Embryonic stem cell

Ang pagtuklas ng mga embryonic stem cell ay hindi nagkataon, ngunit lumitaw sa inihandang lupa ng siyentipikong pananaliksik sa larangan ng developmental biology. Ang terminong "stem cell" ay ipinakilala sa medisina noong 1908 sa kongreso ng hematological society sa Berlin ni Alexander Maximov na may kaugnayan sa hematopoietic cells. Matagal bago ang paghihiwalay at paggawa ng mga matatag na linya ng pluripotent embryonic stem cell, ang mga stem terato-(embryo-carcinoma) na mga cell ay ginamit sa mga pag-aaral ng mga proseso ng maagang pag-unlad, sa tulong ng kung saan ang mga hindi kilalang mekanismo ng embryogenesis ay pinag-aralan, kabilang ang pagkakasunud-sunod ng pagpapahayag ng mga maagang gene at mga produkto ng protina ng kanilang aktibidad.

Ngunit ang totipotensiya ng genome ng tao ay hindi na mababawi sa proseso ng ebolusyon? Hindi, at ang embryogenesis ay patunay nito. Kung gayon, kailan, sa prinsipyo, ang ikalawang landas ng pag-unlad ng ebolusyon ay maisasakatuparan? Marahil, kapag ang tao ay pumasok sa kalawakan, kung saan ang mga kondisyon sa kapaligiran ay magiging medyo pare-pareho para sa isang sapat na mahabang panahon. Ang pagkawala ng tissue ng buto (demineralization ng mga buto sa isang estado ng kawalan ng timbang), na napakabagal na napapailalim sa remodeling at pagbabagong-buhay, ay maaaring ituring na unang hakbang sa proseso ng pagbagay ng tao, bilang isang species, sa pagkakaroon sa mga kondisyon ng kalawakan. Gayunpaman, ang presyo para sa pangalawang landas ng pag-unlad ng ebolusyon ay magkakaiba - ang presyo para sa pagbabalik ng totipotensi at ganap na plasticity sa lahat ng mga cell ay magiging sterility. Kaya, sa mundong ito ng "evolutionary chameleons", kailangan nating magparami nang walang meiosis, sa pamamagitan ng pag-usbong. Ngunit mabubuhay tayo ng mahabang panahon. Ang telomerase immortality ay ang imortalidad ng isang amoeba. Sa isang multicellular organism, ang mga stem cell ay ang substrate ng quantitative at qualitative longevity.

[ 1 ], [ 2 ], [ 3 ], [ 4 ]

Pinagmumulan ng mga embryonic stem cell

Sa ngayon, ang mga pinagmumulan ng mga embryonic stem cell para sa pagsasaliksik sa laboratoryo ay mga linya ng mouse teratocarcinoma (129/sv, F19, F8, Zin 40, CGR 86, Rl, CCE, JM-1, E14TG2a, CGRSb) at teratocarcinoma ng tao (NTERA-2, TERA-2, H-9 clone na mga linya), pati na rin ang mga linya ng Trauneon ESC. Gayunpaman, ang pagkakaroon ng isang detalyadong pasaporte ng cell na nagpapahiwatig ng immune phenotype, mga resulta ng pagsusuri ng chromosomal, mga profile ng expression ng mRNA, nakalantad na mga receptor at mga intracellular signaling protein ay hindi nagbabayad para sa mga makabuluhang pagkukulang ng mga linya ng teratocarcinoma ESC - mabilis na pagkawala ng totipotensi at ang imposibilidad ng paggamit ng mga ito sa mga klinikal na pagsubok, habang ang halo-halong pagkita ng kaibhan sa kultura ay ginagawang isang napakahirap na heterogeneous na pagkita ng kaibahan sa kultura. Samakatuwid, ang pinagmumulan ng mga linya ng ESC na nilikha para sa mga klinikal na layunin ay karaniwang ang inner cell mass ng blastocyst, mga indibidwal na blastomeres ng 8-cell stage embryo, morula cells ng mga susunod na yugto, pati na rin ang primordial germ cells.

Dapat pansinin na ang mga cell ng teratocarcinoma, bagaman mayroon silang pag-aari ng pluripotency, ay nailalarawan sa pamamagitan ng isang makabuluhang mas mababang potensyal na pluripotent kumpara sa mga ESC. Ang kanilang pagsasama sa mga embryonic cell ay bihirang humahantong sa pagbuo ng mga chimera, na, bukod dito, ay hindi kailanman bumubuo ng mga gametes na may genotype ng teratocarcinoma cells. Ito ay pinaniniwalaan na ito ay dahil sa madalas na paglitaw ng mga chromosomal abnormalities sa panahon ng paglilinang ng teratocarcinoma cells: pagkawala ng Y chromosome, iba't ibang trisomies, pagtanggal o pagsasalin.

Ang mga pagtatangka na ihiwalay ang isang linya ng ESC ng tao ay paulit-ulit na ginawa, ngunit ang gawaing ito ay hindi nalutas, dahil ang mga normal na blastocyst ng tao ay mahirap ma-access. Bilang karagdagan, ang dalas ng mga abnormalidad ng chromosomal sa mga tao ay mas mataas kaysa sa embryogenesis ng hayop. Ang napakaraming karamihan ng mga unang embryo ng tao na nakuha pagkatapos ng in vitro fertilization ay nagpapakita ng magulong chromosomal mosaicism at kadalasan ay may mga numerical at structural aberrations. Kahit na mamaya, sa yugto ng blastocyst, 20-25% lamang ng mga embryo ng tao ang binubuo ng mga cell na may normal na karyotype. Halos imposible na gumamit ng mga naturang embryo upang lumikha ng mga ESC, dahil ang mga zygote ay karaniwang nilinang sa dalawa o apat na blastomere na yugto at pagkatapos ay inilipat sa matris. Relatibong kamakailan lamang ay may isang maaasahang pamamaraan para sa paglilinang ng mga fertilized na itlog ng tao hanggang sa yugto ng blastocyst na binuo. Ang pagpapakilala ng diskarteng ito sa pagsasagawa ng in vitro fertilization ay hindi lamang nadagdagan ang dalas ng matagumpay na mga resulta ng pagtatanim, ngunit ginawa rin ang mga normal na blastocyst na isang mas madaling ma-access na bagay.

