Embryonic stem cells

Ang pagkatuklas ng embryonic cell stem - walang aksidente, at lumitaw sa inihandang research lupa sa larangan ng pag-unlad biology pananaliksik. Ang salitang "stem cell" ay ipinakilala sa medisina hanggang sa 1908 sa kongreso ng lipunan ng hematolohiko sa Berlin ni Alexander Maksimov kaugnay ng mga selulang hematopoietic. Long bago ang paghihiwalay at paghahanda ng matatag na linya ng pluripotent embryonic cell stem sa unang bahagi ng pag-unlad ng proseso ng pananaliksik na ginagamit stem terato- (embrayo-kanser na bahagi cell na kung saan nag-aral ng hindi kilalang mekanismo ng embryogenesis, kasama na ang pagkakasunod-sunod ng ang expression ng maagang gene at protina produkto ng kanilang trabaho.

Ngunit ang totipotency ng tao genome irreparably nawala sa proseso ng ebolusyon? Hindi, at ang embryogenesis ay patunay. Kung ito ay gayon, kung kailan, sa prinsipyo, ang pangalawang landas ng evolutionary development ay maisasakatuparan? Marahil, kapag ang isang tao ay umalis sa Cosmos, kung saan ang mga kondisyon ng kapaligiran ay magiging tapat sa loob ng mahabang panahon. Bone pagkawala (buto demineralization sa isang walang timbang estado) napakabagal tumututol remodeling at pagbabagong-buhay ay maaaring isinasaalang-alang bilang ang unang hakbang sa human proseso adaptation bilang isang species ng pag-iral sa espasyo. Gayunpaman, ang pagbabayad para sa ikalawang landas ng evolutionary development ay magkakaiba - ang pagkabaog ay ang presyo na babayaran sa lahat ng mga cell ng totipotency at absolute plasticity. Kaya multiply sa mundo na ito ng "evolutionary chameleons" ay walang meiosis, otpochkovaniem. Ngunit mabubuhay tayo nang matagal. Ang imortalidad ng Telomerase ay ang imortalidad ng amoeba. Sa isang multisellular organism, ang stem cell ay ang substrate ng quantitative at qualitative longevity.

[1], [2], [3], [4]

Pinagmumulan ng mga cell stem ng embryonic

Ngayon pinagkukunan ng embryonic cell stem para sa mga pagsubok laboratoryo ay Line murine teratocarcinoma (129 / sv, F19, F8, Zin 40, CGR 86, Rl, CCE, JM-1, E14TG2a, CGRSb) at teratocarcinoma ng tao (NTERA-2, TERA-2 , H-9 clone), pati na rin Hess Trauneona. Gayunman, ang pagkakaroon ng detalyadong cellular passport na nagpapahiwatig immune phenotype, chromosome resulta sa pagtatasa ng mRNA profiles expression nakalantad receptors at protina intracellular pagbibigay ng senyas ay hindi matumbasan para sa mga makabuluhang drawbacks teratokartsinomnyh linya ESC - mabilis na pagkawala ng totipotency at hindi ikapangyayari ng application sa klinikal na pagsubok, at halo-halong pagkita ng kaibhan sa kultura ay napakahirap upang ihiwalay malinis nakalaang linya mula sa isang magkakaiba populasyon ng mga cell. Samakatuwid, karaniwan ay isang pinagmulan ESC linya na ginawa para sa mga klinikal na mga layunin, ay nagsisilbi bilang ng inner cell mass ng blastocyst, embryo indibidwal blastomeres ng 8-cell yugto ng pag-unlad, mga cell morula mamaya yugto, at pangunahing mikrobyo cell.

Dapat pansinin na ang mga teratocarcinoma cells, bagaman mayroon silang ari-arian ng pluripotency, ay may mas mababang potensyal na pluripotent kumpara sa ESC. Ang kanilang pagsasama sa mga embryonic cell ay bihirang humahantong sa pagbuo ng chimeras, kung saan, bilang karagdagan, ang gametes na may genotype ng teratocarcinoma cells ay hindi nabuo. Ito ay pinaniniwalaan na ito ay dahil sa ang madalas na paglitaw sa panahon ng cell kultura teratocarcinoma chromosomal abnormalities: pagkawala ng Y kromosoma, trisomy iba't-ibang, pagtanggal o translocations.

Ang mga pagsisikap upang makilala ang tao ESC na linya ay ginawa maraming beses, ngunit ang gawaing ito ay hindi malulutas, dahil ang mga normal na tao blastocysts ay mahirap i-access ang mga bagay. Bilang karagdagan, sa mga tao, ang dalas ng mga chromosomal abnormalities ay mas mataas kaysa sa embryogenesis ng mga hayop. Ang nangingibabaw na karamihan ng mga unang embryo ng tao na nakuha pagkatapos ng vitro pagpapabunga nagpapakita ng magulong chromosomal mosaicism at madalas may mga numerical at structural aberrations. Kahit na mamaya, sa yugto ng blastocyst, 20-25% lamang ng mga embryo ng tao ang binubuo ng mga selula na may normal na karyotype. Halos imposibleng gamitin ang mga embryo upang lumikha ng isang ESC, yamang ang mga zygote ay karaniwang pinag-aralan sa mga yugto ng dalawa o apat na blastomeres at pagkatapos ay inilipat sa matris. Ang relatibong kamakailan lamang ay isang maaasahang pamamaraan na binuo para sa paglilinang ng fertilized ovules ng tao sa yugto ng blastocyst. Ang pagpapakilala ng pamamaraan na ito sa pagsasagawa ng in vitro fertilization ay hindi lamang nadagdagan ang dalas ng matagumpay na implantasyon ng kinalabasan, ngunit ginawa rin ang normal na blastocysts ng isang mas mapupuntahan na bagay.

Ang isa pang pluripotent stem cell source ay ang pangunahing cell kasarian, kung saan, sa kaibahan sa mga mas advance na mga populasyon progenitor germenativnogo epithelium, ay hindi sa ibabaw ng beta-integrin, ngunit ipahayag ang mataas na aktibidad shelochnoy phosphatase. Dapat pansinin na sa eksperimento, ang populasyon ng mga stem cell, na nabuo mula sa mga pangunahing selula ng sex, ay pinag-aralan mula noong dekada 80 ng huling siglo. Kasabay nito, ang isang pamamaraan para sa paghihiwalay ng mga pangunahing mga selula ng mikrobyo mula sa rudiment ng mouse embryo gonad ay binuo. Ang unang matagumpay na mga resulta ng culturing primordial mikrobiyo cell sa vitro nagmumungkahi ng pagkawalang-saysay ng mga pagsusumikap na ito, pati na ang mga cell, kahit na survived, ngunit hindi ilaganap at namatay sa loob ng unang araw. Mamaya ito ay natagpuan na ang pangunahing murine mikrobyo cell ilaganap sa vitro sa presensya ng lamang sa kultura medium ng kalutasan at lamad-bound tiyak na polypeptide paglago kadahilanan. Maraming aaral ay may ipinahiwatig na ito ay kinakailangan ang presensya sa kultura medium hindi lamang LIF, ngunit membrannosvyazannyh at Steel nalulusaw kadahilanan (SIF) para sa kaligtasan ng buhay at paglaganap ng primordial mikrobiyo cell. Ang mga peptides ay nagawa sa pamamagitan ng somatic cell embryo homozygous para sa mga pagbago ng Steel, at isa sa kanila ay isang ligand ng proto-oncogene cKit.

Ang mga pangunahing mga cell ng mikrobyo ng mammals at mga tao ay mula sa extragonaladal at ang pinagmulan ng clonal development ng sex cell line. Simula sa line primordial mikrobiyo cell, pati na rin ang lahat ng mga tisiyu ng embryo at extraembryonic mesoderm ay nagbibigay sa epiblast (pangunahing ectoderm) unang bahagi ng embryo pagkakaroon mosaic istruktura organisasyon. Ang microsurgical removal ng iba't ibang mga bahagi ng unang bahagi ng embryo ay nagtatag ng isang lokalisasyon zone sa epiblast ng isang clone ng mga nakatuon precursors ng pangunahing mga selula ng mikrobyo. Sa rodamindekstrana na kung saan ay ginamit bilang isang cell marker ito natagpuan na precursors primordial mikrobiyo cell ay matatagpuan sa proximal rehiyon ng epiblast, malapit sa extraembryonic ectoderm. Ang pangunahing linya ng sekswal na cell ay lumabas mula sa 45-cell clone, ang paglalaan na nangyayari sa pinakadulo simula ng gastrulation. Pagkatapos, ang pag-iisa ng clone ay nangyayari, at sa panahon ng gastrulation, ang pangunahing cell ng sex ay pumasok sa extraembryonic mesoderm at matatagpuan sa base ng allantois bud, sa likod ng pangunahing banda. Mula doon, ang mga pangunahing selula ng mikrobyo ay lumipat patungo sa pantiyan na dulo ng endodermos endocervix at pagkatapos ay aktibong lumilipat sa mesentery, na nagpapalaki ng mga genital roller sa dulo ng paglipat. Sa proseso ng paglipat, pati na rin sa unang 2-3 araw ng localization sa gonad rudiment, ang mga pangunahing sekswal na mga selula ay aktibong lumaganap at sumasailalim sa walong replicative cycles. Kung sa simula ng paglilipat ay mayroong halos 50 pangunahing mga selula ng mikrobyo, sa reproductive cysts ng embryo ng isang 12-araw na pag-unlad, ang bilang ng mga pangunahing selula ng sex ay lumampas sa 25,000.

Ang functional pagkakapareho ng ESCs at primordial mikrobiyo cell ay nagpapakita ng ganap na pagsasama ng huli sa ang kapalit blastocyst inner cell mass at kasunod na buong pag-unlad ng bilig, tissue na binubuo lamang ng mga kaapu-apuhan primordial mikrobiyo cell. Ayon sa iba pang mga katangian murine pangunahing mikrobyo cell PGCs ay din magkakahawig, na ipinapakita ang kakayahan upang makilala ang pagkakaiba sa iba't-ibang direksyon, upang bumuo ng embryoid katawan sa vitro, ang isang sa Vivo anyo teratomas kapag injected subcutaneously sa immunodeficient daga magkawangki kusang teratomas bayag daga line 129 / ter.

Ito ay itinatag na, kapag idinagdag sa LIF katamtaman, at natutunaw membrannosvyazannogo SIF ihiwalay pangunahing mikrobyo cell ng 8-araw na murine embryo mabuhay at ilaganap sa kultura para sa 4 na araw ngunit pagkatapos ay mamatay. Bukod dito, ang panahon kung kailan ang kultura ng kamatayan sinusunod primordial mikrobiyo cell coincides sa yugto ng pag-unlad ng mouse embryo (12.5-13.5 araw), kapag ang mga buds pangunahing gonadal female mikrobyo cell ipasok ang meiosis, at sa mga lalake primordial mikrobiyo cell ay naka-block mitotic dibisyon. Subalit, kung ikaw ay nagdagdag sa kapaligiran hindi lamang paglago kadahilanan LIF at ng SIF, ngunit din ng FGF2, ang pangunahing mikrobyo cell patuloy proliferirovat, at subcultures ay nabuo cell colonies maaaring muling gawin kahit na matapos na inalis mula sa kapaligiran ng paglago kadahilanan (SIF at FGF). Ang ganitong mga selula ay maaaring may pinag-aralan sa isang mahabang substrate embryonic fibroblasts nang walang ng karagdagan ng isang natutunaw paglago kadahilanan LIF. Ang mga matatag na linya ng cell na ito ay nagmula sa mga pangunahing selula ng mikrobyo na iminungkahing tinatawag na mga cell ng embryonic germ. Ang terminong ito ay hindi maituturing na tagumpay ng kapag may pinag-aralan EG-cell ay hindi maaaring makuha embryonic germ cell, na may kakayahang isakatuparan ang kasunod na yugto ng oogenesis o spermatogenesis. Ito ay dahil sa ang katunayan na ang EG-cell linya, bagaman nagmula sa primordial mikrobiyo cell, ngunit sa kultura ng pagkuha ang mga katangian ng embryonic pluripotent cell stem mawala ang kanilang kakayahan upang tanggapin ang alok ng germenativnye linya. Sa ibang salita, ang pangunahing mikrobyo cell sa panahon ng paglilinang mawala ang kanilang mga ari-arian gametes transformed sa precursors at ESC-tulad ng pluripotent cell.

Ito ay nabanggit na kapag immunodeficient EG mice ay ibinibigay, ang mga teratoma ay hindi lumabas. Ito ay ipinapalagay na ang pagkawala ng tao EG-cells ng kakayahan upang bigyan ang pagtaas sa teratomas dahil sa ang katunayan na ang mga linyang ito ay hindi nilikha nang direkta mula sa may pinag-aralan primordial mikrobiyo cell, at ay nagmula mula sa mga cell na ihiwalay mula sa embryoid katawan. Samakatuwid, ito ay posible na sila ay mga inapo ng pluripotent, ngunit na nakatuon cell.

Dapat pansinin na mayroong mga pangunahing pagkakaiba sa pagitan ng mga selulang EG at mga pangunahing selula ng mikrobyo. Ang huli ay hindi ginagawang posible upang makakuha ng chimeric mouse embryo, na nagpapahiwatig ng kakulangan ng kakayahan ng mga pangunahing cell ng mikrobyo upang maisama ang panloob na mass ng masa o trophectoderm. Katangian ng populasyon primordial mikrobiyo cell na katulad ng pinaka-somatic cell ng nakatuon na linya sa ibang pagkakataon ang mga embryo, sa pagpapakilala sa mga ito sa isang blastocyst din ang mga resulta sa pagbuo ng chimeric embryo.

Pagbabago diskarte culturing ang embryoid katawan natamo ng EG-pagsasama-sama ng mga cell pinahihintulutan sa pamamagitan ng pagpili sa pumipili media upang makatanggap ng isa pang populasyon ng pluripotent cell, na tinatawag na "cells nakuha mula embryoid katawan (embryoid katawan nagmula cell - EBD-cells). Ang kakayahan ng mga cell ng EBD na magparami para sa isang mahabang panahon sa kultura na pinapayagan upang lumikha ng matatag na mga linya ng cell ng mga nakatuong mga cell. Ang mga clones ng mga selula na nagpapahayag ng malawak na spectrum ng mRNA at protina-marker ng mga pinasadyang mga cell ay nakuha. Ito diskarte bilang isang resulta pinatunayan na ang pangunahing sex pantao pluripotent cell, at iba-iba sa vitro sa iba't-ibang mga uri ng cell: neurons, glia, vascular endothelium, hematopoietic cell, kalamnan, at endodermal cells.

Mga alternatibong mapagkukunan ng embryonic stem cell

Ang alternatibong mapagkukunan ng mga linya ng ESC ng tao ay maaaring maging hybrid na mga cell. Pagtatanim sa bahay-bata ng pseudopregnant baka geterogenomnoy istraktura nakuha kapag merging sa pamamagitan ng electroporation fetusa pantao somatic cell na may mga baka itlog, na kung saan ay dati inalis mula sa pronucleus, ginagawang posible upang makatanggap ng inner cell mass ng mga pre-pagtatanim embryo artipisyal na pag-unlad yugto. Para dito, ang blastocyst mula sa itlog ng baka kasama ang transplanted nucleus ng selula ng tao ay nakuha sa unang yugto.

