogenicity at tumorigenicity ay maaaring pumigil sa direktang paggamit ng mga pamamaraang ito.

Sa pag-aaral na ito, nagtatag ang mga mananaliksik ng non-viral gene therapy para sa intervertebral disc degeneration (IVD) gamit ang FOXF1-eEV.

Inilipat ng mga mananaliksik ang pangunahing mouse embryonic fibroblast (PMEFs) na may plasmid na naglalaman ng FOXF1 o pCMV6 bilang kontrol at nailalarawan ang mga sample ng eEV gamit ang nanoparticle tracking assay (NTA).

Tinasa nila ang mahusay na pag-load ng molecular cargo sa mga eEV gamit ang quantitative reverse transcription-polymerase chain reaction (qRT-PCR) at conventional PCR. Natukoy ng pagsusuri sa Western blot ang FOXF1 at mga tiyak na protina ng EV sa mga pormasyon ng eEV. Gumamit ang team ng mga plasmid na nagpapahusay sa upstream at downstream na mga rehiyon ng polylinker upang matukoy ang presensya ng FOXF1 plasmid DNA sa mga donor cell at bumuo ng mga eEV.

Sinuri nila ang buong mRNA na ginawa mula sa plasmid DNA sa mga eEV at donor cell.

Gumawa ang mga mananaliksik ng mga extracellular vesicle na may mga transcription factor upang maibalik ang function ng tissue at baguhin ang mga tugon sa pananakit sa isang modelo ng hayop ng DBP.

Natukoy nila ang mga EV para i-transport at ipamahagi ang FOXF1 sa mga nasirang intervertebral disc sa isang mouse model ng discogenic back pain upang matukoy ang FOXF1 eEV inhibition ng intervertebral disc degeneration.

Pinagsama-sama ng team ang biomechanical testing ng mouse intervertebral discs na may imaging, extracellular matrix (ECM) na pagbabago, at mga tugon sa pananakit na nasuri pagkatapos ng 12 linggo upang kumpirmahin ang mga pagbabago sa istraktura at paggana, pati na rin ang sakit na dulot ng therapeutic intervention.

Preoperative at posttreatment pain assessments kasama ang micro-computed tomography (micro-CT), magnetic resonance imaging (MRI), mechanical tests, Alcian blue (AB) at picrosirius red (PSR) staining, dimethylmethylene blue test, at immunohistochemistry (IHC ) ).

Kasangkot sa pag-aaral ang isang surgical technique kung saan ang mga mananaliksik ay nag-inject ng Buprenorphine ER subcutaneously sa mga daga upang makontrol ang postoperative pain.

Nagsagawa ang team ng mga pagsusuri sa pag-uugali bago ang operasyon at bawat dalawang linggo mula apat hanggang labindalawang linggo pagkatapos ng operasyon, gamit ang iba't ibang diskarte gaya ng open field test, cold plate, tail suspension, at wire suspension.

Tinasa ng open field test ang kusang aktibidad ng mga daga; ang mga pagsubok sa malamig na plato ay sinusukat ang thermal hyperalgesia; Sinusukat ng mga pagsusuri sa suspensyon ng buntot ang axial pain; at sinukat ng mga pagsubok sa pagsususpinde ng wire ang lakas.

Labindalawang linggo pagkatapos ng operasyon, hiniwalay ng team ang mga lumbar spine ng mga hayop, gamit ang femoral nerve at artery tracing upang matukoy ang mga intervertebral disc sa pagitan ng L4 at L5, L5 at L6, at L6 at S1 IVD. Gumamit sila ng L5/L6 IVD para suriin ang histology at tukuyin ang glycosaminoglycan (GAG) content.

Lubos na binawasan ng mga FOXF1 eEV ang mga tugon sa pananakit habang nire-restore ang istraktura at paggana ng IVD, kabilang ang mga pagpapahusay sa taas ng disc, tissue hydration, proteoglycan content, at mga mekanikal na katangian.

Nakatuon ang pag-aaral sa pagpapalabas ng mga FOXF1-loaded na eEV mula sa mga pangunahing fibroblast na inilipat gamit ang FOXF1 transcription factor. Nagpakita ang quantitative RT PCR ng makabuluhang pagtaas sa mga antas ng transcript ng FOXF1 mRNA at mga antas ng transcript ng FOXF1 na buong haba na na-transcribe kumpara sa mga cell na inilipat gamit ang pCMV6.

Maaaring mabawasan ng FOXF1 eEV therapy ang mga tugon sa pananakit sa isang lumbar disc puncture mouse model nang hanggang 12 linggo. Ang mga babaeng daga ay nagpakita ng mas mahabang oras ng pagkuha sa FOXF1-treated group kaysa sa lesioned group, na tumagal nang hindi bababa sa 12 linggo pagkatapos ng paggamot.

Pinahusay ng FOXF1 eEV therapy ang hydration at IVD tissue height sa mga nasugatan at degenerative na hayop sa vivo habang pinapanatili ang mga antas ng hydration at T2-weighted IVD image intensity.

Gayunpaman, napansin ng team ang pagbaba ng taas ng disc sa mga sugatang hayop at hayop na ginagamot ng pCMV6 eEV. Ang mga daga na ginagamot sa FOXF1 eEV ay walang pagbawas sa taas ng disc 12 linggo pagkatapos ng paggamot. Hindi naimpluwensyahan ng kasarian ang mga functional na resulta.

Ibinalik ng mga FOXF1 eEV ang mekanikal na paggana ng mga nasira at nabulok na IVD sa vivo. Sa ilalim ng axial stress, ang FOXF1 eEV-treated IVDs ay nagpakita ng mas mataas na normalized NZ stiffness kumpara sa mga nasirang IVD.

Sa ilalim ng mga kondisyon ng creep, ang mga nasirang IVD ay nagpakita ng mas mataas na normalized na creep displacements, na nagpapahiwatig ng pagbaba sa normalized na creep elastic stiffness.

Ipinapakita ng mga resulta na ang pagbabawas ng nilalaman ng GAG sa mga nasirang IVD ay nagpapataas ng mekanikal na flexibility, ngunit pinipigilan ng eEV therapy ang pagkawala ng glycosaminoglycan at mga kasunod na pagbabago sa mekanikal na paggana.

Ang mga FOXF1 eEV ay nagdulot ng mga pagbabago sa istruktura at functional sa IVD sa pamamagitan ng pagtaas ng antas ng mga proteoglycan at GAG.

Ipinakita ng mga resulta ng pag-aaral na ang mga eEV na puno ng developmental transcription factors ay maaaring gumamot sa mga masasakit na joint disease gaya ng DBP sa pamamagitan ng paghahatid ng mga transcription factor na ito sa mga degenerative at masakit na IVD joints.

Maaaring makatulong ang diskarteng ito na bawasan ang mga structural at functional na abnormalidad na dulot ng sakit, gayundin ang pag-regulate ng mga tugon sa pananakit na partikular sa kasarian.

Inirerekomenda din ng mga mananaliksik ang paggamit ng mga developmental transcription factor gaya ng FOXF1 para i-convert ang mga degenerative NP cells sa isang pro-anabolic na estado sa vivo. Ang karagdagang pananaliksik ay kailangan upang matukoy ang therapeutic effect nito.