Ang isa pang pluripotent stem cell source ay ang primordial germ cells, na, hindi katulad ng mas advanced na mga populasyon ng progenitor ng germinal epithelium, ay walang beta-integrin sa kanilang ibabaw, ngunit nagpapahayag ng mataas na aktibidad ng alkaline phosphatase. Dapat pansinin na ang mga populasyon ng mga stem cell na nabuo mula sa primordial germ cells ay pinag-aralan nang eksperimento mula noong 1980s. Sa oras na iyon, binuo ang isang pamamaraan para sa paghihiwalay ng mga primordial germ cell mula sa rudiment ng gonad ng mouse embryo. Ang unang hindi matagumpay na mga resulta ng pag-culture ng primordial germ cells sa vitro ay nagmungkahi ng kawalang-saysay ng mga pagtatangka na ito, dahil ang mga cell, kahit na nakaligtas sila, ay hindi dumami at namatay sa loob ng unang araw. Nang maglaon ay itinatag na ang mga mouse primordial germ cells ay nagpaparami lamang sa vitro sa pagkakaroon ng natutunaw at nakagapos na lamad na tiyak na polypeptide growth factor sa medium ng kultura. Ang mga resulta ng maraming pag-aaral ay nagpakita na para sa kaligtasan ng buhay at paglaganap ng mga pangunahing selula ng mikrobyo, ang pagkakaroon ng hindi lamang LIF kundi pati na rin ang membrane-bound at soluble Steel factor (SIF) sa medium ng kultura ay kinakailangan. Ang mga peptide na ito ay ginawa ng mga somatic cells ng mga embryo homozygous para sa Steel mutation, at isa sa mga ito ay isang ligand ng cKit proto-oncogene.

Ang mga pangunahing selula ng mikrobyo ng mga mammal at tao ay may extragonadal na pinagmulan at ang pinagmulan ng clonal development ng germ cell line. Ang pinagmulan ng primordial germ cell line, pati na rin ang lahat ng embryonic tissues at ang extraembryonic mesoderm, ay ang epiblast (pangunahing ectoderm) ng mga unang embryo, na mayroong isang mosaic na istrukturang organisasyon. Gamit ang paraan ng microsurgical removal ng iba't ibang bahagi ng maagang embryo, isang localization zone sa epiblast ng clone ng mga nakatuon na precursors ng primordial germ cells ay itinatag. Gamit ang rhodamine dextran, na ginamit bilang isang cell marker, itinatag na ang mga precursor ng primordial germ cells ay naisalokal sa proximal na rehiyon ng epiblast, malapit sa extraembryonic ectoderm. Ang primordial germ cell line ay nagmumula sa isang 45-cell clone, ang alokasyon nito ay nangyayari sa pinakadulo simula ng gastrulation. Pagkatapos ay naghihiwalay ang clone, at sa panahon ng gastrulation ang mga pangunahing selula ng mikrobyo ay pumapasok sa extraembryonic mesoderm at matatagpuan sa base ng allantois rudiment, sa likod ng pangunahing streak. Mula doon ang mga pangunahing selula ng mikrobyo ay lumilipat patungo sa ventral na bahagi ng hindgut endoderm at pagkatapos ay aktibong gumagalaw sa kahabaan ng mesentery, na naninirahan sa mga genital ridge sa pagtatapos ng paglipat. Sa panahon ng paglipat, pati na rin sa unang 2-3 araw ng lokalisasyon sa gonad rudiment, ang mga pangunahing selula ng mikrobyo ay aktibong dumami at sumasailalim sa walong replicative cycle. Kung sa simula ng paglipat ay may humigit-kumulang 50 pangunahing mga selula ng mikrobyo, kung gayon sa mga genital ridge ng mga embryo ng mouse ng labindalawang araw ng pag-unlad ang bilang ng mga pangunahing selula ng mikrobyo ay lumampas sa 25,000.

Ang functional na pagkakapareho ng mga ESC at primordial germ cells ay napatunayan ng kumpletong pagsasama ng huli sa blastocyst na may kapalit ng internal cell mass at kasunod na ganap na pag-unlad ng embryo, ang mga tisyu na binubuo lamang ng mga inapo ng primordial germ cells. Sa iba pang mga pag-aari, ang mga primordial germ cell ng mouse ay naging magkapareho din sa mga ESC, na nagpapakita ng kakayahang mag-iba sa iba't ibang direksyon, upang bumuo ng mga embryoid na katawan sa vitro, at bumuo ng mga teratoma sa vivo kapag pinangangasiwaan nang subcutaneously sa immunodeficient na mga daga, na kahawig ng mga spontaneous testicular teratoma sa 129/ter na mga daga.

Napag-alaman na kapag ang LIF, membrane-bound at natutunaw na SIF ay idinagdag sa medium, ang mga nakahiwalay na pangunahing germ cell ng 8-araw na mga embryo ng mouse ay nabubuhay at nagpaparami sa kultura sa loob ng 4 na araw, ngunit pagkatapos ay namamatay. Bukod dito, ang panahon kung kailan ang pagkamatay ng mga pangunahing selula ng mikrobyo ay sinusunod sa kultura ay nag-tutugma sa yugto ng pag-unlad ng mga embryo ng mouse (12.5-13.5 araw) kapag ang mga babaeng pangunahing selula ng mikrobyo ay pumasok sa meiosis sa mga rudiment ng mga gonad, at ang mga mitotic na dibisyon ay naharang sa mga pangunahing selula ng mikrobyo ng lalaki. Gayunpaman, kung hindi lamang ang mga salik ng paglago na LIF at SIF, kundi pati na rin ang FGF2 ay idinagdag sa daluyan, ang mga pangunahing selula ng mikrobyo ay patuloy na dumarami, at ang mga kolonya ng mga selulang may kakayahang dumami kahit na matapos ang pag-alis ng mga salik ng paglago (SIF at FGF) mula sa daluyan ay nabuo sa mga subkultura. Ang ganitong mga cell ay maaaring kultura sa loob ng mahabang panahon sa isang substrate ng mga embryonic fibroblast nang hindi nagdaragdag ng natutunaw na kadahilanan ng paglago na LIF. Iminungkahi na tawagan ang mga matatag na linya ng cell na ito na nakuha mula sa mga primordial germ cells na embryonic germ cells. Ang terminong ito ay hindi matagumpay, dahil imposibleng makakuha ng mga embryonic germ cells na may kakayahang magsagawa ng mga kasunod na yugto ng oogenesis o spermatogenesis kapag nag-culture ng mga EG cells. Ito ay dahil sa ang katunayan na ang mga linya ng cell ng EG, kahit na nagmula sila sa mga primordial germ cells, ngunit, ang pagkuha ng mga katangian ng embryonic pluripotent stem cells sa kultura, ay nawalan ng kakayahang gumawa sa mga linya ng mikrobyo. Sa madaling salita, ang mga primordial germ cells, kapag nilinang, ay nawawala ang mga katangian ng gamete precursors at nagiging ESC-like pluripotent cells.