Sa ikalawang yugto, ang embryoblast ay nakuha mula sa blastocyst, at mula dito - ang ESC ayon sa paraan ng Thomson. Kapansin-pansin na ang pinakamahusay na mga resulta sa paghihiwalay ESC linya sa pamamagitan ng ang paraan na ito ay nakuha gamit ang mga core ng follicular cell o primordial mikrobiyo cell na nanatili pa rin sa katawan ng tao sa isang estado ng hibernation. Ito ay dahil sa ang katunayan na ang itlog ng baka ni transplanted cell ng tao nucleus neukorochennye dapat magkaroon ng mataas na aktibidad at telomere telomeazy na avoids napaaga pag-iipon ESC panggagaya nagmula hybrid itlog (Repin, 2001). Ito ay kilala na ang pinaka-mahalagang intracellular marker protina PGCs ay Oct3, Oct4, TCF, Groucho, na kung saan nabibilang sa tinaguriang silencers, chromatin protina. Ang mga silencer ay nagbibigay ng partikular na compact packing ng heterochromatin, na pinipigilan ang pagbuo ng mga loop ng euchromatin. Ang pakete ng chromatin na pinangasiwaan ng mga protina na ito ay may kaugnayan sa totipotency ng ESC genome. Ngayon natagpuan na ang mature itlog sa mga baka at mga tao ay ang tanging species ng dalubhasa mga cell na naglalaman ng mataas concentrations ng silencers ng mga protina sa cytoplasma. Sa batayan na ito, isang pamamaraan ay binuo para sa produksyon ng hybrid ESCs sa pamamagitan ng paglilipat ng somatic cell nuclei sa mga di-nuclear ovules ng mga baka. Preliminary in vitro pag-aaral ay nagpakita na ang saytoplasm ng oocytes baka restores totipotency genome ng tao somatic cell nuclei pagkatapos ng 12-24 oras ng kultura.

Ang partikular na interes ay ang data sa mga tampok ng pagpapaunlad ng preimplantation ng mga embryo ng tao, na nagpapahiwatig ng pagpapalit ng mga totipotent na mamaya sa pamamagitan ng populasyon ng pluripotent cells kaysa sa mga daga. Ang pag-aaral ng mga transformation ng cell ay nagpakita na ang mga selula ng panloob na cell mass ng blastocyst ng tao, bilang karagdagan sa ESCs, ay bumubuo rin ng trophoblast cells, na nagpapahiwatig ng kanilang kabuuang lakas.

Ito ay kilala na sa yugto ng blastocyst may dalawang naiiba na nakatuon na mga populasyon ng cell. Ang isa sa mga ito ay ang panlabas na layer ng blastocyst, trofetoderm, na nagmula sa trophoblast cells at iba pang mga bahagi ng embrayono. Ang pangalawang populasyon ng mga selula ay pinagsama sa isang siksik na masa, na nakakaugnay sa panloob na ibabaw ng tropectoderm. Ang populasyon ng selula ng panloob na cell mass ay nagmula sa lahat ng tisyu at mikrobyo ng mga organ ng embryo. Sa yugto ng huli na blastocyst, isang extra-embryonic endoderm ay nabuo mula sa panloob na cell mass at isang epiblast ang nabuo (ang pangunahing ectoderm). Kasabay nito, ang mga selula ng epiblast ay nagpapanatili ng pluripotency, samantalang limitado ang kakayahang makilala ang mga selula ng labis-germinal endoderm.

[5], [6], [7], [8], [9], [10], [11]

Pagkuha ng mga human embryonic stem cell

Hanggang kamakailan ito ay naniniwala na trophoblast nakuha mula hESCs imposible. Gayunman diploid line trophectoderm stem cell na ihiwalay mula sa blastocyst sa isang medium na naglalaman ng, sa halip na LIF at FGF2 heparin, proliferates at ay transformed sa mga cell stem. Kung mag-aalis ka mula sa gitna ng FGF2, ang trophectoderm cell itigil breeding, magsisimula sila endoreduplication ng chromosomes at cellular elemento trofektodermalnye dahan-dahan transformed sa isang higanteng mga cell trophoblast. Marahil, LIF ay hindi pasiglahin ang paglaganap ng mga cell trophectoderm dahil sa ang katunayan na ang FGF2 pinalitaw isang mekanismo transsignalizatsii bilang FGF2, umiiral sa cytoplasmic receptor (FGFR2), isaaktibo ang MAP kinase sa saytoplasm - ERK1 at ERK2. Dahil dito, kapag isinama sa mga cell ng blastocyst ng isa pagbibigay ng senyas pathway (LIF - gpl30 - JAK-kinase - STAT3) inner cell mass cell ay transformed sa pluripotent hESCs, habang ina-activate ang pangalawang mekanismo ng transmembrane pagbibigay ng senyas (FGF2 - FGFR2 - MAP kinases ERK1 / ERK2) stem cell sa blastocyst trophectoderm nabuo. Pagpili ng pathway pagbibigay ng senyas, siya namang, ay depende sa aktibidad ng gene oct4. Ito gene na kabilang POU domain, na matatagpuan sa locus t 17 autosomes at ito ay ipinahayag sa panahon oogenesis, sa pagdurog panahon pati na rin sa mga selula ng inner cell mass ng blastocyst, at sa primordial mikrobiyo cell. Functional papel oct4 gene ay encoding isang pagkasalin kadahilanan na kinakailangan para sa ang pangyayari ng pluripotent cell, ang kanilang pagkita ng kaibhan at dedifferentiation.

Ang pagpapahayag ng oct4 gene sa ESC ay nag-iiba depende sa pakikipag-ugnayan ng transaksyon na ito sa mga cofactor. Directional expression regulasyon oct4 in blastocysts ay nagpakita na ang kanyang mga aktibidad sa ibabang kalahati paraan trophectoderm cells, samantalang sa mas mataas na sapilitan expression oct4 lumabas dahil higit sa lahat hESCs.

Sa eksperimento, ESC ay hindi maaaring isalin sa isang linya sa pamamagitan ng culturing ang totipotent blastomeres cleavage stage at sa stage gastrulation at mamaya yugto ng embryonic unlad. Mouse ESCs karaniwang magtalaga sa 3.5-4.5 araw ng pagbubuntis, na kung saan ay tumutugon sa ika-anim (single layer ng blastocyst) at ikapitong baitang (dalawang-layer ng blastocyst - isang maagang egg cylinder) normal embryogenesis. Maliwanag, sa panahon lamang ng preimplantation ang mga embryo ng mga daga ay naglalaman ng mga cellular populasyon na maaaring mabago sa ESC. Dahil dito, ang paghihiwalay ng mga linya ng ESC ay posible lamang sa ilang mga yugto ng embryogenesis. Totipotent, sa mga tuntunin ng mga pagkakataon para sa pag-unlad ng isang viable bilig mula embryonic membranes at inunan ay ang zygote at nagbubuhat sa panahon pagdurog blastomeres. Ang pagkawala ng kabuuang lakas ng mga germinal cell ay nagsisimula sa huli na yugto ng morula, kapag ang karagdagang blastomere comminution ay nakasalalay sa kanilang lokasyon. Ang maagang Morula blaetomers ay nagpapanatili ng totipotency, dahil ang mga pang-eksperimentong manipulasyon sa mga pagbabago sa kanilang lokasyon, halimbawa, pagbabaligtad ng kanilang lokasyon, ay hindi pumipigil sa pag-unlad ng isang buong embrayo.

Napag-alaman na ang kahusayan ng paglabas ng ESC sa linya ay apektado ng estado ng blastocysts sa panahon ng kanilang pagpapaliwanag. Ang paggamit ng blastocysts matapos ang isang pitong-araw na simulation ng diapause sa genital tract ng mga Mice, ovariectomized sa 3.5 na araw ng pagbubuntis at itinuturing na may progesterone, nag-aambag sa isang mas matagumpay na paghihiwalay ng mga linya ng embryonic stem cell. Ipinapalagay na sa ilalim ng gayong mga kalagayan ang bilang ng mga blastomeres na bumubuo sa panloob na mga cellular mass increases. Posible rin na ang pag-ikot ng cell ay umaabot at ang karamihan sa mga blastomeres ay pumasok sa phase G0.

Bukod dito, ang paglikha ng matatag na pluripotent hESC mga linya ay depende sa genotype embryo: lubos na madaling nakikilala mula ESCs Murine blastocysts line 129, ay makabuluhang mas mahirap na makuha ang mga ito gamit ang mouse CS7BL / 6 at halos imposible upang ihiwalay ang linya mula hESCs blastocysts CBA / Ca Mice. Maliwanag, ang mga maagang embryo ay nagtataglay ng ilang mga katangian ng genetiko na nakakaapekto sa pag-unlad ng pluripotent ESC line. Gayunman, kapag may pinag-aralan epiblast insulated, pati na rin sa pamamagitan ng pumipili pagpili differentiating hESCs cell linya mula sa unang bahagi ng embryo CBA / Ca Mice ay pa rin ang inilalaan.

Ang isang napatunayan na karaniwang pamamaraan para sa pagkuha ng mga linya ng ESK mula sa blastocysts ay ibinibigay sa mga manwal ng laboratoryo sa pamamaraan ng eksperimento sa mga maagang embryo. Pang-eksperimentong Hess ay maaaring makuha sa pamamagitan ng culturing isang nakahiwalay epiblast (pangunahing ectoderm) 4.5-day-old embryo mouse gamit microsurgical diskarte sa halip kumplikado at binagong kondisyon paglilinang. Ang pagiging kumplikado ng pamamaraan na ito ay makatwiran, dahil ang dalas ng pagbuo ng mga linya ng ESC ay mas mataas kaysa sa trabaho sa panloob na mass ng blastocyst.

Upang paghiwalayin ang mga linya ng ESC, ang bawat clone ay inililipat sa isang micro-well, isang pinagsama-samang 40-60 na mga cell ang lumago, muli itong ibinubuwag. Maramihang mga repetitions ng ang pamamaraan na ito ay nagbibigay-daan upang makakuha ng immortalized ESK linya na may pinakamataas na paglaganap rate normokariotipnyh cells na nakalagay sa plastic, na kung saan ito'y mga sipi 50-100 panatilihin totipotency at mataas na telomerase aktibidad. Sa proseso ng pagsuporta sa mga linya Esc ang pinakamalaking panganib ay ang polusyon o suwero bacterial endotoxins - kahit bakas ng endotoxin konsentrasyon sa kultura medium sanhi mass kamatayan ng wala pa sa gulang mikrobyo cell. Sa pamamagitan ng maingat na kontrol ng mga linear na paglago at ang napapanahong pagpapakalat ng ESCs sa kulturang may kakayahang simetriko fission, kung saan ang parehong mga cell anak na babae mananatiling pluripotent at magagawang upang maisagawa ang isang walang limitasyong bilang ng mga cell cycle, pagpapanatili ng isang diploid karyotype at ang kabuuang lakas.

Pagpili ng isang dalisay na populasyon ng tao ESCs ay maaaring natupad sa mga sumusunod na transfection sa kanilang genome ng recombinant DNA molecule na naglalaman ng isang gene encoding ang pagbubuo ng green fluorescent protein (GFP). Expression ng GFP ay nagdaragdag sa lumalaking ESCs sa isang kapaligiran na sumusuporta sa kanilang paglaganap, samantalang simula ng pagkita ng kaibhan ng ang antas ng gene expression ay nabawasan, na nagpapahintulot pinili sa mapamili medium purong matatag, pluripotent cell linya. Kapag nilinang sa pagpili ng ESCs ng GFP, ang dalas ng mga kolonya ay lubhang nadagdagan, dahil sa mga kondisyon ng mga pananim na pagpili ang napakalakas na antiproliferative effect ng mga pagkakaiba-iba ng mga cell ay inalis.

Pagsasalin ng tao embryonic cell stem sa linya sa pamamagitan ng kanilang mga paraan ng paghihiwalay ng preimplantation embryo (hakbang 80-120 cell), na nananatili pagkatapos ng in vitro fertilization procedure. Upang gawin ito synthetically ginawa "labis na" embryo nang wala sa loob dispersed sa medium-Delbekko karayom. Pagkatapos ng paglalagay ng label sa mga cell na may monoclonal antibodies mapamili fluorescent label embryoblast nakahiwalay na mga cell. Ang embryoblast ay dispersed sa indibidwal na mga cell gamit ang isang halo ng disaspase-collagenase. Dissociated cell ay lumago sa isang espesyal na medium (80% Delbekko daluyan + 20% pangsanggol guya suwero sa presensya ng 500 .mu.g / ml ng IL-6, LIF at SCF) sa monolayer ng embryonic fibroblasts tagapagpakain 3 unang talata. Kaya kaligtasan ng buhay at paglaganap ng stem at ninuno cell ay pinananatili sa pamamagitan ng exposure sa IL-6, LIF at SCF. Sa environment na ito, ang suspensyon hESCs palaguin panggagaya osharennyh unattached cells na dissociated sa pamamagitan ng banayad maramihang pipetting. Lumilitaw ang mga bagong clone sa nasuspindeng kultura sa ika-5 hanggang ika-7 araw. Ang maximum na rate ng paglago nakakamit ESK paulit-ulit na panggagaya dissociating step 10-15 cells. Pagkatapos, ang bawat clone ay inilipat sa isang microcell at lumago sa isang pinagsama-samang 40-50 na mga cell. Ang pamamaraan ay paulit-ulit na maraming beses sa mga sipi, ang pagtaas sa dami ng mga kultura sa isang density ng 5-10 milyong selula bawat 6 na cm dish. Sa pamamagitan ng paggamit tulad ng isang Thomson passaging ito ay ihiwalay 10 panggagaya walang kamatayang pantao ESCs na ito'y mga sipi 100 mapanatili ang mataas na telomerase aktibidad, ang kakayahan upang matinding paglaganap at phenotypic katangian minimum kabuuang potency, na may pagkita ng kaibhan sa alinman sa mga 350 pinasadyang mga linya ng cell na nagmula ecto-, meso- - at endoderm. Pagkita ng kaibhan ng tao ESC nagsimula (sa pagbabago ng medium, bilang karagdagan at pag-aalis ng suwero LIF) na may cell attachment sa substrate, na nagpapahiwatig ng pag-unlad ng cytoskeleton at pagpapahayag ng pagdirikit receptors. Ito ay mahalaga na ang mga ipinagpapahintulot paglaganap ng tao ESCs pinananatili normal karyotype.