Napansin na ang mga teratoma ay hindi lumabas kapag ang mga selulang EG ay ipinakilala sa mga immunodeficient na daga. Ipinapalagay na ang pagkawala ng kakayahan ng mga selulang EG ng tao na magbunga ng mga teratoma ay dahil sa ang katunayan na ang mga linyang ito ay hindi direktang nilikha mula sa mga kulturang pangunahing selula ng mikrobyo, ngunit nakuha mula sa mga selulang nakahiwalay sa mga katawan ng embryoid. Samakatuwid, posible na sila ay mga inapo ng pluripotent, ngunit nakagawa na ng mga cell.

Dapat pansinin na may mga pangunahing pagkakaiba sa pagitan ng mga cell ng EG at mga primordial germ cells. Ang huli ay hindi pinapayagan ang pagkuha ng chimeric mouse embryo, na nagpapahiwatig ng kakulangan ng kakayahan ng primordial germ cells na sumanib sa inner cell mass o trophectoderm. Ang mga katangian ng primordial na populasyon ng cell ng mikrobyo ay mas katulad sa mga nakatuong linya ng mga somatic cell ng mga susunod na embryo, ang pagpapakilala nito sa blastocyst ay hindi rin humahantong sa pagbuo ng mga chimeric embryo.

Ang pagbabago ng pamamaraan ng pag-culture ng mga katawan ng embryoid na nakuha sa pamamagitan ng pagsasama-sama ng mga selula ng EG ay naging posible upang makakuha ng isa pang populasyon ng mga pluripotent na mga cell, na tinatawag na "mga cell na nagmula sa embryoid body" (mga cell ng EBD), gamit ang pagpili sa pumipili na media. Ang kakayahan ng mga selulang EBD na dumami sa kultura sa mahabang panahon ay naging posible upang lumikha ng mga matatag na linya ng cell ng mga nakatuong selula. Ang mga clone ng mga cell na nagpapahayag ng malawak na hanay ng mRNA at mga marker ng protina ng mga dalubhasang cell ay nakuha. Sa huli, pinatunayan ng diskarteng ito na ang mga pangunahing selula ng mikrobyo ng tao ay pluripotent at nagkakaiba sa vitro sa iba't ibang uri ng cell: mga neuron, neuroglia, vascular endothelium, hematopoietic cells, kalamnan at mga endodermal na selula.

Mga alternatibong mapagkukunan ng mga embryonic stem cell

Ang isang alternatibong mapagkukunan ng mga linya ng ESC ng tao ay maaaring mga hybrid na selula. Ang pagtatanim sa matris ng mga pseudo-buntis na baka ng isang heterogenous na konstruksyon na nakuha sa pamamagitan ng pagsasanib sa pamamagitan ng electroporation ng mga somatic cells ng fetus ng tao na may itlog ng baka kung saan ang pronucleus ay dating inalis ay ginagawang posible upang makakuha ng isang panloob na masa ng cell mula sa isang artipisyal na embryo ng mga yugto ng pag-unlad ng pre-implantation. Para sa layuning ito, sa unang yugto ang isang blastocyst ay nakuha mula sa isang itlog ng baka na may isang transplanted human cell nucleus.

Sa ikalawang yugto, ang isang embryoblast ay nakahiwalay mula sa blastocyst, at mula dito, ang mga ESC ay nakahiwalay gamit ang pamamaraang Thomson. Kapansin-pansin na ang pinakamahusay na mga resulta sa paghihiwalay ng mga linya ng ESC gamit ang pamamaraang ito ay nakuha gamit ang nuclei ng mga follicular cell o pangunahing mga cell ng mikrobyo na nananatili sa katawan ng tao sa isang estado ng hibernation. Ito ay dahil sa ang katunayan na ang nuclei ng mga selula ng tao na inilipat sa isang itlog ng baka ay dapat na may mga hindi pinaikling telomere at mataas na aktibidad ng telomease, na tumutulong na maiwasan ang napaaga na pagtanda ng mga ESC clone na nakuha mula sa isang hybrid na itlog (Repin, 2001). Ito ay kilala na ang pinakamahalagang intracellular marker proteins ng ESCs ay Oct3, Oct4, Tcf, Groucho, na kabilang sa tinatawag na chromatin silencer proteins. Nagbibigay ang mga silencer ng partikular na compact na pakete ng heterochromatin, na pumipigil sa pagbuo ng mga euchromatin loops. Ang packaging ng Chromatin na pinagsama ng mga protina na ito ay nauugnay sa totipotensi ng ESC genome. Ito ay itinatag hanggang sa kasalukuyan na ang mga mature na bovine at human oocytes ay ang tanging uri ng mga espesyal na selula na naglalaman ng mataas na konsentrasyon ng mga protina ng silencer sa cytoplasm. Sa batayan na ito, ang isang pamamaraan ay binuo para sa pagkuha ng mga hybrid na ESC sa pamamagitan ng paglilipat ng somatic cell nuclei sa mga enucleated na bovine oocytes. Ang mga paunang pag-aaral sa vitro ay nagpakita na ang cytoplasm ng bovine oocytes ay nagpapanumbalik ng totipotensi ng human somatic cell nuclei genome pagkatapos ng 12-24 na oras ng paglilinang.

Ang partikular na interes ay ang data sa mga kakaibang pag-unlad ng preimplantation ng mga embryo ng tao, na nagpapahiwatig ng isang mamaya na kapalit ng mga totipotent cells ng isang populasyon ng pluripotent cells kaysa sa mga daga. Ang isang pag-aaral ng mga pagbabagong-anyo ng cellular ay nagpakita na ang mga cell ng trophoblast ay lumabas din mula sa mga cell ng inner cell mass ng mga blastocyst ng tao, bilang karagdagan sa mga ESC, na nagpapahiwatig ng kanilang kabuuang potency.