Ang pangalawang paraan ng paghiwalay ng mga linya ng ESC ng tao ay batay sa paggamit ng mga pangunahing selula ng sex. Ipinakita ng mga eksperimental na pag-aaral na ang mga linya ng Eu-cell ay maaaring makuha mula sa genital plaques ng 12.5-araw na gulang na mga embryo ng mga daga. Gayunpaman, sa mga kasong ito, ang dalas ng pagkakabuo ng mga linya ng cell progenitor ay mas mababa kaysa sa mga eksperimento na may mga naunang embryo. Kasabay nito, ang mga pangunahing selula ng sex mula sa mga gonad ng mga embryo ng mouse na 13.5-araw na gestational edad sa pangkalahatan ay hindi kaya ng pagbabago sa mga linya.

Ang unang matatag na mga linya ng tao pluripotent EG cell ay nagmula mula sa pangunahing gonocytes ihiwalay mula sa genital primordia 5-9-linggong gulang na embryo. Nakahiwalay cell ay may pinag-aralan sa isang substrate ng pinatay-na mouse embryonic fibroblasts sa DMEM medium sa pangsanggol suwero, na kung saan ay idinagdag mercaptoethanol, forskolin, pati na rin recombinant pantao paglago kadahilanan (FGF at LIF). Pagkatapos ng 7-12 araw, ang multicellular colonies ay lumitaw sa kultura, ayon sa mga tampok ng morphological at molecular marker na naaayon sa mga human cells ng EG. Pagkatapos ng pagsasama-sama, ang mga cell na nabuo embryoid mga katawan, ang karagdagang pag-unlad ng pinasadyang mga cell na kung saan lilitaw na katangian para sa mga derivatives ng lahat ng tatlong mga mikrobyo layer. Sa buong 10-20 talata, ang EG-cell na mga linya ay pinanatili ang normal na karyotype at hindi nawalan ng pluripotency.

Ipinakita rin na ang pinagsamang epekto ng LIF, lamad-nakagapos at nalulusaw na mga kadahilanan ng Steel, pati na rin ang TGF-b, ay nagpapabago sa programa para sa pag-unlad ng mga pangunahing selula ng mikrobyo. Sa halip na itigil ang mga mitotic divisions at simula sa iba-iba sa oogenesis o spermatogenesis, ang mga pangunahing selula ng sex ay patuloy na lumaganap. Matapos ang ilang mga karagdagang mga mitotic cycle sila ay maging katulad sa mga cell epiblast at, nawawala ang mga katangian ng mga precursors ng mga cell ng mikrobyo, ay transformed sa pluripotent embryonic stem cell EG.

Kaya, noong 1998, ang mga immortalized na linya ng pangunahing mga sekswal na selula ay unang nakahiwalay mula sa sekswal na pagbubuntis ng tao na sanggol na autopsy tissue. Ang embryogenesis ng tao pangunahing cell ng mikrobiyo ay lumilitaw sa yolk sac sa ikatlong linggo ng pag-unlad, at sa 4-5th na linggo, ang mga cell na mag-migrate sa lugar ng sekswal na tubercle, kung saan sila bumuo ng isang populasyon na pangunahing dormantnye gonocytes. Sa hindi aktibong estado, ang mga pangunahing mga selula ng mikrobyo ay nananatili sa usbong hanggang sa kapanganakan. Pangunahing mikrobyo linya ng cell ay nakuha mula sa pangsanggol genital tubercle 5-9-linggong gulang na embryo nakuhang ex tempore tela na kung saan ay itinuturing na may isang halo ng collagenase type IV-V, hyaluronidase at DNase para sa dami at ng husay pagtaas cell ani. Ang mga pangunahing selula ng mikrobyo sa mga tisyu ng tubercle ng pangsanggol ng fetus ay napapalibutan ng mga selulang Sertoli stromal (mesenchymal). Functional layunin ng Sertoli cells ay ang produksyon ng mga anti-apoptotic salik (Fas-ligand), mitogens, at immunosuppressive mga ahente na protektahan ang sekswal na stem cells mula sa immune atake sa pamamagitan ng katawan. Bilang karagdagan, ang stromal microenvironment ng genital tubercle ay may mahalagang papel sa pagkahinog ng gametes. Ang nakahiwalay na mga pangunahing selula ng mikrobyo ay nakatanim sa kultura sa ibabaw ng stromal layer ng feeder na binubuo ng mga fetal fibroblast sa unang tatlong sipi. Ang pinaka-epektibong kumbinasyon ng mga mitogens ay isang komplikadong binubuo ng LIF, FGF, at forskolin (isang stimulant para sa pagbuo ng kampo). Paglaganap primordial mikrobiyo cell sa vitro mangangailangan ng pagdaragdag ng pangsanggol suwero, sa presensya ng isang pangunahing pagpaparami gonocytes sa kultura panggagaya sinamahan ng pagbuo ng globular, non-kabig cell sa substrate.

Ang US National Institutes of Health sa batayan ng pagbubuod umiiral na impormasyon sa mga pamamaraan ng paglalaan ng tao ESC linya mula blastocysts ay ginawa ng isang paunang konklusyon na ang matagumpay na allocation ng ESC ay pinaka-malamang na kapag may pinag-aralan blastocysts may nabuo nang maayos inner cell mass (stem cells: pang-agham na pag-unlad at sa hinaharap na pananaliksik direksyon Nat. Inst, ng Kalusugan USA). Mula sa puntong ito ng view, ang pinakamahusay na pinagmulan ng ESCs upang lumikha ng mga linya ay tao blastocyst ika-5 araw ng pag-unlad, na kung saan ang laang-gugulin ng inner cell mass ay dapat na maingat na alisin ang trophectoderm. Nakahiwalay inner cell mass binubuo sa yugtong ito ng 30-35 mga cell ay dapat na nilinang sa isang substrate murine embryonic fibroblasts, na kung saan ay isang hindi mapag-aalinlanganan na kondisyon para sa pagbuo ng mga kolonya nito sa kultura hESCs.

Ang pagtatasa ng phenotypic na mga tampok ng embryonic stem cell

Definite interes interspecies comparative analysis ng phenotypic katangian ng ESC. Ito ay natagpuan na ng tao ESC kolonya - isang siksikan na kumpol ng mga pipi epithelial-cells, habang daga embryoid guya binubuo ng maluwag kalipunan ng mga bilugan na mga cell. Sa pantao ESC index nuclear plasmatic ratio ay mas mababa kaysa sa mouse ESCs. Monkey embryonic stem cell form flat kolonya ng mas maraming mga tulis-tulis na mga cell. Sa maagang panggagaya ng mga primat sa ESC, ang mga solong selula ay madaling nakikita. Proliferating hESCs lahat ng mga species ng mga hayop ay hindi ipahayag ang MHC class I at II. Kasabay nito, human ESCs magbigay ng isang positibong tugon sa antibodies TERA 1-60 at GCTM-2, na kung saan ay nagpapahiwatig ng presensya sa kanilang ibabaw keratin / chondroitin sulpate proteoglycans, katangian ng embryonic (teratomas) -kartsinomnyh mga cell stem. Expression sa hESCs lahat ng uri ng mga hayop oct4 gene ay nagmumungkahi na, sa kabila ng phenotypic mga pagkakaiba sa mga tao at mouse ESCs, tila activate sa pamamagitan ng katulad na hanay ng mga gene na responsable para sa pagpapanatili ng pluripotency (Peru, 2001). Sa karagdagan, ang ESC linya nagmula sa embryonic daga, baboy, kuneho, primates, at mga baka, ay may mga katulad morphological katangian, ng isang katulad na hanay ng mga molekular pagkilala ng mga marker at isang halos katulad na molekular mekanismo para sa pagpapatupad ng embryogenesis programa na nagpapahintulot sa iyo na kumuha ng isang sariwang pagtingin sa ang isyu xenotransplantation .

Hindi tulad ng normal na embryogenesis sa Vivo, sa vitro paglaganap ng hESCs ay hindi sinamahan ng pagbuo ng usbong layer at naaayos upang harangan homeotic Nohgenov background, ibig sabihin, walang organogenesis. Dahil segmentation gene ay hindi gumana sa kultura hESCs imposible upang muling gawin tulad mga panahon embryogenesis bilang tab somit segmentation ng nucleus, ang pagbuo ng yolk sac, allantois provisory at iba pang mga organo at tisyu. Ang kultura ESCs ay frozen sa simula ng pagbuo ng 350 mga linya ng paghihigpit ng mga pinasadyang mga cell. Kaya, clone subsidiary progenitor cells at centrally naisalokal PGCs lamang model bilig sa panahon ng pag-unlad na kung saan iba't ibang tissue rehiyon ay nabuo sa isang yugto ay iba mula sa mga pinasadyang mga cell nagmula, gayunpaman, mula sa mga karaniwang precursors. Kahit na ang minimum na antas ng receptor sa ibabaw ng hESCs, panatilihin ang mga ito ng kakayahan upang maisagawa ang primitive morphogenetic proseso ang pagtulad sa karamihan ng maagang embrayo istraktura: slurry hESCs sa kultura at Pinagsasama-sama bumubuo ng isang istraktura na kahawig ng blastocyst o kahit na sa ibang pagkakataon embryo (egg cylinders). Ang nasabing mga aggregate ng suspensyon ay angkop na pinangalanan na simple at kumplikadong mga embryo na katawan.

Kapag halo-halong-ibahin sa iba't-ibang mga cell ng embryoid katawan nang sabay-sabay ipinahayag ng unang bahagi ng mga gene ectoderm (oct3, fgf-5, sentral), endoderm (gata-4), mesoderm (brachyury), cardiogenic mesoderm (PKH-2,5), neural tube (msx3 ) at hematopoiesis (elkf). Paggamit ng iba't-ibang mga kumbinasyon ng mga cytokines at paglago kadahilanan para sa pag-target sa pagbuo ng mga cell mikrobiyo layer sa vitro sa isang bilang ng mga kaso na ito ay posible upang makakuha ng embryoid katawan, na mas maganda ipinahayag gene ectoderm o mesoderm, na kung saan ay bubukas ang paraan sa pagmo-modelo ng gastrulation at unang bahagi ng organogenesis phase.

Clonal paglago ng hESCs ay isang katibayan ng tabingi ng selula kung saan isa lamang sa mga ESC sa sentro clone napapanatili non-takda sa paggawa ng maraming kopya ng kapasidad, habang ang iba pang mga anak na babae cell nagbibigay sa pagtaas sa henerasyon ng mga cell ninuno, pagkita ng kaibhan ay dumarating na in. Samakatuwid, clone pagpapalaganap bilis sa paligid ng embryoid katawan ay mas mataas kaysa sa gitna. Ang mga nasa gilid na selula ng lumalagong clone ay sumasailalim sa kusang pagkawala ng kaguluhan, lumipat o namatay sa pamamagitan ng mga mekanismo ng apoptosis. Ang mga kaganapang ito na matukoy ang kapalaran ng mga clone kung ang paglaganap rate ay lumampas sa rate ng paglilipat at apoptotic cell kamatayan, clone sukat magpatuloy upang madagdagan, stabilize ay nangyayari na may pantay na apoptosis at ang rate ng pagbuo ng bagong cell bilis, pagbabalik - ang reverse ratio ng mga prosesong ito. Ang mga selulang progenitor ay nahahati sa symmetrically, samakatuwid, ang parehong mga cell ng anak na babae ay higit pang naiiba sa mga mature na specialized na linya ng cell. Ang ratio ng mga cell ESC / progenitor ay nag-iiba, ngunit laging ang halaga ng ESC ay isang bahagi lamang ng isang porsiyento ng populasyon ng cell progenitor. Samakatuwid, ang tanging maingat na pipetting at napapanahong pagsasama-sama ng mga panggagaya ay maaaring madagdagan ang bilang ng mga ESC sa kultura. Upang makuha ang maximum na ani ng ESC, ang pinaka-epektibo ay ang pagsasama-sama ng mga panggagaya sa yugto ng 10-12 na mga cell. Ang direksyon at antas ng pagkita ng kaibhan ng mga selula sa katawan ng embryo ay depende sa kanilang lokasyon. Panlabas embryoid katawan cells hindi ipahayag ang gene at oct4 sumailalim sa pagkita ng kaibhan sa mga pangunahing mga cell endoderm mula sa kung saan magkakasunod na nabuo epithelioid cell at parietal extraembryonic visceral endoderm. Ang mga panloob na selula ng katawan ng embryo ay nagpapahayag ng oct4 gene at nagpapanatili ng pluripotency para sa 48 na oras ng kultura. Ngunit pagkatapos ay ang morphological pagbabagong-tatag ay nangyayari sa mga epithelial monolayer kultura ay nagsisimula at pagpapahayag ng mga gene na kontrolin ang pag-unlad ng pangunahing ectoderm. Dagdag dito, ang proseso ng kabuuang disordered cytodifferentiation ay nagsisimula sa hitsura ng iba't ibang uri ng cell na ay derivatives ng lahat ng tatlong mga mikrobyo layer. Sa proseso ng kusang pagkita ng kaibhan ng embryoid mga cell katawan unang lumabas dahil Pinagsasama-sama endoderm markers sa anyo ng mga fragment (cysts) yolk sac. Dagdag dito, lumilitaw ang mga angioblast at endothelial cells ng lumalagong mga capillary sa mga istrukturang ito. Sa pinal na yugto ng kusang pagkita ng kaibhan ng mga panloob na mga cell ng embryoid katawan bubuo iba't-ibang mga terminally differentiated cell, kabilang ang mga neurons, glial mga elemento, cardiomyocytes, macrophages at erythrocytes. Sa ilang mga approximation (isinasaalang-alang ang spatial pagbabaligtad ng mga sheet na bumubuo ng embryonic tissue) sa pamamagitan ng embryoid katawan sa vitro Matutuklasan morphogenetic proseso at pag-aralan ang mga molekular mekanismo ng embryonic cytodifferentiation unang panahon, at magtatag ang papel na ginagampanan ng mga tiyak na mga gene sa pagpapatupad ng mga proseso.

Kaya, sa loob ng clone ang mga selula kung saan natutuklasan ang iba't ibang mga programa sa pagpapaunlad ng genetic - ESCs, maagang mga progenitors at differentiating populasyon ng progenitor. Ang paglilinang ng ESC sa pamamagitan ng mga pamamaraan ng isang drooping drop o masa kultura na walang isang feeder layer at walang ang pagdaragdag ng LIF sa daluyan hindi maaaring hindi humahantong sa pagbuo ng mga embryo katawan. Ang morpolohiya ng mga selula ng panlabas at panloob na mga layer ng mga embryo na katawan ay iba. Ang panlabas na layer ay binubuo ng mga malalaking, mga cell ng proseso. Ang kanilang mga ibabaw, nakaharap sa kapaligiran, ay sakop ng maraming microvilli. Ang panlabas na layer ng mga selula ay nahiwalay mula sa panloob na basal na lamad na kahawig ng Reichert membrane, habang ang mga selula ng panloob na layer ng mga embryo ay isang cylindrical epithelium. Sa morphologically, ang panloob na layer, kahit na naglalaman ng maraming mga cell dividing, ay mas nakapagpapaalaala ng walang kinalabasan ESC colonies.