Ito ay kilala na sa yugto ng blastocyst, dalawang magkakaibang nakatuon na populasyon ng cell ang lumitaw. Ang isa sa mga ito ay bumubuo sa panlabas na layer ng blastocyst - ang trophectoderm, ang mga derivatives nito ay ang mga trophoblast cells at iba pang mga embryonic na bahagi ng inunan. Ang pangalawang populasyon ng mga cell ay pinagsama sa isang siksik na masa na nakikipag-ugnay sa panloob na ibabaw ng trophectoderm. Ang mga derivatives ng populasyon ng mga cell ng inner cell mass ay ang lahat ng mga tisyu at mga simulain ng mga organo ng embryo. Sa yugto ng late blastocyst, ang extraembryonic endoderm ay nabuo mula sa inner cell mass at ang epiblast (pangunahing ectoderm) ay nabuo. Sa kasong ito, ang mga cell ng epiblast ay nagpapanatili ng pluripotency, habang ang kakayahang mag-iba ng mga cell ng extraembryonic endoderm ay limitado.

[ 5 ], [ 6 ], [ 7 ], [ 8 ], [ 9 ], [ 10 ], [ 11 ]

Pagkuha ng mga human embryonic stem cell

Hanggang kamakailan lamang, pinaniniwalaan na imposibleng makakuha ng mga ESC mula sa trophoblast. Gayunpaman, ang isang linya ng diploid trophectoderm stem cells na nakahiwalay mula sa isang blastocyst ay dumarami at nagiging stem cell sa isang medium na naglalaman ng FGF2 at heparin sa halip na LIF. Kung ang FGF2 ay tinanggal mula sa daluyan, ang mga trophectoderm cells ay hihinto sa pagdami, ang chromosome endoreduplication ay magsisimula sa kanila, at ang trophectoderm cellular elements ay unti-unting nagbabago sa mga higanteng trophoblast cells. Malamang, hindi pinasisigla ng LIF ang paglaganap ng trophectoderm cell dahil sa ang katunayan na ang FGF2 ay nag-trigger ng ibang mekanismo ng trans-signaling, dahil ang FGF2, na nagbubuklod sa plasma receptor (FGFR2), ay nag-activate ng MAP kinases sa cytoplasm - ERK1 at ERK2. Dahil dito, kapag ang isang signaling pathway (LIF - gpl30 - JAK kinase - STAT3) ay na-on sa mga blastocyst cells, ang mga cell ng inner cell mass ay na-transform sa pluripotent ESCs, at kapag ang pangalawang mekanismo ng transmembrane signal transduction (FGF2 - FGFR2 - MAP kinase ERK1/ERK2) ay na-activate ang stem cell na ERK1/ERK2, ang stem cell. blastocyst. Ang pagpili ng signaling pathway, sa turn, ay depende sa aktibidad ng oct4 gene. Ang gene na ito, na kabilang sa domain ng POU, ay matatagpuan sa t locus ng autosome 17 at ipinahayag sa panahon ng oogenesis, sa panahon ng cleavage, pati na rin sa mga cell ng inner cell mass ng blastocyst at sa pangunahing mga cell ng mikrobyo. Ang functional na papel ng oct4 gene ay upang i-encode ang isang transcription factor na kinakailangan para sa paglitaw ng pluripotent cells, ang kanilang pagkita ng kaibhan at dedifferentiation.

Ang pagpapahayag ng oct4 gene sa mga ESC ay nag-iiba depende sa pakikipag-ugnayan ng kadahilanan ng transkripsyon na ito sa mga cofactor. Ang nakadirekta na regulasyon ng oct4 expression sa blastocysts ay nagpakita na kapag ang aktibidad nito ay nabawasan, kalahati ng mga cell ay bumubuo ng trophectoderm, samantalang kapag ang sapilitan na pagpapahayag ng oct4 ay tumaas, nakararami ang mga ESC na bumangon.

Sa eksperimento, ang mga ESC ay hindi maaaring ilipat sa isang linya sa panahon ng paglilinang ng mga totipotent blastomeres sa yugto ng cleavage, pati na rin sa yugto ng gastrulation at mga susunod na yugto ng pag-unlad ng embryonic. Ang mga mouse ESC ay karaniwang nakahiwalay sa ika-3.5-4.5 na araw ng pagbubuntis, na tumutugma sa ikaanim (single-layer blastocyst) at ikapitong yugto (two-layer blastocyst - maagang egg cylinder) ng normal na embryogenesis. Malinaw, sa panahon ng preimplantation lamang ang mga embryo ng mouse ay naglalaman ng mga populasyon ng cell na may kakayahang mag-transform sa mga ESC. Dahil dito, ang paghihiwalay ng mga linya ng ESC ay posible lamang sa ilang mga yugto ng embryogenesis. Ang zygote at blastomeres na nagmumula sa panahon ng cleavage ay totipotent, mula sa punto ng view ng posibilidad ng pagbuo ng isang mabubuhay na embryo na may mga embryonic membrane at inunan. Ang pagkawala ng kabuuang potency ng mga cell ng mikrobyo ay nagsisimula sa huling yugto ng morula, kapag ang karagdagang pangako ng mga blastomeres ay nakasalalay sa kanilang lokasyon. Ang mga maagang morula blastomeres ay nagpapanatili ng totipotensi, dahil ang mga eksperimentong manipulasyon na may mga pagbabago sa kanilang lokalisasyon, tulad ng pagbabaligtad ng kanilang lokasyon, ay hindi pumipigil sa pagbuo ng isang ganap na embryo.

Ito ay itinatag na ang kahusayan ng paghiwalay ng mga ESC sa isang linya ay apektado ng kondisyon ng mga blastocyst sa oras ng kanilang pagpapaliwanag. Ang paggamit ng mga blastocyst pagkatapos ng pagmomodelo ng pitong araw na diapause sa reproductive tract ng mga daga na na-ovariectomize sa ika-3.5 araw ng pagbubuntis at binigyan ng progesterone ay nagpapadali sa mas matagumpay na paghihiwalay ng mga embryonic stem cell lines. Ipinapalagay na sa ilalim ng gayong mga kondisyon ang bilang ng mga blastomeres na bumubuo sa inner cell mass ay tumataas. Posible rin na ang cell cycle ay pinahaba at karamihan sa mga blastomeres ay pumapasok sa G0 phase.