Mga katangian ng mga selulang pantao ng embryonic stem

Kawalan ng parenchymal-mesenchymal mga pakikipag-ugnayan sa signal background pagharang gene homeosis nagiging sanhi ng disordered paglago ng PGCs sa kultura, dahil ang tab na ito ay nasira at ang pagbuo ng imprastraktura provisory bahagi ng katawan. Unorganized pag-unlad at hindi maayos na kusang pagkita ng kaibhan ng hESCs sa kultura dahil sa kakulangan ng mesenchymal pagmamarka ng stromal framework ng mga hinaharap na mga katawan: sa vitro ito ay posible sa pagbuo ng milyon-milyong mga hepatocytes, ngunit hindi ka maaaring makakuha ng anumang mga segment ng ang atay, kabilang ang naturang istruktura at functional na mga elemento, tulad ng mga sinuses, ang espasyo ng Disse at Kupffer cell.

Ito ay pinaniniwalaan na ang pluripotency ng ESCs natanto eksklusibo sa embryogenesis upang bumuo ng tisyu at organo ng bilig, habang ang pusod at inunan ay hango trophoblast. Nakapaloob sa isang shell trofektodermalnuyu ESK patuloy na bumuo ng cell panggagaya provisory napagtatanto na pag-unlad programa sa pamamagitan ng kombinatoryal mRNA bulk Nohteyaov topographic matrix, na kung saan predetermine ang spatial arrangement, hugis, sukat, bilang ng mga pansamantalang at depinitibo organ cell at parenchyma assembly sa istruktura at functional unit. Kasabay nito ang ESC ay ang tanging uri ng cell na kung saan ang molekular mekanismo ng pagsasakatuparan ng kanilang mga potensyal na ganap dissociated mula sa genetic programa ng pag-unlad at ESCOs kanilang mga sarili deprived ng ang posibilidad ng pakikipag-ugnayan sa iba pang mga cells dahil sa pagbara ng parehong receptor perception at transsignalizatsii sistema. Gayunpaman, sapat na activation ESCs resulta sa unti-unting pag-deploy embryogenesis program na nagtatapos kapanganakan ay ganap na binuo at handa na extrauterine buhay ng isang organismo na binubuo ng bilyon-bilyong mga cell. Sa maikling panahon, ngunit hindi mailarawan ng isip utang sa cellular space landas maiiwasang pangyayari ng error sa molecular mekanismo na nagbibigay ng mahalagang mga pag-andar ng mga cell, at sa mga programa na kontrolin ang kanilang paglaganap, pagkita ng kaibhan at pagdadalubhasa. Samakatuwid, sa modernong pharmacogenomics isinasaalang-alang nang hiwalay sakit molecular aparato, at sakit sa cell programming. At ang mga pagkilos ng ang karamihan ng mga bagong gamot na naglalayong itama ang pangalan ng programa ng pagkita ng kaibhan, paglaganap at organogenesis, pati na rin ang pagbabagong-buhay ng mga organo at tisyu. Sa adult organismo sa pamamagitan ng ESCs ito ay nagiging posible na kontrolin ang pag-uugali ng mga cell stem / ninuno transplanted sa utak, atay, pali, utak ng buto at iba pang mga organo ng tao na ayusin ang napinsalang tatanggap parenchymal organo dahil sa pagkita ng kaibhan at pagdadalubhasa donor mesenchymal cell mapangalagaan matrix. Mahalaga, totipotency programa ay paglunsad ng isa pang oocyte genome antas, zygotes at blastomeres, ngunit ang mga cell ay hindi pa posibleng mai-clone at passaged sa dami na kinakailangan para sa mga pangangailangan ng experiental at praktikal na gamot. Samakatuwid, ang ESC ay isang natatanging pinagmulan ng genetic na impormasyon na naglalaman ng mga tatlong-dimensional na guhit paghihigpit mapa ng bilig at code ng mga specialized mga linya ng cell sa panahon gastrulation.

Halos walang hanggan mga posibilidad ng nagbabagong-buhay ESC dahil sa ang katunayan na ang kanilang genome, sa kaibahan sa genetic apparatus ng differentiated somatic cell, nagpapanatili pluripotency. Isang manipestasyon ng tulog estado nakaugat sa ESCs genetic na impormasyon ay ang tinatawag na minimum phenotype - sa ibabaw ng ESC ng pagpapahayag ng isang limitadong bilang ng mga receptors, at samakatuwid ay ipinakalat napakakaunting mga programa upang makipag-ugnay transsignalizatsii nuclear aparato ng mga cell sa kanyang microenvironment. Laban sa background ng hibernation gene na responsable para sa paghihigpit ng dalubhasa linya ng cell at pagkita ng kaibhan ng mga cell, aktibo lamang tungkol sa 30 ng 500 mga gene na ang mga produkto ay nagbibigay ng mga cell pakikipag-usap sa ang mga nakapalibot microenvironment. Paggamit ng mga pamamaraan ng serial pagtatasa ng gene expression pinapakita na ang kasaklawan ng Main functional genome kahon ipinaguutos enerhiya at metabolismo sa somatic cell at ESCs sa huling natutukoy sa lubhang mababa halaga ng mRNA ng receptors, G-protina, pangalawa mensahero, transcriptases, cofactors expression at panunupil iyon ay, ang buong sistema ng transmembrane regulasyon signal sa cell. Ito ay dahil sa kakulangan o napakababang pagpapahayag ng mga gene sa transsanalization. Sa panahon ng pagkita ng kaibhan sapilitan sa genome ng ESC 18 operasyon ay huminto synchronous gumagana gene para sa background activation transsignalizatsii 61 gene pagkontrol sa synthesis ng cell pagdirikit receptors, ekstraselyular matrix mga bahagi, paghihigpit transcriptases messendzhernyh elemento at signal transmission system para sa isang nuclear unit na may plasma cell lamad receptors. Nang sabay-sabay naharang pagpapahayag ng mga gene na responsable para sa synthesis ng protina silencers, pati na rin ang gene expression koingibitorov pagbibigay totipotency genome hESCs.

Ang mga genetic marker ay natagpuan para sa mga selula ng lahat ng tatlong embryonic leaflets. Identification ectodermal cell layer natupad sa pagpapahayag ng mga gene nodal, oct3 at fgf-5, mesodermal cells - gene brachyury, zeta-globin, endoderm - sa gata-4 gene expression. Sa normal na embryogenesis, sa panahon gastrulation sinusunod ng isang aktibong migration ng wala pa sa gulang populasyon ng stem at ninuno cell, lokal pagtatalaga ng mga lugar ng facial buto ng bungo, ang ilang mga bahagi ng utak, peripheral nervous system, puso pagpapadaloy sistema at thymus tissue na nabuo mula panggagaya displaced mga cell. Cell labeling maagang gene mikrobyo layer ay ginagawang mas madali para sa topographical pagtatasa ng migration ng mga cell ninuno sa pagbuo ng bilig. Ito ay matatagpuan sa mga partikular na ang mga cell sa Pinagsasama-sama embryocarcinoma P19 expression ng unang gene mesoderm brachyury ay nagsisimula sa panahon ng pagbabawas ng gene expression ng tissue plasminogen activator, a-fetoprotein, keratin 8, at keratin 19, na kung saan ay palatandaan ng maagang mesoderm lipat na populasyon. Bilang resulta, ang mga pormasyon ng tisiyu ng mesodermal pinagmulan ay nagsisimula lamang pagkatapos ng proseso ng paglilipat at pag-aayos point mesodermal progenitor cells.

Sa labis na limitadong tampok phenotypic at ang kawalan ng karamihan ng mga bloke transsignalizatsii ESC gayunpaman ipahayag ang ilang mga receptor molecules na maaaring magamit upang makilala ang mga ito. Kapansin-pansin na ang mga antigens ay palatandaan ng ESC sa mga tao at unggoy ay pangkaraniwan. Karamihan sa mga madalas na ginagamit para sa pag-label hESCs may label antibodies sa mga antigens membrannosvyazannym SSEA-3, SSEA-4 (natatanging lipid antigens na kumakatawan sa mga kumplikadong glycolipid GL7 na may sialic acid), pati na rin ang mataas na polimer glycoprotein TRA-1-81, TRA-1-60. Higit pa rito, hESCs ipahayag ang tiyak na mga embryonic antigen SSEA-1 at endogenous alkalina phosphatase, pati na rin ang isang tiyak na transcription factor Oct4. Ang huli ay kinakailangan para sa pagpapanatili ng hESCs mekanismo paglaganap - tiyak na kadahilanan transcription Oct4 gene activates ang pagpapahayag ng fibroblast paglago kadahilanan 4 gene expression at stabilizes boxing responsable para sa mga di-takda sa DNA uulit sa wala pa sa gulang na mga cell. Ang pinaka-mahalagang intracellular marker protina ay Oct3, Oct4, TCF at Groucho, na may kaugnayan sa protina ng chromatin-silencers.

Halos agad-agad pagkatapos ng pang-matagalang pinag-aralan ESCs pagtatangka ay hindi matagumpay at ang mga organismo ay unang inihanda ng kultura ng cell stem ihiwalay mula blastocysts mouse, at pangunahing mikrobyo cell kultura, nagsimula stage ESC pluripotency kapasidad pag-aaral kapag pinangangasiwaan sa maagang yugto ng pag-unlad embrayo. Ito ay ipinapakita na sa morula at blastocyst PGCs ay magagawang upang bumuo ng chimeric embryo na kung saan ang donor PGCs kaapu-apuhan napansin sa lahat ng somatic tisiyu at kahit na sa gametes. Sa gayon, sa Developmental Biology gamit ESC scripting "tulay" sa pagitan ng mga pang-eksperimentong mga pag-aaral sa Vivo at sa vitro, na kung saan makabuluhang tumaas ang posibilidad ng pag-aaral na proseso Bookmarks pangunahing tisyu at organo, ang kanilang pagkita ng kaibhan at embryonic organogenesis.

Ito ay mahusay na itinatag na sa Vivo sa panahon embryogenesis ESK isinama sa cell mass ng maagang embrayo, at ang kanilang mga derivatives ay matatagpuan sa lahat ng bahagi ng katawan at tisyu. PGCs kolonisahan ang mikrobyo linya ng isang chimeric mikrobyo cell, kaapu-apuhan ni aling form ang buong itlog at tamud. Ang mga embryonic stem cell ay clonogenic - single PGCs ay maaaring lumikha ng genetically magkapareho sa isang kolonya ng mga cell na may molecular marker, na kinabibilangan ng oct4 gene expression at alkalina phosphatase, mataas na telomerase aktibidad, pati na rin ang expression ng mga tiyak na embryonic antigen.

Upang pag-aralan ang mga mekanismo ng embryogenesis gamit ang diskarteng ng hESCs chimerization morula pamamagitan ng paglikha ng biological istraktura, na kung saan ay matatagpuan sa labas layer tetraploid blastomeres recipient at donor PGCs ay ibinibigay sa. Kaya, trophoblast nabuo mula sa mga kaapu-apuhan tetraploid blastomeres tatanggap na nagbibigay-daan pagtatanim at placentation, at donor PGCs kumikilos bilang inner cell mass, na kung saan ay binuo mula sa isang viable mikrobyo linya sa mga pangunahing katawan at progenitor gametes. Pag-aaral ng ESC halaga ay namamalagi hindi lamang sa na, kapag ang pagmamanipula sa vitro sa kanilang genome mananatili pluripotency, ngunit din sa ang katunayan na habang conserving kakayahan upang lumahok sa pagbuo ng hESCs primordial mikrobiyo cell ng chimeric embryo. Ito ay ipinapakita na lamang ng isang supling ng mga genetically mabago PGCs kolonisahan lahat ng mga pangunahin at mga mikrobyo na bumubuo ng tela chimeric embryo na nakuha sa pamamagitan ng pagsasama-sama o coculture ng mga cell na may 8-cell embryo. Kapag transplanted sa Mice morula ESCs transfected may green fluorescent protein gene, fluorescent kaapu-apuhan ng mga cell ay natagpuan sa lahat investigated tisyu ng pagbuo ng bilig (Shimada, 1999). Paglipat ng ESC sa morula ay maaaring lumikha ng viable mga daga, ang katawan na kung saan ay binubuo lamang ng mga kaapu-apuhan ng donasyon ang ESC, na kung saan ay bubukas up ng pagkakataon para sa isang iba't ibang mga nakakagaling na mga pagpipilian sa pag-clone. Ngayon tulad ng isang sistema diskarte ay matagumpay na inilapat sa pag-aaral ng mga problema ng pag-unlad biology, sa partikular, maaari itong pag-aralan ang genetic mekanismo ng inactivation ng kromosomang X o epigenetic kawalang-tatag ng hESCs. Paglipat ng ESC sa unang bahagi ng embryo ay ginagamit sa agrikultura biotechnology, pati na rin sa pang-eksperimentong mga gene therapy.

Ang mga transplant ng genetically modified ESCs ay ginagamit upang subukan ang mga target cell ng mutant genes. Ang vitro cultured ESCs ay ginagamit sa biotechnology upang lumikha ng mga mice ng knockout. Para sa layuning ito, sa pamamagitan ng homologo recombination upang maalis mula ESCs aaral gene (knockout) at mapamili media ilihim cell kulang gene na ito. Pagkatapos ng knockout ESCs ay injected sa blastocyst o pinagsama-sama sa blastomeres ng morula. Ang kaya nakuha chimeric unang bahagi ng embryo ay transplanted sa isang tatanggap babae at bagong panganak na daga napiling mga indibidwal na may mga gamete, nullizigotnymi ng gene na ito. Sa teknolohiyang ito, maraming mga linya ng mga mice ng knockout ang nalikha, na malawakang ginagamit sa pang-eksperimentong biology at pang-eksperimentong gamot. Sa mga biological mga modelo aral ang halaga ng mga tiyak na genes sa embryonic unlad, pati na rin ang kanilang papel sa mekanismo ng sakit at pathological kondisyon sa mga tao. Bilang karagdagan, ang mga linya ng mga hayop ng knockout ay ginagamit sa pasimula ng pagsubok ng mga bagong pamamaraan ng gene therapy. Halimbawa, gamit ang gene transfection sa ESK normal allele ng mutant gene pamahalaan epektibong naitama pagbago, naaabot ang hemopoietic system. Ang panimula ng mga dayuhan na genes sa ESC ay nagpapahintulot sa paglikha ng mga linya ng mga homozygous transgenic na mga laboratory animal sa isang pinabilis na rate. Gayunpaman, dapat ito ay mapapansin na ang mga pamamaraan na itinuro recombination gene pagtanggal mapagkakatiwlaan nagtrabaho out pa lamang relatibong ESC Mice. Paggamit ng murine ESCs double knockout install functional papel na ginagampanan area kumpol ng gene sa kromosomang 7 (copy genomic rehiyon 19 minuto kromosoma ng tao), at ang proximal bahagi ng ika-11 chromosome (kopyahin pantao 5d chromosome) - pagtanggal ng mga gene sa Pinahintulutan ng ESK mice na suriin ang pag-andar ng kanilang mga analogue sa mga tao.