Bilang karagdagan, ang paglikha ng mga matatag na pluripotent na linya ng ESC ay nakasalalay sa genotype ng mga embryo: Ang mga ESC ay medyo madaling ihiwalay mula sa mga blastocyst ng 129 na linya ng mouse, mas mahirap makuha ang mga ito gamit ang CS7BL/6 na mga daga, at halos imposibleng ihiwalay ang isang linya ng ESC mula sa mga blastocyst ng CBA/Ca mice. Malinaw, ang mga maagang embryo ay may ilang mga genetic na tampok na nakakaapekto sa pagbuo ng isang pluripotent na linya ng ESC. Gayunpaman, kapag ang pag-kultura ng mga nakahiwalay na epiblast, pati na rin sa pamamagitan ng pumipili na pagpili ng mga pagkakaiba-iba ng mga cell, ang mga linya ng ESC ay gayunpaman ay nakahiwalay sa mga unang embryo ng CBA / Ca mice.

Ang isang napatunayang pamantayang pamamaraan para sa pagkuha ng mga linya ng ESC mula sa mga blastocyst ay ibinibigay sa mga manwal ng laboratoryo sa pamamaraan ng mga eksperimento na may maagang mga embryo. Ang mga pang-eksperimentong linya ng ESC ay maaari ding makuha sa pamamagitan ng pag-kultura ng nakahiwalay na epiblast (pangunahing ectoderm) ng 4.5-araw na mga embryo ng mouse gamit ang medyo kumplikadong microsurgical technique at binagong mga kondisyon ng pag-culture. Ang lakas ng paggawa ng pamamaraang ito ay makatwiran, dahil ang dalas ng pagbuo ng linya ng ESC sa kasong ito ay naging mas mataas kaysa sa mga gawa na may panloob na masa ng cell ng blastocyst.

Upang ihiwalay ang mga linya ng ESC, ang bawat clone ay inililipat sa isang microwell, isang pinagsama-samang 40-60 na mga cell ay lumaki, at pagkatapos ay i-disperse muli. Ang maraming pag-uulit ng pamamaraang ito ay nagbibigay-daan sa amin upang makakuha ng isang walang kamatayang linya ng ESC na may pinakamataas na rate ng paglaganap ng mga normokaryotypic na mga cell na nakakabit sa plastic, na nagpapanatili ng totiponcy at mataas na aktibidad ng telomerase pagkatapos ng 50-100 na mga sipi. Sa proseso ng pagpapanatili ng mga linya ng ESC, ang pinakamalaking panganib ay ang kontaminasyon ng medium o serum na may mga bacterial endotoxin - kahit na ang mga bakas na konsentrasyon ng endotoxin sa medium ng kultura ay nagdudulot ng malawakang pagkamatay ng mga immature germ cell. Sa maingat na pagsubaybay sa linear na paglaki at napapanahong pagpapakalat, ang mga ESC sa kultura ay may kakayahang simetriko na paghahati, kung saan ang parehong mga cell ng anak na babae ay nananatiling pluripotent at may kakayahang magsagawa ng walang limitasyong bilang ng mga cell cycle, na nagpapanatili ng isang diploid karyotype at kabuuang potency.

Ang pagpili ng isang purong populasyon ng mga ESC ng tao ay maaaring isagawa pagkatapos ng paglipat ng kanilang genome na may mga recombinant na molekula ng DNA na naglalaman ng gene na naka-encode ng synthesis ng green fluorescent protein (GFP). Ang expression ng GFP ay tumataas kapag ang mga ESC ay lumaki sa ilalim ng mga kondisyon na sumusuporta sa kanilang paglaganap, samantalang sa pagsisimula ng pagkita ng kaibahan ang antas ng expression ng gene na ito ay bumababa, na nagpapahintulot sa pagpili ng purong matatag na pluripotent na mga linya ng cell sa isang pumipili na daluyan. Kapag ang pag-culture ng mga ESC ay nakahiwalay gamit ang pagpili ng GFP, ang dalas ng pagbuo ng kolonya ay tumataas nang maraming beses, dahil ang malakas na antiproliferative na epekto ng mga magkakaibang mga cell ay tinanggal sa ilalim ng mga kondisyon ng mga kultura ng pagpili.

Ang pagsasalin ng mga human embryonic stem cell sa isang linya ay isinasagawa gamit ang paraan ng kanilang paghihiwalay mula sa preimplantation embryo (sa yugto ng 80-120 na mga cell), na nananatili pagkatapos ng in vitro fertilization procedure. Para sa layuning ito, ang mga artipisyal na nakuha na "labis" na mga embryo ay mekanikal na nakakalat sa daluyan ng Delbecco-Eagle. Pagkatapos ng label sa mga cell na may mga pumipili na monoclonal antibodies na may isang fluorescent na label, ang mga embryoblast na mga cell ay nakahiwalay. Ang embryoblast ay nakakalat sa mga indibidwal na selula gamit ang isang dispase-collagenase mixture. Ang mga dissociated cell ay lumaki sa isang espesyal na medium (80% Delbecco's medium + 20% fetal calf serum sa pagkakaroon ng 500 μg/ml IL-6, LIF at SCF) sa isang feeder monolayer ng mga embryonic fibroblast ng unang 3 sipi. Sa kasong ito, ang kaligtasan at paglaganap ng mga stem at progenitor cells ay pinananatili dahil sa epekto ng IL-6, LIF at SCF. Sa ganoong medium, lumalaki ang mga ESC bilang mga clone ng suspension ng mga hindi nakakabit na balled na mga cell, na dapat ihiwalay sa pamamagitan ng malambot, paulit-ulit na pipetting. Lumilitaw ang mga bagong clone sa suspendidong kultura sa ika-5-7 araw. Ang pinakamataas na rate ng paglago ng mga ESC ay nakakamit sa pamamagitan ng paulit-ulit na dissociation ng mga clone sa yugto ng 10-15 na mga cell. Pagkatapos, ang bawat clone ay inililipat sa isang microwell at lumaki sa isang pinagsama-samang 40-50 na mga cell. Ang pamamaraan ay paulit-ulit nang maraming beses sa mga sipi, pinatataas ang dami ng kultura sa isang density ng 5-10 milyong mga cell bawat 6-cm na ulam. Gamit ang gayong pagpasa, nagbukod si Thomson ng 10 imortal na clone ng mga ESC ng tao, na pagkatapos ng 100 mga sipi ay nagpapanatili ng mataas na aktibidad ng telomerase, ang kakayahang lumaganap nang masigla, minimal na mga katangian ng phenotypic, at kabuuang potency na may kakayahang mag-iba sa alinman sa 350 espesyal na mga linya ng cell na nagmula sa ecto-, mesoderm-, at endoderm. Ang pagkita ng kaibhan ng mga ESC ng tao ay nagsimula (sa katamtamang pagbabago, pagdaragdag ng suwero, at pag-aalis ng LIF) na may cell attachment sa substrate, na nagpapahiwatig ng pag-unlad ng cytoskeleton at pagpapahayag ng mga adhesion receptor. Mahalaga, na may walang limitasyong paglaganap, ang mga ESC ng tao ay nagpapanatili ng isang normal na karyotype.