Ang kapasidad na function na pag-aaral ng tao embryonic gene, transfection sa gene na kung saan mga hayop laboratoryo pinapayagan hESCs sa partikular crypto linawin ang papel na ginagampanan ng mga gene sa tab at bumubuo ng cardiogenic mesoderm, pax-6 gene - sa embryogenesis mata. Ay bumubuo sa unang pagpapahayag ng mga gene sa wala pa sa gulang ng lumalaganap card ESC teratocarcinoma at blastocyst daga nakumpirma napakatinding panunupil sa ESK transsignalizatsii genes. Ang kumbinasyon ng mga mutant ESCs 60-80 at 20-30 cells ng normal na pre-pagtatanim mouse embryo ay humahantong sa ang pagbuo ng chimeric embryo kung saan bookmark katawan ay binubuo ng mga donor at recipient cell, na nagbibigay-daan sa amin upang matukoy ang papel na ginagampanan ng mga hindi kilalang mga gene sa gastrulation at organogenesis. Functional na mapa ng gene pagbuo mouse embryo pinalaki detalye ng papel na ginagampanan ng gene sf-1 tab sa adrenal gland at genital primordia, wt-1 gene - sa bato tab myoD gene pamilya - sa tab ng kalansay kalamnan gene pamilya gata-1-4 - sa mga paghihigpit pagkahinog mga pamantayan ng erythro- at mga lymphopoiesis.

Sa direksyon off ng mga ina at ama alleles ng mga gene sa hESCs gamit vector recombinase nagsilbi upang linawin ang mga function ng iba't-ibang mga gene sa panahon ng maagang embryogenesis at teknolohiya sa pag-target ng mga tao na hindi alam na gene sa mouse ESCs mag-ambag sa pagtuklas ng mga bagong mutant gene na responsable para sa pag-unlad ng malubhang sakit na namamana. Ang paggamit ng paraan ng knockout tinukoy isumpa kabuluhan ng ilang mga gene para sa pagtula embryonic tisiyu: gata-4 - para infarction, gata-1 - sa erythroid hemopoietic tissue, myoD - ng kalansay kalamnan, brachyury - para sa mesoderm paghihigpit transcriptases hnf3 at hnf4 - para sa atay stem cell, sira-sira-2 - bookmark para sa panggagaya ng T at B lymphocytes (Repin, 2001). Double pagtanggal ng gene sa hESCs Nagbukas access sa pag-aaral ng functional papel na ginagampanan ng genes ng sa sumisibol na mga layer, segmentation at homeosis at ESC transplantation ibinigay ang posibilidad ng pagkuha ng viable interspecific hybrid embryo. Na may pinahusay na mga pamamaraan ng paglipat ng mga donor PGCs sa isang solong 8-cell embryo napatunayan na ang chimerization sa cellular antas ng maraming mga organo ng ang tatanggap embryo. Tandaan na ang cell sprouts ay matatagpuan sa tao tissue tatanggap daga bahagi ng katawan pagkatapos ng pamamahala ng tao hematopoietic cell stem sa isang blastocyst. Ito ay natagpuan na sa mouse embryo sa panahon ng pormasyon ng katawan dugo nagpapalipat-lipat pluripotent hESCs. Ito ay posible na ang kanilang mga biological function ay ang organisasyon ng hinaharap pangsanggol immune system. Sa ESC sa vitro muling ginawa ng sapat na mga modelo ng tao genetic sakit: double knockout modelo dystrophin gene sa Mice ng Duchenne muscular dystrophy, shutdown atm gene (control signal synthesis kinase chromatin) - ataxia-teleangektaziyu. Sa kasong ito, ang isang malalang minamana sakit sa mga bata dahil sa mga depekto sa DNA repair bubuo pagkabulok ng Purkinje cell sa cerebellum, na kung saan ay sinamahan ng isang kaguluhan ng thymus dahil sa ang kamatayan ng proliferating cell. Clinic, pathophysiology at patomorfologija ataxia-teleangek- tazii muling ginawa sa pamamagitan ng sa pagpapakilala sa ESC abnormal genetic na impormasyon mula sa mga daga chimeras tumutugma sa mga sa mga tao. Higit pa rito ataxia-teleangektazii gamit PGCs at knockout mice binuo pang-eksperimentong modelo, ang ilang namamanang homozygous mga tao na sakit na nauugnay sa disorder ng karbohidrat at lipid metabolismo, catabolism ng amino acids, pag-aalis ng tanso at bilirubin, na kung saan makabuluhang tumaas ang posibilidad ng pang-eksperimentong gamot para sa preclinical pagsubok ng mga bagong pamamaraan para sa pagpapagamot ng mga kaugnay na sakit karapatan.

[12], [13], [14], [15]

Ang paggamit ng stem cell cytohybrid

Ang hybrid na mga cell na nakuha sa pamamagitan ng pagsasama-sama somatic cell mula hESCs, ay sapat na at promising modelo para sa pag-aaral ng stem cell pluripotency at reprogramming ng differentiated cell chromosomes. Tsitogibridy nakuha sa pamamagitan ng pagsama-sama ng ESC may differentiated cell ng adult hayop, ay nagbibigay ng isang pagkakataon upang pag-aralan ang ugnayan sa pagitan ng mga genome ng iba't ibang mga "edad": bubuo ng isang natatanging sitwasyon kung saan ang homologo chromosomes nakuha mula sa mga cell ng iba't ibang antas ng pagkita ng kaibhan, at iba't ibang grado ng kapanahunan, ay nasa parehong nucleus, kung saan maaari nilang madaling transdeystvuyuschimi ibahagi regulasyon signal. Ito ay mahirap upang mahulaan kung ano ang magiging reaksyon tsisregulyatornye epigenetic sistema ng homologo chromosomes umiiral sa panahon yn dividual pag-unlad, bilang tugon sa mga signal ng epekto transdeystvuyuschih mula sa embryonic kaugnay na genome. Dagdag pa rito, sa hybrid na mga cell ay nangyayari paghihiwalay ng magulang chromosome na nagbibigay-daan sa pag-aaral ng pakikipag-ugnayan ng mga genome na sa hiwalay na mga antas ng kromosoma, ibig sabihin, potensyal na makilala ang mga bahagi ng mga tiyak na chromosomes sa pagpapanatili ng pluripotency, o sa kabaligtaran, isang output sa pagkita ng kaibhan.

Bilang unang pang-eksperimentong modelo para sa pag-aaral ng pakikipag-ugnayan ng mga genome ng mga iba't ibang "kasaysayan ng pag-unlad" na ginagamit tsitogibridy nakuha sa pamamagitan ng merging teratokartsinomnyh pluripotent at differentiated somatic cell. Sa ilang mga kaso, pinanatili ng gayong mga hybrid na selula ang mga katangian ng pluripotent sa sapat na mataas na antas. Sa partikular, sa Vivo somatic hybrid teratokartsinomno-cells ay sapilitan na pag-unlad ng tunay teratomas na naglalaman ng derivatives ng lahat ng tatlong mga mikrobyo layers, ang isang sa vitro sa suspensyon kultura binuo embryoid katawan. Kahit sa ganitong uri ng interspecies tsitogibridov nabanggit ang presensya ng pangsanggol antigens sa mga kaso kung saan ang somatic partner sa pagsama-sama na may mga cell teratocarcinoma ay lymphocytes o thymocytes. Kapansin-pansin na tsitogibridy sa pamamagitan ng cell pagsama-sama teratokartsinomnyh sa fibroblasts, pare-pareho sa phenotype ng fibroblasts.

Ang pinaka-mahalaga ay na ang isang itinatag katunayan na in-teratokartsinomno somatic hybrid na mga cell ay nagpakita palatandaan genome reprogramming ng differentiated cell, nailalarawan sa pamamagitan ng isang muling pag-activate ng mga indibidwal na mga gene o hindi aktibo X-kromosoma somatic partner. Sa gayon, ang mga resulta ng pananaliksik sa uri tsitogibridah teratokartsinomno-somatic cell ay nagpapahiwatig na ang hybrid na mga cell ay madalas na pinanatili pluripotency at reprogramming ng genome, may mga palatandaan ng somatic partner.

Sa mga eksperimento upang makuha ang embryonic intraspecific hybrid na mga cell sa pamamagitan ng pagsasama-sama splenocytes gamit ang mouse ESCs adult hayop aral katangian tulad tsitogibridov, paghihiwalay pagtatasa ng parental chromosomes at tinasa pluripotency hybrid genome. Para sa interspecific hybrid cells nagawa sa pamamagitan ng fusion teratocarcinoma mga cell na may somatic cell, sa pangkalahatan ay nailalarawan sa pamamagitan ng mababang segregation ng chromosomes na may tetraploid o malapit-tetraploid karyotype. Ang isang katulad na komposisyon ng chromosomal ay sinusunod sa cytohybrid sa pamamagitan ng pagsasanib ng mga pangunahing selula ng sex na may mga lymphocytes. Kasabay nito, ang interspecific hybrid cells nakuha bilang isang resulta ng pagsama-sama ng mouse lymphocyte cell teratokartsinomnyh mink, nagkaroon ng matinding paghihiwalay ng chromosomes somatic partner.

A sundin bagong yugto ng pag-aaral ng paghihiwalay ng mga magulang chromosomes sa interspecific hybrids ay dumating pagkatapos ng pag-unlad ng microsatellite pamamaraan sa pagtatasa gamit ang polymerase chain reaction, kung saan ang bawat mouse chromosome natagpuan ng ilang daang mga marker, na nagpapahintulot sa mapagkakatiwlaan maaaring makita ang kaibhan sa pagitan ng anumang mga pares ng homologo chromosomes sa hybrid na mga cell.

Sa pamamagitan ng pinagsasama ang mga ESK (gamit ang HM-1 cell kulang sa gipoksantinfosforiboziltransferazy aktibidad, 2n = 40, XY, na nakahiwalay mula blastocysts mouse strain 129 / 01a) na may splenocytes mula sa mice congenic line DD / c nabigo upang makatanggap ng hanay ng mga hybrid panggagaya morphologically nagkaroon ng pagkakatulad sa hESCs. Ang lahat ng panggagaya ay ihiwalay sa pumipili daluyan, kung saan paglago ay posible lamang na may mga aktibong cell gipoksantinfosforiboziltransferazoy. Electrophoresis pagtatasa nagsiwalat ng pagkakaroon ng lahat ng panggagaya allelic variant gipoksantinfosforiboziltransferazy katangi-daga DD / c. Paggamit ng cytogenetic pagtatasa, ito ay natagpuan na apat ay may tatlong hybrid panggagaya okolodiploidny set ng chromosomes. Isang malapit-tetraploid clone na nakapaloob sa dalawang mga populasyon ng hybrid na mga cell, isa rito ay tetraploid, at ang pangalawa, mas maliit na - diploid.

Pagsusuri ng microsatellite na nagbibigay-daan upang makita ang kaibhan sa anumang mga pares ng homologo chromosomes mouse 129 / 01a at DD / c, sa hybrid panggagaya na may okolodiploidnym set ay nagpakita na ang panggagaya naganap sa dalawang natatanging mga katig aalis autosomes somatic partner. Karamihan autosomal panggagaya HESS2 at HESS3 nagkaroon marker line 129 / 01a, ie, pluripotent partner. Ang pagbubukod ay ang chromosome 1 at I: panggagaya HESS2 at HESS3, kasama ang mga marker ng HM-1 cell, isang maliit na bilang ng mga marker kasalukuyan somatic partner. Ang mga resultang ito ay maaaring sumalamin hindi kumpletong paghihiwalay ng mga chromosomes 1 at at somatic partner at ikaw ay pare-pareho sa cytogenetic data na trisomy ng chromosomes na nagaganap sa 30-40% HESS2 at HESS3 cell panggagaya. HESS4 clone differed makabuluhang sa chromosomal komposisyon: maraming autosomes clone na ito nagmula sa genome ESK (chromosomes 2, 3, 4, 5, 6, 7, 10, 13, 14 at 17), ngunit chromosomes 1, 9, 11, 12, 15, 16, 18 at 19 ay iniharap homologs ng parehong mga magulang. Ang dami ratio ng microsatellite marker mga homologo chromosomes corresponded humigit-kumulang 1: 1. Ito pinapayagan ang mga may-akda upang magmungkahi na ang isa homolog ay nagmula sa genome ng ESC at ang iba pang - mula sa differentiated cell. Sa ilang mga subclones ng clone HESS4 sinusunod lamang token pagkakaroon ng chromosomes 18 at 19 somatic partner. Ang mga resulta ay nagpapakita na ang mga cell clone HESS4, bilang karagdagan sa ang paghiwalay ng chromosomes somatic partner, nagkaroon ng pag-aalis ng isa o parehong mga homologs ng nasa itaas chromosome pluripotent genome, ibig sabihin, nagkaroon ng two-sided segregation ng chromosomes ng parehong mga magulang - ang kababalaghan ay medyo hindi pangkaraniwang, dahil tsitogibridov katangi segregation ng chromosomes lamang isa sa mga magulang.

Sa karagdagan, pagkatapos ng ika-20 talata, ang lahat ng panggagaya ng hybrid na mga cell na naglalaman lamang ang X chromosome marker ng somatic partner, iyon ay, sa panggagaya ay pinalitan X chromosome ESC sa kromosomang X ng somatic partner. Kumpirmahin ang katotohanang ito kritikal na data sa lugar ng kinaroroonan paghahalo ng lahi gamit FITC-na may label na probe tiyak na para sa X chromosome Mouse: positibong signal ay napansin lamang sa isang kromosoma. Tandaan na sa mas maagang timing ng paglilinang (hanggang sa ika-15 talata) ayon cytogenetic data kasalukuyan dalawang X chromosomes sa maraming mga cell. Bilang resulta, ang paggamit ng mapamili media ay nagbibigay-daan sa iyo upang manipulahin ang chromosomal komposisyon ng hybrid cell at nakadirekta upang piliin panggagaya nagdadala single chromosome somatic partner ESCs sa background genome.

Bilang isang natatanging tampok ng genome tsitogibridov ay ang localization ng mga magulang na genome sa isang solong core, siyempre, itinaas ang tanong ng pagpapanatili ng mga katangian ng pluripotent embryonic genome ESC-somatic cell hybrids sa mga kondisyon ng close contact sa genome ng differentiated cell. Ang morphologically ang cytohybrid ng ESC at somatic cells ay katulad ng linya ng magulang ng ESC. Qualification pluripotency ay nagpakita na ang lahat ng panggagaya okolodiploidnym set ng chromosomes Nagawa na nabuo sa suspensyon kultura ng embryoid mga katawan na kung saan ang derivatives sa tatlong mikrobyo layers kasalukuyan.