Ang pangalawang paraan ng paghihiwalay ng mga linya ng ESC ng tao ay batay sa paggamit ng mga pangunahing selula ng mikrobyo. Ipinakita ng mga eksperimental na pag-aaral na ang mga linya ng E cell ay maaaring makuha mula sa mga genital fold ng 12.5-araw na mga embryo ng mouse. Gayunpaman, sa mga kasong ito ang dalas ng pagbuo ng mga linya ng progenitor cell ay makabuluhang mas mababa kaysa sa mga eksperimento sa mga naunang embryo. Kasabay nito, ang mga pangunahing selula ng mikrobyo mula sa mga gonad ng mga embryo ng mouse na 13.5 araw ng edad ng gestational ay hindi kayang mag-transform sa mga linya.

Ang mga unang matatag na linya ng pluripotent human EG cells ay nakuha mula sa mga pangunahing gonocytes na nakahiwalay sa mga gonad ng 5-9 na linggong gulang na mga embryo. Ang mga nakahiwalay na mga cell ay nilinang sa isang substrate ng hindi aktibo na mouse embryonic fibroblast sa DMEM medium na may fetal serum na pupunan ng mercaptoethanol, forskolin, at recombinant human growth factor (FGF at LIF). Pagkatapos ng 7-12 araw, lumitaw ang mga multicellular na kolonya sa kultura, na tumutugma sa mga cell ng EG ng tao sa pamamagitan ng mga tampok na morphological at mga marker ng molekular. Pagkatapos ng pagsasama-sama, ang mga cell na ito ay nabuo ang mga embryoid na katawan, na may karagdagang pag-unlad kung saan ang mga espesyal na selula na katangian ng mga derivatives ng lahat ng tatlong mga layer ng mikrobyo ay lumitaw. Sa paglipas ng 10-20 sipi, ang mga linya ng cell ng EG ay nagpapanatili ng isang normal na karyotype at hindi nawalan ng pluripotency.

Ipinakita rin na ang pinagsamang pagkilos ng LIF, membrane-bound at soluble Steel factor, at TGF-b ay nagbabago sa developmental program ng primordial germ cells. Sa halip na itigil ang mitotic division at magsimulang mag-iba patungo sa oogenesis o spermatogenesis, ang mga primordial germ cells ay patuloy na dumarami. Pagkatapos ng ilang karagdagang mitotic cycle, nagiging katulad sila ng mga epiblast cells at, nawawala ang mga katangian ng germ cell precursors, ay nababago sa pluripotent embryonic stem EG cells.

Kaya, noong 1998, ang mga immortalized na linya ng primordial germ cells ay nahiwalay sa unang pagkakataon mula sa genital rudiment ng fetal autopsy tissue ng tao. Sa embryogenesis ng tao, ang mga primordial germ cell ay lumilitaw sa yolk sac sa ika-3 linggo ng pag-unlad, at sa ika-4-5 na linggo, ang mga cell na ito ay lumilipat sa genital tubercle zone, kung saan sila ay bumubuo ng mga dormant na populasyon ng mga pangunahing gonocytes. Sa isang hindi aktibong estado, ang mga primordial germ cell ay napanatili sa embryo hanggang sa ipanganak. Ang mga linya ng primordial germ cells ay nakahiwalay mula sa fetal genital tubercle ng 5-9 na linggong mga embryo, ang nakuhang tissue na kung saan ay ex tempore na ginagamot sa pinaghalong mga uri ng collagenases IV-V, hyaluronidase at DNase upang mapataas ang quantitative at qualitative yield ng mga cell. Ang mga primordial germ cells sa tissue ng fetal genital tubercle ay napapalibutan ng stromal (mesenchymal) Sertoli cells. Ang functional na layunin ng Sertoli cells ay upang makabuo ng mga antiapoptotic factor (Fas ligand), mitogens, at immunosuppressants na nagpoprotekta sa mga germ cell mula sa immune attack ng katawan. Bilang karagdagan, ang stromal microenvironment ng genital tubercle ay may mahalagang papel sa pagkahinog ng mga gametes. Ang mga nakahiwalay na pangunahing selula ng mikrobyo ay nakatanim sa kultura sa ibabaw ng isang feeder stromal layer na binubuo ng mga fetal fibroblast ng unang tatlong sipi. Ang pinaka-epektibong kumbinasyon ng mitogens ay isang kumplikadong binubuo ng LIF, FGF, at forskolin (isang stimulator ng pagbuo ng cAMP). Ang paglaganap ng mga pangunahing selula ng mikrobyo sa vitro ay nangangailangan ng pagdaragdag ng serum ng pangsanggol, sa pagkakaroon ng kung saan ang pagpaparami ng mga pangunahing gonocytes sa kultura ay sinamahan ng pagbuo ng mga clone ng mga spherical cell na hindi naka-attach sa substrate.

Sa National Institutes of Health, USA, batay sa isang buod ng umiiral na data sa mga pamamaraan para sa paghihiwalay ng mga linya ng ESC ng tao mula sa mga blastocyst, ginawa ang isang paunang konklusyon na ang matagumpay na paghihiwalay ng mga ESC ay malamang na kapag nag-culture ng mga blastocyst na may mahusay na nabuong inner cell mass (Stem cells: siyentipikong pag-unlad at mga direksyon sa pananaliksik sa hinaharap ng Health USA). Mula sa puntong ito ng pananaw, ang pinakamainam na mapagkukunan ng mga ESC para sa paglikha ng mga linya ay mga blastocyst ng tao sa ika-5 araw ng pag-unlad, kung saan ang trophectoderm ay dapat na maingat na alisin kapag ihiwalay ang inner cell mass. Ang nakahiwalay na inner cell mass, na binubuo ng 30-35 na mga cell sa yugtong ito, ay dapat na kultura sa isang substrate ng embryonic mouse fibroblasts, na isang mapagpasyang kondisyon para sa pagbuo ng mga kolonya ng ESC sa kultura.

Pagsusuri ng mga phenotypic na katangian ng mga embryonic stem cell

Ang partikular na interes ay ang interspecies comparative analysis ng mga phenotypic na tampok ng mga ESC. Napag-alaman na ang mga kolonya ng ESC ng tao ay mga siksik na kumpol ng mga flattened, epithelial-like cells, samantalang ang mouse embryoid body ay binubuo ng maluwag na conglomerate ng mga bilugan na cell. Sa mga ESC ng tao, ang index ng nuclear-plasma ratio ay mas mababa kaysa sa mga mouse ESC. Ang mga embryonic stem cell ng mga unggoy ay bumubuo ng mga patag na kolonya ng mga selula na may hindi pantay na mga gilid. Ang mga indibidwal na cell ay madaling nakikita sa mga unang clone ng primate ESCs. Ang paglaganap ng mga ESC ng lahat ng pinag-aralan na species ng hayop ay hindi nagpapahayag ng MHC class I at II na mga molekula. Kasabay nito, ang mga human ESC ay nagbibigay ng positibong reaksyon sa TERA 1-60 at GCTM-2 antibodies, na nagpapahiwatig ng pagkakaroon ng keratin/chondroitin sulfate proteoglycans sa kanilang ibabaw, katangian ng embryo-(terato)-carcinoma stem cell. Ang pagpapahayag ng oct4 gene sa mga ESC ng lahat ng mga species ng hayop ay nagmumungkahi na, sa kabila ng mga pagkakaiba-iba ng phenotypic, ang parehong hanay ng mga gene na responsable para sa pagpapanatili ng pluripotency ay tila naisaaktibo sa mga ESC ng tao at mouse (Peru, 2001). Bilang karagdagan, ang mga linya ng ESC na nakahiwalay sa mga embryo ng daga, baboy, kuneho, primate at baka ay may magkatulad na mga katangian ng morphological, isang katulad na hanay ng mga molecular identification marker at halos magkaparehong mekanismo ng molekular para sa pagpapatupad ng mga programa ng embryogenesis, na nagpapahintulot sa amin na kumuha ng bagong pagtingin sa problema ng xenotransplantation.

Hindi tulad ng normal na embryogenesis sa vivo, ang paglaganap ng mga ESC sa vitro ay hindi sinamahan ng pagbuo ng mga layer ng mikrobyo at nangyayari laban sa background ng pagharang ng homeotic Hoxgenes, ibig sabihin, nang walang organogenesis. Dahil ang mga gene ng segmentation ay hindi gumagana, imposibleng magparami ng mga panahon ng embryogenesis tulad ng pagtula ng mga somite, pag-segment ng embryo, pagbuo ng yolk sac, allantois at iba pang mga pansamantalang organo at tisyu sa kultura ng ESC. Ang mga kulturang ESC ay tila nagyelo sa simula ng proseso ng pagbuo ng 350 mga linya ng paghihigpit ng mga dalubhasang selula. Kaya, ang isang clone ng mga cell ng progenitor ng anak na babae at isang sentral na naisalokal na ESC ay kumakatawan lamang sa isang modelo ng isang embryo, sa panahon ng pag-unlad kung saan ang iba't ibang mga linya ng mga dalubhasang mga cell ay sabay-sabay na nabuo sa iba't ibang mga rehiyon ng tissue, na, gayunpaman, ay nagmula sa mga karaniwang precursor. Sa kabila ng kaunting antas ng mga receptor sa ibabaw ng mga ESC, pinananatili nila ang kakayahang magsagawa ng mga primitive na proseso ng morphogenetic, na ginagaya ang mga volumetric na istruktura ng isang maagang embryo: isang suspensyon ng mga ESC sa mga pinagsama-samang kultura at bumubuo ng mga istruktura na kahawig ng mga blastocyst o kahit na mga susunod na embryo (mga egg cylinder). Ang nasabing mga pinagsama-samang suspensyon ay tinatawag na simple at kumplikadong mga katawan ng embryoid.

Sa mixed differentiation, ang mga maagang gene ng ectoderm (oct3, fgf-5, nodal), endoderm (gata-4), mesoderm (brachyury), cardiogenic mesoderm (pkh-2.5), neural tube (msx3) at hematopoiesis (elkf) ay sabay-sabay na ipinahayag sa iba't ibang mga cell ng isang embryoid. Gamit ang iba't ibang mga kumbinasyon ng mga kadahilanan ng paglago at mga cytokine para sa naka-target na aksyon sa pagbuo ng mga selula ng layer ng mikrobyo sa vitro, posible sa ilang mga kaso upang makakuha ng mga embryoid na katawan kung saan ang mga ectoderm o mesoderm na mga gene ay mas gusto na ipinahayag, na nagbubukas ng paraan sa pagmomodelo ng gastrulation at ang mga paunang yugto ng organogenesis.