Karamihan sa mga hybrid cell ay naglalaman ng antigen ng ECMA-7, isang marker na katangian ng mga unang embryo ng mouse, at mayroon ding mataas na aktibidad ng alkaline phosphatase. Ang pinaka-kapani-paniwala na data sa mga mataas na pluripotent properties ng hybrid cells ay nakuha sa mga eksperimento upang makuha ang isang serye ng mga chimeras na iniksyon na kinasasangkutan ng hybrid cells ng clone HESS2. Ang pagsusuri ng biochemical markers ay nagpakita na ang mga inapo ng donor hybrid cells ay natagpuan sa karamihan sa mga tisyu ng chimera. Samakatuwid, ang hybrid cells na nakuha sa pamamagitan ng pagsasanib ng ESC at somatic differentiated cells ay nagpapanatili ng pluripotency sa isang mataas na antas, kabilang ang kakayahang bumuo ng mga chimeras kapag ipinasok sa blastocyst cavity.

Ang mga clone HESS2 at HESS4 ay naiiba nang malaki sa komposisyon ng mga chromosome ng magulang, ngunit mayroon silang katulad na pluripotent properties. Gusto One ipalagay na plyuripotentnostv 'sa hybrid genome ang sarili nito bilang isang nangingibabaw na pag-sign, ngunit ito ay posible na hindi lahat ng mga embryonic genome chromosomes ay kasangkot sa pagpapanatili ng pluripotency. Kung tama ang palagay na ito, maaaring asahan ng isa na ang pag-aalis ng ilang mga chromosome ng pluripotent na kasosyo mula sa hybridoma genome ay hindi sasamahan ng pagbabago sa kanilang katayuan sa pluripotent. Sa kasong ito, ang pagsusuri ng paghihiwalay ng mga chromosome ng magulang sa embryonic hybrid cells ay nagpapahintulot sa isang malapit na diskarte sa pagkakakilanlan ng mga chromosome na responsable sa pagkontrol sa pluripotency ng mga embryonic cell.

Serov O. Et al (2001) na natagpuan sa gitna ng 50 supling na nakuha mula sa mga pasakit ng chimeras gamit normal Mice, ang mga na kung saan ay magkakaroon ng genotype daga 129 / 01a, at dala-dala ang X chromosome DD Mice. Nakita ng mga may-akda ang dahilan para sa pagbabawas ng pluripotency sa hybrid cell sa ilalim ng impluwensya ng somatic genome. Ang isang alternatibong paliwanag ay maaaring ang negatibong epekto ng trisomy sa ilang autosomes at imbalances sa mga chromosome sa sekswalidad (XXY ay sinusunod sa mga selula bago ang ika-15 na daanan) sa hybrid na mga cell kapag sila ay dumaan sa meiosis. Ito ay kilala na ang mga cell ng XXY ay hindi maaaring pumasa sa meiosis at bumuo ng gametes. Ang Trisomy ay maaari ding maging sanhi ng isang pagbaba sa proliferative aktibidad ng mga hybrid na mga cell, bilang isang resulta na kung saan ang piling kalamangan sa pag-unlad ng chimeras maaaring nabibilang sa mga cell ng embryo tatanggap. Sinusunod nito na upang lubusang suriin ang potensyal na pluripotent ng hybrid cells, kinakailangan upang makakuha ng hybrid na mga klon na may isang normal na diploid na hanay ng mga chromosome.

Sa mga eksperimento Serova O. Et al (2001) unang nagpakita ang posibilidad ng reprogramming ang X chromosome sa genome ng isang somatic cell hybrid cell. Konklusyon na ito ay sumusunod mula sa mga may-akda aralan ang expression ng chimeras hprt gene (X-kromosoma marker): ang pagkakaroon ng allelic variant hprt DD / c Mice ay napansin sa lahat ng tisyu aralan chimeric. Dapat itong bigyang-diin na pagkatapos ng pagpapakilala ng hybrid cell sa blastocyst lukab tsitogibridy mahulog sa di-pumipili kondisyon at ang pangangalaga ng kromosomang X sa genome ng hybrid cells nangangahulugan na ito ay naging isang isumpa bahagi ng kanyang genome at hindi maaaring makita ang kaibhan ito mula sa Y chromosome pluripotent partner.

Sa pagbubuod ng mga resulta ng pag-aaral ng pakikipag-ugnayan ng somatic at pluripotent embryonic genome sa hybrid na mga cell, ang mga may-akda tapusin na, sa ilang mga tsitogibridah pluripotency ay lumilitaw bilang isang nangingibabaw na katangian. Ang hybrid gene na may kakayahang mga indibidwal na chromosomes reprogram differentiated cell, na kung saan, gayunpaman, ay hindi pumipigil sa tagapaglistang reverse epekto sa somatic genome pluripotency ng embryonic genome. Sa paglilinang ng hybrid cells, ang induction ng pagkita ng kaibhan ay mas madalas kaysa sa orihinal na linya ng magulang ng ESC NM-1. Ang isang katulad na epekto ay sinusunod sa pagbuo ng mga pangunahing colonies: maraming mga pangunahing colonies ng embryonic hybrid cells iba-iba sa maagang yugto ng pagbuo na may malaking pagkalugi ng mga panggagaya sa panahon ng kanilang pagpili at pagpaparami.

Kaya, tsitogibridy sa pamamagitan ng pagsama-sama ng ESC sa somatic cell, sa kabila ng malapit na kontak sa ang genome ng differentiated cell panatilihin ang pluripotency bilang isang natatanging tampok ng embryonic genome. Bukod pa rito, sa gayong mga hybrid na selula, posible na reprograma ang mga indibidwal na chromosome na nagmumula sa diffused cells. Ito ay nananatiling hindi maliwanag kung gaano kahusay mapapanatili plyu- ripotentnye katangian ng embryonic genome sa hybrid na mga cell, sa partikular, ang kanilang kakayahan upang lumahok sa pagbuo ng mga mikrobyo-line chimeras. Para sa mga ito, ito ay kinakailangan upang makakuha ng embryonic hybrid na mga cell na may isang normal na karyotype. Sa anumang kaso, ang pluripotent embryonic hybrid na mga cell ay maaaring maging isang tunay na modelo para sa genetic pagkakakilanlan ng chromosomes kasangkot sa pagpapanatili ng pluripotency o ang kanyang control bilateral paghihiwalay ng magulang chromosomes potensyal na nagbibigay ng ganitong pagkakataon.

Walang mas kaakit-akit ang pag-aaral ng hindi pangkaraniwang bagay, na kung saan ang O. Serov at co-authors (2001) ay tumutukoy bilang "chromosomal memory". Sa hybrid genome homologo chromosomes dalawang alternatibong mga configuration: homologues somatic partner sabay undergone differentiation, samantalang homologs pluripotent partner, ang prosesong ito ay nagsisimula pa lang. Samakatuwid, pagpapanatili ng mataas na pluripotent katangian ng hybrid na mga cell ay nagpapahiwatig na "pluripotent" configuration homologues ESC walang kinikilingan matatag sa hybrid genomes, sa kabila ng ang epekto ng transdeystvuyuschih kadahilanan emanating mula sa somatic partner. Ang itaas na inilarawan tampok ng reprogramming differentiated homologo genome chromosomes sa panahon ng pag-unlad ng mga chimeras hindi ibukod ang posibilidad na ang unang yugto ng pagbubuo nito sa vitro at culturing tsitogibridov mapanatili nila ang kanilang katayuan nakuha sa panahon ng kaibhan sa Vivo. Ayon sa kamakailang data, kapag ang paglilipat ng mga embryonic hybrid cell sa di-pumipili daluyan na kung saan doon ay isang masinsinang pag-aalis chromosomes lamang somatic partner, ibig sabihin, ang genome ng hybrid cells madaling discriminates homologs pagkatapos sa vitro kultura para sa 10-15 passages. Kaya, embryonic hybrid cells kumakatawan sa isang promising pang-eksperimentong modelo para sa pag-aaral hindi lamang sa mga pangunahing katangian ng embryonic genome bilang pluripotency, kundi pati na rin mga alternatibo nito - embryonic pagkita ng kaibhan.

Therapeutic efficacy ng embryonic stem cell transplantation

Bago pag-aralan ang therapeutic efficacy ng ESC transplantation at ang kanilang mga derivatives, inirerekumenda namin ang materyal sa itaas. Mga Tampok ESC sa mga tuntunin ng ang buong pagpapatupad ng embryogenesis sa vitro ay hindi sapat na dahil sa mga depekto sa kasong ito dahil sa kawalan ng mesenchymal cell stem na kung saan nangyari sa katawan autonomously at nang nakapag-iisa mula sa hESCs. Genetic potency ESK mas genetic potensyal zygotes samakatuwid direkta para sa pag-clone embryo ESCs hindi na ginagamit. Mga natatanging biological potensyal ng hESCs bilang tanging mga cell sa kung saan-unlad programa ay deployed ganap na pare-pareho pagpapatupad, na nahahanap ang aplikasyon sa pag-aaral ng gene function aaral. Gamit ang ESK natupad nagde-decode ang unang kumbinasyon signal na i-activate ang pagpapahayag ng maaga at late gene, coding para sa pag-unlad ng tatlong mikrobyo layer. Pagpapanatili sa genome pluripotency ng ESCs sa vitro gumagawa ng mga ito natatanging tool para sa pagkumpuni ng pagbabagong-buhay na maaaring awtomatikong bumawi para sa cell pagkalugi nasira organo at tisyu. Sa isang ideal na hypothetical embodiment maaaring ipagpalagay na "... Sa paglipat ng mga donor PGCs sa recipient organismo ay inililipat compactly naka-package na mga programa na sa ilalim ng kanais-nais na kondisyon ay natanto sa konstruksiyon ng mga bagong tkani'7 capable" ... Epektibo na isinama sa katawan ng tatanggap ng morphological, parehong functional at functional. "

Naturally, pagsunod sa pag-unlad ng mga pamamaraan para sa monodifferentiation ng ESC, ang sa vivo pag-aaral ng pagganap na aktibidad ng mga cell na nakuha sa vitro mula sa isang solong pinasadyang clone nagsimula. Ang proliferating clone ESO ay bumubuo ng populasyon ng mga migrating na mga selulang nanggagalit na talagang may kakayahang pagsasama sa mga tissue damage zone ng tatanggap, na ginagamit sa regenerative-plastic medicine. Ito ay itinatag na ang paglipat ng Dopa-neurons sa substantia nigra ay binabawasan ang mga clinical manifestations sa experimental hemiparkinsonianism. Ang mga rehiyonal na transplant ng mga donor neural stem cell ay nagbabawas sa antas ng mga karamdaman sa motor na dulot ng trauma o contusion ng spinal cord at utak. Natanggap at ang unang positibong resulta ng paglipat ng stem cell sa mga sakit na demyelinating. Tila na ang pagbabagong-buhay-plastic potencies ng ESCs magbukas ng walang limitasyong mga posibilidad para sa paggamit ng cellular paglipat sa praktikal na gamot. Gayunpaman, kapag ang paglipat sa ectopic zones, ang mga ESC ay hindi maaaring hindi magbago sa mga tumor. Kapag ang subcutaneous injection ng ESC sa mga immunodeficient mice teratomas ay nabuo. Kapag transplanting sa ilalim ng capsule slurry ESK bayag sa syngeneic daga rin ay nabuo teratomas na binubuo ng iba't ibang mga tisiyu, mga cell na kung saan ay derivatives ng lahat ng tatlong mga mikrobyo layer. Sa ganitong mga teratoma, ang mga proseso ng nabawasan na organogenesis ay napakabihirang.

Ang isang bilang ng mga gawa ay nagbibigay ng impormasyon sa mga positibong resulta ng paglipat ng mga naunang derivatives ng ESCOs sa mga hayop na may isang ex-perimental patolohiya. Cell neurotransplantation gamit derivatives ng PGCs ay karagdagang binuo sa eksperimento at ang unang clinical trials sa pagwawasto ng functional disorder sa utak at utak ng galugod trauma, paggamot ng syringomyelia at maramihang esklerosis (Repin, 2001). Sa pagdating ng teknolohiya neyronogeneza ESCs sa vitro, sa halip ng paggamit embryonal utak tissue transplant pamamaraan na binuo derivatives ng neurospheres, na nakuha mula sa mga kultura ng mga embryonic neural tissue. Ang nasabing mga suspensyon sa paglipat ay mas magkakatulad at naglalaman ng mga nakatuon na neuronal at neuroglia precursors.

Bilang karagdagan sa mga regular na medium kultura na may retinoic acid sa isang dosis ng 10 ug / ml para sa 6 na linggo sa embryonic linya (teratomas) NTERA-2 tao -kartsinomy binuo higit sa 80% ng mga post-mitotic neurons. Ang kumpletong homogeneity ng neuronal populasyon ay nakamit sa pamamagitan ng daloy ng pag-uuri na may label immunophenotypic marker ng mature neurons na maaaring mapupuksa ang mga labi teratokartsinomnyh at wala pa sa gulang na mga cell. Pagkatapos ng paglipat sa iba't ibang mga rehiyon ng utak ng pang-eksperimentong mga hayop tulad neurons ay hindi lamang nakataguyod makalipas ang, ngunit din naka-embed sa mga rehiyonal na neural network. Sa mga hayop na may mga pang-eksperimentong mga modelo ng mga lokal na mga depekto CNS neurotransplantation binabawasan clinical manifestations ng tao patolohiya tulad ng ang mga epekto ng craniocerebral trauma, stroke, demyelinating sakit, nasasalin cerebellar unlad depekto, sakit pagtitiwalag ng lipids at polysaccharides.

Upang ma-optimize ang mga proseso ng pagbabagong-buhay sa degenerative na mga sakit ng central nervous system, ang mga teknolohiya para sa paghahanda ng mga oligodendrocyte na gumagawa ng myelin ay binuo. Ang unang yugto ay tradisyonal na nagsasangkot sa paglaganap ng ESCs sa pagpaparami ng bilang ng mga selula na kinakailangan para sa paglipat. Sa pangalawang yugto, ang itinuro na pagkita ng kaibhan ng mga selula sa isang populasyon ng myelin na gumagawa ng oligodendrocyte precursors ay isinasagawa, na kinokontrol ng mga antigens na pinipili ng marker.

Ang ilang mga prospects ang binuksan para gamitin derivatives ESCs upang bumuo ng mga pamamaraan para sa pagwawasto ng immunodeficiency sanhi ng genetic mga depekto sa ang pagkahinog ng thymus. Sa mga pag-aaral sa knockout (trapo 1) mice na may sapilitan gene depekto - labag recombination mekanismo V (D) J gene loci TCR, na humahantong sa pagkawala ng pag-andar ng T-lymphocytes, transplantation unang bahagi ng derivatives ng PGCs sa thymus hayop recovers pagkahinog ng normal na populasyon ng immune panggagaya responsable para sa cellular immunity. Klinikal na pagsubok ng paglipat preformed sa vitro hESCs sa paggamot sa malalang nasasalin anemya sa mga bata.

Ang mga pagtutol sa mabilis na pagpapakilala ng paglipat ng stem cell sa klinika ay nabibigyang-katwiran sa pamamagitan ng isang limitadong bilang ng mga matatag na linya ng mga selulang embrayo ng tao na stem at ang pangangailangan para sa kanilang standardisasyon. Upang madagdagan ang kadalisayan ng mga pamantayan ng ESC, pati na rin ang mga adult stem cell, ang isang paraan ng pagpili ng linya batay sa molekular genetic analysis ng maikling mga pag-uulit ng tandem ng DNA ay iminungkahing. Kinakailangan din upang subukan ang mga linya ng ESC para sa pagkakaroon ng maliit na chromosomal rearrangements at genetic mutations, ang potensyal na posibilidad ng kanilang paglitaw sa ilalim ng mga kondisyon ng paglilinang ng cell ay sapat na mataas. Thesis umaabot ipinag-uutos na pagsubok ang mga katangian ng lahat ng uri ng PGCs at rehiyonal na pluripotent stem cell, mula sa kanilang pagpapalaganap sa vitro ay maaaring pagsimulan ng bagong mga katangian na hindi likas na taglay ng embryonic cell stem sa depinitibo o tisyu. Sa partikular, ito ay ipinapalagay na pang-matagalang paglilinang sa media na may cytokines Hess mas malapit sa mga cell tumor, dahil nagaganap sila katulad na pagbabago daanan ipinaguutos cell cycle sa pagkuha ng ang kakayahan upang ipatupad ang isang walang limitasyong bilang ng mga cell dibisyon. Ang ilang mga may-akda, batay sa potensyal para sa pag-unlad ng mga bukol, isaalang-alang ang pag-transplant ng tao ng mga unang derivatives ng embryonic stem cells bilang kawalang-ingat. Sa kanilang opinyon, mas ligtas ang paggamit ng mga nakatalagang mga kaapu ng ESC, samakatuwid nga, ang mga linya ng mga ninuno ng mga selulang naiiba. Gayunpaman, ang isang maaasahang pamamaraan para makuha ang matatag na mga linya ng cell ng tao na nag-iiba sa tamang direksyon ay hindi pa binuo.

Kaya, sa panitikan mayroong higit at higit na data sa positibong nakakagaling na epekto ng paglipat ng human embryonic stem cell derivatives. Gayunman, marami sa mga gawaing ito ay napapailalim sa rebisyon at pagpuna. Ang ilang mga mananaliksik ay naniniwala na ang mga resulta ng maagang mga klinikal na pagsubok ay paunang likas na katangian at iminumungkahi lamang na ang mga stem cell ay maaaring magkaroon ng kapaki-pakinabang na epekto sa klinikal na kurso ng isang sakit. Samakatuwid, ito ay kinakailangan upang makakuha ng data sa pang-matagalang resulta ng paglipat ng cell. Bilang isang argumento, ang mga yugto ng pag-unlad ng clinical neurotransplantology ay ibinibigay. Sa katunayan, sa panitikan, sa una dominado ng publication ng ang mataas na kahusayan ng utak transplants fragment ng embryo sa Parkinson ng sakit, ngunit pagkatapos ay nagsimula na lumitaw ulat sa hindi pagbibigay therapeutic espiritu ng embryonic o pangsanggol neural tissue transplanted sa ang talino ng mga pasyente.

Na isinasagawa ang unang clinical trials pagtatasa ng kaligtasan ng transplantation neuroblast - derivatives ng PGCs NTERA-2 teratocarcinoma, wala pa sa gulang na mga cell na kung saan ilaganap sa kultura ay sumailalim sa imbakan 100 ika-angaw cell masa. Bahagi ng gayon-nakuha cell ay ginamit upang matukoy ang mga katangian ng cell phenotype at impurities, pati na rin upang subukan ang mga potensyal na karumihan sa pamamagitan ng mga virus at bakterya. Mula sa kultura medium ay inalis LIF at feeder layer ng mga cell stromal at pangsanggol nilikha ang mga kondisyon para nakadirekta pagkita ng kaibhan ng hESCs sa neuroblasts na may isang kumbinasyon ng mga cytokines at paglago kadahilanan. Pagkatapos ay purified mula sa wala pa sa gulang neuroblasts teratocarcinoma cells sa pamamagitan ng isang daloy ng cell sorter. Matapos ang ikalawang purification at paglalarawan ng mga phenotype ng transplanted cell neuroblasts (10-12 milyon) suspension gamit ang isang espesyal hiringgilya at microcannulas stereotaxy at sa ilalim ng kontrol ng CT injected papunta sa nucleus basalis ng utak ng mga pasyente (ikapitong buwan pagkatapos ng hemorrhagic stroke). Odnogodovoy post-transplant pag-screen ang mga epekto ng paglipat ng mga neurons sa stroke zone nagsiwalat walang mga salungat at hindi nais na effect. Kalahati ng mga pasyente na kinuha ilagay sa isang pagpapabuti ng motor function na sa panahon ng mula 6 hanggang 12 na buwan pagkatapos ng paglipat. Ang tiyak na klinikal na mga pagbabago ay sinamahan ng isang pagtaas sa suplay ng dugo stroke zone pagkatapos ng paglipat ng mga cell: ibig sabihin ng pagsipsip pagtaas ng pag-ilaw-na may label na 2-deoxyglucose, ayon positron emission tomography naabot 18%, at sa ilang mga pasyente - 35%.

Gayunpaman, ang US National Institute of Health ay nagsagawa ng isang malayang pag-aaral ng clinical efficacy ng neurotransplantation sa mga pasyente na may Parkinsonism. Ang mga pasyente sa unang grupo ay inilipat sa embryonic nerve tissue na gumagawa ng dopamine, habang ang ikalawang pangkat ng mga pasyente ay sumasailalim sa maling operasyon. Ang mga resulta ay nagpapahiwatig ng isang zero clinical efficacy ng naturang neurotransplantation, sa kabila ng katotohanang ang droga na gumagawa ng mga neuron ng embryonic ay nakaligtas sa utak ng mga tatanggap. Bukod dito, pagkatapos ng 2 taon pagkatapos ng paglipat ng pangsanggol neural tissue sa 15% ng mga pasyente na binuo persistent dyskinesia, na kung saan ay absent sa mga pasyente sa grupo ng placebo (stem cells: pang-agham na pag-unlad at sa hinaharap na pananaliksik direksyon Nat Inst, of Health USA ...). Ang mga obserbasyon ng karagdagang pag-unlad ng sakit sa mga pasyente na ito ay patuloy.

Ang ilang mga may-akda magpatungkol sa nagkakasalungatang panitikan sa pagsusuri ng mga klinikal na espiritu Neurotransplantation data gamit ang isang iba't ibang mga diskarte sa pagpili ng mga pasyente na grupo, hindi sapat na mga pagpipilian ng layunin paraan para sa pagtatasa ng kanilang kalagayan at, pinaka-mahalaga, iba't-ibang mga tuntunin ng pag-unlad ng ang pangsanggol nervous tissue at sa iba't-ibang bahagi ng utak kung saan ang tela ay ginawa sa iba't ibang laki transplant at mga mekanikal na tampok ng operasyon.

Dapat ito ay nabanggit na sumusubok sa mga direktang paglipat ng pluripotent embryonic cell stem sa striatal rehiyon ng utak ng daga na may mga pang-eksperimentong katawan gemiparkinsonizmom sinamahan ESC paglaganap at ang kanilang pagkita ng kaibhan sa dopaminergic neurons. Kailangan itong ipinapalagay na ang bagong nabuo neurons epektibong built in sa neuronal network bilang ESCs pagkatapos ng paglipat na-obserbahan pagwawasto ng mga anomalya ng pag-uugali at motor kawalaan ng simetrya sa apomorphine test. Kasabay nito, ang ilan sa mga hayop ay namatay dahil sa pagbabago ng transplanted ESK sa tumor sa utak.

Eksperto ng US National at Medikal Academy, espesyalista ng National Institutes of Health ay naniniwala na ang mga klinikal na potensyal ng hESCs nararapat malubhang pansin, gayunpaman, ipilit ang pangangailangan para sa isang detalyadong pag-aaral ng kanilang mga ari-arian, ang posibilidad ng komplikasyon at pang-matagalang epekto sa mga eksperimento na may sapat na biological na mga modelo ng mga tao na sakit (Stem cells at ang hinaharap na regenerative medicine National Academy Press, Stem cell at ang mga direksyon sa pananaliksik sa hinaharap., Nat. Inst, ng Health USA).

Mula sa puntong ito ng view ng ito ay mahalaga na ang comparative histological pagsusuri ng mga pang-eksperimentong teratoma nakuha sa pamamagitan ng paglipat sa bayag slurry PGCs na may teratomas na may binuo dahil sa transplant maagang embrayo, na kung saan kasama rin kasalukuyan ESC ay nagpakita na ESK anuman ang kanilang pinagmulan o pakikipag-ugnayan sa sa pamamagitan ng mga o iba pang nakapalibot na mga selula sa parehong paraan mapagtanto ang kanilang mga potensyal na tumorigenic. Ito ay pinatunayan na ang naturang teratomas magkaroon ng isang clonal pinagmulan, tulad ng mula sa isang tumor ESCs ay maaaring mangyari, na binubuo ng mga derivatives ng lahat ng tatlong mga mikrobyo layer (.Rega, 2001). Kapansin-pansin na kapag transplanted sa immunodeficient daga-kopya PGCs na may normal karyotype at binuo teratomas na binubuo ng isang iba't ibang mga uri ng differentiated somatic cell. Ang mga pang-eksperimentong datos na ito ay ang perpektong patunay ng clonal pinagmulan ng teratom. Mula sa pananaw ng pag-unlad biology, iminumungkahi nila na ito ay hindi multiple ng nakatuon progenitor cells at pluripotent stem cell identity ay ang pinagmumulan ng differentiated derivatives ng lahat ng tatlong mga mikrobyo layer, teratoma mga bahagi. Gayunpaman, sa mga praktikal na cell transplantation mga resulta ng mga pag-aaral ay, kung hindi humahadlang, at pagkatapos ay isang babala sign ng mga potensyal na panganib, dahil ang pagbabakuna ESC o primordial mikrobiyo cell sa iba't ibang mga tisiyu ng mga adult immunodeficient daga hindi maaaring hindi nagiging sanhi ng pag-unlad ng mga bukol mula sa transplanted cell stem. Neoplastic degeneration ectopically transplanted ESC sinamahan ng paglitaw ng satellite populasyon ng differentiated cell - sa pamamagitan ng bahagyang iibahin ay tiyak na ESCs at progenitor panggagaya dedikado linya. Ito ay kagiliw-giliw na ang transplant hESCs sa skeletal na mga cell ng kalamnan na malapit teratokartsinomnymi neurons bumubuo ng mas madalas. Gayunpaman, sa pagpapataw PGCs Mace itlog o blastocyst sinamahan ng buong integration sa mga cell ng mikrobiyo walang ang pagbuo ng neoplastic cell. Kasabay nito ang ESC naka-embed sa halos lahat ng bahagi ng katawan at tisyu ng bilig, kabilang ang sekswal na pangunang simulain. Ang nasabing allofennye hayop ay unang inihanda ng subjecting ang teratocarcinoma cell 129 sa unang bahagi ng yugto ng embryo sa 8-100 cells. Sa allofennyh populasyon daga geterogenomnyh cell-nagmula donor PGCs ay ipinakilala sa utak ng buto, bituka, balat, atay at maselang bahagi ng katawan, na nagbibigay-daan sa iyo na lumikha sa eksperimento kahit interspecies cell chimeras. Ang mas maliit na panahon ng maagang embrayo, mas mataas ang porsyento ng mga cell chimerization, ang pinakamataas na antas chimerization sinusunod sa hematopoietic system, balat, nervous system, atay at maliit na bituka allofennogo embryo. Sa adult organismo ang tissue tumututol chimerization protektado mula sa pagkakalantad sa immune system ng mga hadlang tatanggap gistogematicalkie: transplant primordial mikrobiyo cell sa bayag parenchyma sinamahan ng pagpapasok ng mga cell donor stem papunta sa tatanggap tissue germenativny layer. Gayunman, ang ESC transplantation sa isang blastocyst formation chimeric primordia genitalia na kasama ng lahing donor primordial mikrobiyo cell ay hindi magaganap. ESC pluripotency kapag lumilikha ng mga espesyal na mga kondisyon at maaaring magamit para sa pag-clone: ESC transplantation daga 8-16-cell mouse embrayo, cell maitosis saan tsitokalazinom block, nag-aambag sa normal embryogenesis sa pag-unlad ng bilig donor PGCs.

Bilang resulta, isang alternatibo ay paglipat ng allogeneic ESC therapeutic pag-clone batay sa somatic cell nuclear paglipat sa isang enucleated oocyte upang lumikha ng isang blastocyst inner cell mass mula sa kung saan ay pagkatapos ay inilalaan linya ng genetically magkapareho donor PGCs somatic nucleus. Technically, ang ideyang ito ay magagawa, dahil ang posibilidad ng paglikha ng mga hESC linya mula blastocysts nakuha pagkatapos ng paglipat ng somatic nuclei na maging enucleated itlog cell paulit-ulit na pinatunayan sa mga eksperimento sa mga hayop laboratoryo (Nagy, 1990; Munsie, 2000). Sa partikular sa Mice homozygous para sa mga pagbago rag2, fibroblasts nakuha sa pamamagitan ng culturing subepidermal tissue cell ay ginamit bilang donor nuclei ay transplanted sa enucleated oocytes. Pagkatapos ng pag-activate, oocytes "zygote" may pinag-aralan hanggang sa blastocyst pagbuo, mula sa inner cell mass ay nakahiwalay PGCs at pagpasa sa kanila sa isang linya para sa mutant gene nullizigotnyh cells (rag2 ~ / ~). Sa pamamagitan ng homologous recombination sa mga ESCs, ang mutation ng isang allelic gene ay naitama. Sa unang serye ng mga eksperimento mula hESCs recombinant gene mababawi embryoid katawan ay inihanda, transfected cell niyaon may isang recombinant retrovirus (HoxB4i / GFP) at pagkatapos ng pagtatanim ng halaman sa Mice injected ugat rag2 ~ / ~. Sa ikalawang serye, ang tetraploid blastomeres ay pinagsama-sama sa mga genetically modified ESC at inilipat sa kanilang mga tatanggap na babae. Ang ipinanganak na immunocompetent mice ay nagsisilbing mga donor ng buto ng utak para sa paglipat sa mutant mice rag2 ~ / ~. Sa parehong mga serye, ang resulta ay positibo: 3-4 na linggo sa lahat ng mga daga ng normal mature myeloid at lymphoid mga cell ay natagpuan na may kakayahang paggawa ng immunoglobulins. Kaya, transplantation sa oocyte nuclei ng somatic cell ay maaaring gamitin hindi lamang upang makabuo ng hESC mga linya, ngunit din para sa tsitogenoterapii - Pagwawasto ng hereditary abnormalities gamit ESC bilang vector para sa transportasyon ng mga pagwawasto genetic na impormasyon. Ngunit sa direksyon ng paglipat ng cell, bukod sa mga problema sa bioethical, may mga limitasyon. Ito ay hindi malinaw kung paano ligtas na ang paglipat ay therapeutically-kopya cell na may genotype na nahahawig sa dyenotayp ng isang partikular na pasyente, dahil ang naturang mga cell ay maaaring ipakilala ang mga mutations na lumikha ng isang predisposition sa ilang mga karamdaman. Normal pantao itlog mananatiling hindi maa-access object, samantalang kahit na kapag transplanting somatic nuclei na maging enucleated oocyte hayop lamang 15-25% ininhinyero "zygote" bumuo sa blastocyst entablado. Hindi natukoy kung magkano ang blastocyst ay kinakailangan upang makakuha ng isang solong linya ng pluripotent cloned ESCs. Dapat itong nabanggit at mataas na antas ng mga gastos sa pananalapi na nauugnay sa pagiging kumplikado ng therapeutic cloning methodology.

Sa wakas, sa ESC pluripotency genome hypomethylated DNA ay pinagsama na may mataas na telomerase aktibidad at maikling C ^ cell cycle phase, na kung saan ay nagsisigurado intensive at potensyal na walang katapusan na pagpaparami, sa panahon kung saan ang PGCs panatilihin ang diploid chromosomes at "juvenile" hanay ng mga phenotypic katangian. Clonal paglago ng PGCs sa kultura ay hindi pumipigil sa kanila iba-iba sa anumang pinasadyang mga cell ng mga organismo sa isang stop line paglaganap at pagdaragdag ng naaangkop na mga signal. Paghihigpit pagkita ng kaibhan ng hESCs sa linya sa vitro somatic cell ay natanto na walang ang partisipasyon ng mesenchyme, bypassing Nohteyaov, ay organogenesis at walang pagbuo ng bilig. Ectopic sa Vivo pangangasiwa PGCs hindi maaaring hindi humahantong sa mga bituin teratocarcinoma. ESC transplantation sa isang blastocyst o batang embryo ay sinamahan ng kanilang mga integration sa ang tisiyu ng bilig at ang kanyang matatag na chimerization katawan.

Nagbabagong-buhay at plastic teknolohiya batay sa mga cell transplantation ay ang punto ng intersection ng mga interes ng mga miyembro ng cell biology, developmental biology, pang-eksperimento genetics, immunology, neurolohiya, kardyolohiya, hematology, at marami pang ibang mga patlang ng pang-eksperimentong at praktikal na gamot. Ang pinaka-mahalagang pang-eksperimentong mga resulta patunayan ang posibilidad ng reprogramming ang stem cell na may direksyon ng pagbabago ng kanilang mga ari-arian, na kung saan ay bubukas up prospects para sa pagkontrol cytodifferentiation proseso na may paglago kadahilanan - para sa myocardial pagbabagong-buhay, pagpapanumbalik ng CNS lesyon at normalisasyon ng function ng ang munting pulo patakaran ng pamahalaan ng pancreas. Gayunman, ang lakit pagpapakilala transplantation derivatives ESC sa medikal na kasanayan ay kinakailangan upang siyasatin ang mga katangian ng tao na mga cell stem sa mas maraming mga detalye at karagdagang mga eksperimento na may PGCs sa pang-eksperimentong mga modelo ng sakit.

Bioethical mga isyu at mga problema ng pagtanggi ng allogeneic cell transplant ay maaaring malutas ang naobserbahang plasticity ng genome ng mga rehiyonal na mga cell adult stem. Gayunman, ang mga paunang impormasyon ay na kapag transplanting ang atay nakahiwalay at lubusan nailalarawan sa autologous hematopoietic cell, kung saan may mga bagong hepatocytes, na nagsasama sa hepatic lobules, ay ngayon masuri at criticized. Gayunpaman, na-publish ng data na ang paglipat ng neural cell stem sa thymus ay ang pagbuo ng mga bagong sprouts ng donor T-at B-lymphocytes, at transplanting neural stem cells ng utak sa utak ng buto ay humahantong sa ang pagbuo ng hematopoietic mikrobyo matagal donor myeloid at erythropoiesis . Bilang resulta, sa adult organo ay maaaring hindi mapangalagaan pluripotent stem cells kaya ng genome reprogramming ng ESC upang kapasidad.

Ang embrayo ng tao ay nananatiling pinagmumulan ng pagtanggap ng ESC para sa mga medikal na layunin, na predetermines ang hindi maiiwasan ng isang bagong intersection ng mga problema sa moral, etikal, moral, legal at relihiyon sa punto ng kapanganakan ng buhay ng tao. Ang pagtuklas ng mga ESC ay nagbigay ng isang malakas na puwersa sa pagsisimula ng malupit na mga talakayan tungkol sa kung saan ang linya sa pagitan ng mga selulang buhay at bagay, sangkap at pagkatao ay namamalagi. Kasabay nito, walang mga unibersal na kaugalian, mga patakaran at batas tungkol sa paggamit ng ESC sa gamot, sa kabila ng paulit-ulit na mga pagtatangka na likhain at tanggapin ang mga ito. Ang bawat estado sa loob ng kanyang batas ay malulutas nito ang problemang ito sa sarili. Para sa kanilang bahagi, ang mga manggagamot sa buong mundo ay patuloy na subukan upang dalhin ang nagbabagong-buhay gamot, plastic kabila ng naturang mga pakikipagtalakayan, lalo na dahil sa ang paggamit ng mga non-embryonic cell stem at stem cell reserves matanda.

Ang ilan sa mga kasaysayan ng embryonic stem cell isolation

Terato- (embryo) cell ay ihiwalay mula -kartsinomnye spontaneously nagaganap testicular teratomas mouse strain 129 / ter-Sv, spontaneous ovarian linya teratomas mouse Lt / Sv, at mula teratomas, ektopichno pinagmulan ay transplanted cell o embryonic tissue. Kabilang sa gayon ay nakuha terato- matatag na mga linya ng mouse (embryo) -kartsinomnyh ilang mga cell ay pluripotent, ang iba ay sumailalim sa pagkita ng kaibhan lamang sa mga cell ng isang partikular na uri, at ang ilan ay sa pangkalahatan ay hindi kaya ng cytodifferentiation.

Noong panahong iyon, ang pokus ay pananaliksik na nagpakita ng isang posibleng balik terato- (embryo) -kartsinomnyh cell sa normal na phenotype pagkatapos ng kanilang pagpapakilala sa pagbuo ng bilig tissue, pati na rin trabaho upang lumikha ng sa vitro genetically modified terato- (embryo) -kartsinomnyh mga cell, sa tulong ng kung aling mga mutant mice ang nakuha para sa biological pagmomolde ng humanology patolohiya.

Ginamit ang nakakagiling na paglilinang ng suspensyon upang ihiwalay ang mga linya ng mga cell ng terato-embryo-carcinoma. Sa kultura terato- (embryo) -kartsinomnye mga cell, tulad ng ESCs, lumalaki upang bumuo embryoid katawan at nangangailangan upang maisalin sa isang linya ng nagbubuklod dissociation pagpapanatili pluripotency sa isang feeder layer ng embryonic fibroblasts o suspensyon culturing sa condition media. Terato- pluripotent cell (embryo) - carcinoma linya malaki, pabilog, may isang mataas na aktibidad ng alkalina phosphatase, Pinagsasama-sama form at ang kakayahan na multidirectional pagkita ng kaibhan. Kapag ipinakilala sa isang blastocyst ay pinagsama-sama sa morulae, na nagreresulta sa pagbuo ng chimeric embryo, sa iba't-ibang bahagi ng katawan at tisyu na derivatives ay matatagpuan terato- (embryo) -kartsinomnyh cells. Gayunpaman, ang karamihan sa mga tulad chimeric mga embryo ay mamamatay sa utero, at sa mga laman-loob makaligtas chimeras bagong panganak na mga banyagang cells at bihirang nakita na may isang mababang density. Kasabay nito ang mga saklaw ng mga bukol (fibrosarcoma, rhabdomyosarcoma, at iba pang mga uri ng mapagpahamak pamamaga at adenoma Pancreas) nang husto ay nagdaragdag, at neoplastic pagkabulok ay madalas na nangyayari kahit sa utero chimeric embryo.

Karamihan sa terato- (embryo) -kartsinomnyh cell sa micro-kapaligiran ng normal embryonic cell halos natural ay nagiging malignant neoplastic katangian. Ito ay pinaniniwalaan na ang irreversible malignancy ay dahil sa ang activation ng proto-oncogenes sa proseso ng estruktural rearrangements. Ang isang eksepsiyon ay ang mga cell na linya embriokartsinomnoy SST3, teratoma nagmula sa murine testis (linya 129 / Sv-ter), na nagpapakita ng isang mataas na kakayahan upang maisama sa tissue at organo ng sanggol nang walang kasunod na pagbuo ng mga bukol sa chimeric Mice. Hango terato- (embryo) -kartsinomnyh cell na linya sa mga daga Chimeras halos hindi lumahok sa pagbuo ng mga pangunahing gonocytes. Malinaw, ito ay konektado sa isang mataas na dalas ng chromosome aberrations pangkaraniwan sa karamihan terato- (embryo) -kartsinomnyh linya sa kung aling mga cell na-obserbahan bilang aneuploidy o chromosomal anomalya.

Ang ilang mga matatag na terato- linya (embryo) -kartsinomnyh pantao cell ay inihanda sa ilalim ng mga kondisyon laboratoryo, nailalarawan pluripotency, mataas proliferative aktibidad at kakayahan upang makilala ang pagkakaiba sa kultura sa panahon ng pag-unlad. Sa partikular, terato- linya (embryo) -kartsi- holonomic NTERA-2 tao na mga cell na ginagamit para sa pag-aaral ng mga mekanismo ng neural cytodifferentiation. Pagkatapos ng paglipat, mga cell ng linya sa subventricular rehiyon ng forebrain ng bagong panganak daga at ang kanilang migration na-obserbahan neyronogenez. Nagkaroon pa nga nagtatangkang itanim sa ibang lugar neuronal terato- nakuha sa pamamagitan ng culturing cells (embryo) -kartsinomnoy line NTERA-2, upang mga pasyente na may stroke, na kung saan, ayon sa mga may-akda, na humahantong sa mga klinikal na pagpapabuti ng sakit. Sa kasong ito kapaniraan terato- transplanted cell (embryo) -kartsinomnoy line NTERA-2 sa mga pasyente na may stroke ay nai-nabanggit.

Ang unang linya ng undifferentiated pluripotent embryonic cell stem ng mga daga sa unang bahagi ng 80-ies ng huling siglo got Evans at Martin, sa pamamagitan ng pagpili sa mga ito mula sa inner cell mass ng isang blastocyst - embryoblast. Ang nakahiwalay na mga linya ng ESC sa mahabang panahon ay napanatili ang pluripotency at ang kakayahang makilala ang iba't ibang uri ng mga cell sa ilalim ng impluwensiya ng mga kadahilanan ng isang espesyal na medium ng kultura.

Ang terminong "embryonic pluripotent stem cell" ay kabilang Leroy Stevens na ang imbestigasyon ng tabako alkitran epekto sa ang dalas ng tumor unlad Drew pansin sa ang pangyayari ng kusang testicular teratocarcinoma ng linear (129 / v) ng mga daga ng control group. Testicular teratocarcinoma cell ay nailalarawan sa pamamagitan ng isang mataas na rate paglaganap, at sa presensya ng liquid naiwan sa tiyan lukab sa pagbuo ng kusang pagkita ng kaibhan ng mga neurons, keratinocytes, chondrocytes, cardiomyocytes, pati na rin ang buhok at buto fragment, ngunit nang walang anumang indikasyon ng isang iniutos cytoarchitectonics naaangkop na tissue. Kapag planting sa teratocarcinoma cell kultura lumago unattached sa substrate pluripotent panggagaya at binuo embryoid katawan ay pagkatapos ay quenched at sumailalim sa kusang fission hindi maayos na makilala ang pagkakaiba sa neurons, glia, kalamnan cell at cardiomyocytes. Stevens natagpuan na teratocarcinoma mouse 129 / v naglalaman ng mas mababa sa 1% ng mga cell kaya ng differentiating sa isang iba't ibang mga specialized somatic linya, at mismong pagkita ng kaibhan ay depende sa mga salik na nakakaapekto sa kanila (komposisyon peritoneyal likido, ang mga produkto na idinagdag sa kultura ng mature na mga cell o tisiyu). Leroy Stevenson palagay tungkol sa presensya sa mga cell teratocarcinoma embryonic progenitor sexual mikrobyo cell ay nakumpirma: ang suspension embryoblast preimplantation embryo cell sa adult mouse tisiyu nabuo teratocarcinoma, at pinaghiwalay mula sa kanila dalisay na mga linya ng cell matapos intraperitoneal administrasyon sa recipient hayop ay differentiated sa neurons, cardiomyocytes at iba pang somatic kletki derivatives ng lahat ng tatlong mga mikrobyo layer. Sa mga eksperimento sa Vivo transplantation ESK (nakuha mula embryoblast ngunit hindi trophoblast) sa mouse embryo sa iba't ibang yugto ng mga linya 8-32 blastomere natapos kapanganakan ng chimeric hayop (walang tumor formation) sa bahagi ng katawan na kung saan nakikita sprouts donor tissue. Chimerism na-obserbahan kahit na sa linya ng cell sex.

Pangunahing progenitor mikrobyo cell ihiwalay mula sa mouse embryo mikrobyo sex, morpolohiya, immunological phenotype at functional na katangian pare-pareho sa hESCs nagmula sa teratocarcinoma Stevenson at embryoblast. Sa chimeras ipinanganak pagkatapos ng pamamahala ng hESCs sa isang blastocyst, allofenny organ morphogenesis nailalarawan mosaic alternating donor at recipient istruktura at functional yunit ng atay, baga at bato. Sa ilang mga kaso ang naobserbahang pagbuo ng bituka crypts o atay hiwa, na binubuo ng parehong donor at tatanggap na mga cell. Gayunman, ang pagpapatupad ng morphogenesis laging naganap sa genetic programa ng form, na ukol sa mga tatanggap, at chimerism ay limitado sa pamamagitan ng isang cellular antas.

Pagkatapos, ito ay natagpuan na ang paglaganap ng hESCs walang cytodifferentiation sa isang feeder layer-nagmula mesenchymal mga cell (pangsanggol fibroblasts) nangyayari sa presensya ng LIF nagbubuklod sa pumipili nutrient media na nang pili magbigay lamang kaligtasan ng buhay ng stem at ninuno cell, habang ang karamihan sa mga pinasadyang mga cellular elemento namatay. Sa tulong ng mga pamamaraan na ito noong 1998 sa pamamagitan ng James Thomson ay inilalaan limang immortalized linya ng embryonic cell stem mula sa inner cell mass ng isang blastocyst tao. Iyon parehong taon, John Gerhart ay bumuo ng isang pamamaraan ng isolating ang walang kamatayang ESC linya mula sa sekswal na umihip ng apat na limang-linggo human embryo. Dahil sa kanilang natatanging katangian, sa loob lamang ng dalawang taon, ang mga embryonic stem cell at mga stem cell ng mga tiyak na tisyu ay nagsimula na gamitin sa pagsasagawa ng regenerative medicine at gene therapy.