Ang paglaki ng clonal ng mga ESC ay katibayan ng asymmetric cell division, kung saan isang ESC lamang sa gitna ng clone ang nagpapanatili ng walang limitasyong potensyal ng paglaganap, habang ang pangalawang anak na cell ay bumubuo ng isang henerasyon ng mga progenitor cells na sumasailalim na sa pagkita ng kaibahan. Samakatuwid, ang clone proliferation rate sa periphery ng embryoid body ay mas mataas kaysa sa gitna. Ang mga marginal na selula ng lumalagong clone ay sumasailalim sa kusang-loob na disordered differentiation, migrate, o namamatay sa pamamagitan ng apoptotic na mekanismo. Tinutukoy ng mga kaganapang ito ang kapalaran ng clone: kung ang proliferation rate ay lumampas sa rate ng migration at apoptotic cell death, ang clone ay patuloy na tumataas sa laki, ang stabilization ay nangyayari kapag ang apoptosis rate at ang rate ng bagong cell formation ay pantay, at ang regression ay nangyayari kapag ang ratio ng mga prosesong ito ay inverse. Ang mga progenitor cell ay nahahati nang simetriko, ibig sabihin, ang parehong mga cell ng anak na babae ay kasunod na nag-iiba sa mga mature na dalubhasang mga linya ng cell. Ang ratio ng mga ESC sa mga progenitor cell ay nag-iiba-iba, ngunit ang bilang ng mga ESC ay palaging isang bahagi lamang ng isang porsyento ng populasyon ng progenitor cell. Samakatuwid, tanging ang maingat na pipetting at napapanahong disaggregation ng mga clone ang maaaring mapataas ang bilang ng mga ESC sa kultura. Ang disaggregation ng mga clone sa yugto ng 10-12 na mga cell ay naging pinaka-epektibo para sa pagkuha ng maximum na ani ng mga ESC. Ang direksyon at antas ng pagkita ng kaibahan ng mga selula sa katawan ng embryoid ay nakasalalay sa kanilang lokasyon. Ang mga panlabas na selula ng katawan ng embryoid ay hindi nagpapahayag ng oct4 gene at sumasailalim sa pagkita ng kaibahan sa mga selula ng pangunahing endoderm, kung saan ang mga epithelial-like cells ng parietal at visceral extraembryonic endoderm ay kasunod na nabuo. Ang mga panloob na selula ng katawan ng embryoid ay nagpapahayag ng oct4 gene at nagpapanatili ng pluripotency sa loob ng 48 oras ng paglilinang. Gayunpaman, ang kultura ay pagkatapos ay morphologically restructured sa isang epithelial monolayer at pagpapahayag ng mga gene na kumokontrol sa pagbuo ng pangunahing ectoderm ay nagsisimula. Susunod, ang proseso ng kabuuang disordered cytodifferentiation ay nagsisimula sa paglitaw ng iba't ibang uri ng cell na mga derivatives ng lahat ng tatlong layer ng mikrobyo. Sa proseso ng kusang pagkita ng kaibhan ng mga selula ng katawan ng embryoid, ang mga pinagsama-samang may mga marker ng endoderm sa anyo ng mga fragment (cysts) ng yolk sac ay ang unang lumitaw. Pagkatapos, lumilitaw ang mga angioblast at endothelial cells ng lumalaking capillary sa mga istrukturang ito. Sa mga huling yugto ng spontaneous differentiation, ang iba't ibang mga terminally differentiated cells ay bubuo mula sa mga panloob na selula ng embryoid body, kabilang ang mga neuron, glial elements, cardiomyocytes, macrophage, at erythrocytes. Sa isang tiyak na lawak (isinasaalang-alang ang spatial inversion ng pagbuo ng mga layer ng germinal tissue), gamit ang mga embryoid na katawan, posible na pag-aralan ang mga morphogenetic na proseso sa vitro at pag-aralan ang mga mekanismo ng molekular ng mga unang panahon ng embryonic cytodifferentiation,pati na rin upang maitaguyod ang papel ng mga partikular na gene sa pagpapatupad ng mga prosesong ito.

Kaya, sa loob ng clone mayroong mga cell kung saan natuklasan ang iba't ibang mga programa sa pagpapaunlad ng genetic - mga ESC, maagang mga ninuno at pagkakaiba-iba ng mga populasyon ng ninuno. Ang paglilinang ng mga ESC sa pamamagitan ng hanging drop o mass culture na pamamaraan na walang feeder layer at walang pagdaragdag ng LIF sa medium ay hindi maiiwasang humahantong sa pagbuo ng mga embryoid na katawan. Ang morpolohiya ng mga selula ng panlabas at panloob na mga layer ng mga katawan ng embryoid ay naiiba. Ang panlabas na layer ay binubuo ng malalaking, branched cell. Ang kanilang ibabaw na nakaharap sa kapaligiran ay natatakpan ng maraming microvilli. Ang panlabas na layer ng mga cell ay pinaghihiwalay mula sa panloob na layer ng isang basal membrane na kahawig ng Reichert's membrane, habang ang mga cell ng panloob na layer ng mga embryoid na katawan ay columnar epithelium. Morphologically, ang panloob na layer, bagama't naglalaman ito ng maraming naghahati na mga cell, mas malapit na kahawig ng mga hindi nakikilalang kolonya ng mga ESC.

Mga katangian ng mga embryonic stem cell ng tao

Ang kawalan ng mga pakikipag-ugnayan ng parenchymatous-mesenchymal signaling laban sa background ng homeosis gene blocking ay humahantong sa hindi maayos na paglaki ng mga ESC sa kultura, dahil ito ay nakakagambala sa pagbuo at pag-unlad ng imprastraktura ng mga pansamantalang organo. Ang hindi maayos na paglaki at hindi maayos na kusang pagkita ng kaibhan ng mga ESC sa kultura ay dahil sa kawalan ng mesenchymal marking ng stromal framework ng mga hinaharap na organ: sa vitro, posible na bumuo ng milyun-milyong hepatocytes, ngunit imposibleng makakuha ng isang lobule ng atay na kinabibilangan ng mga istruktura at functional na elemento tulad ng sinuses, Disse spaces, at Kupffer cells.

Ito ay pinaniniwalaan na ang pluripotency ng ESCs ay natanto ng eksklusibo sa embryogenesis na may pagbuo ng mga tisyu at organo ng embryo, habang ang inunan at umbilical cord ay mga derivatives ng trophoblast. Ang mga ESC na nakapaloob sa trophectodermal membrane ay sunud-sunod na bumubuo ng mga clone ng mga pansamantalang cell na nagpapatupad ng programa sa pag-unlad sa pamamagitan ng combinatorial mRNA ng volumetric topographic matrix ng Nokhteyov, na paunang tinutukoy ang spatial na pag-aayos, hugis at sukat, ang bilang ng mga cell ng pansamantala at tiyak na mga organo, pati na rin ang pagpupulong ng structural at functional unit. Kasabay nito, ang mga ESC ay nananatiling nag-iisang uri ng mga cell kung saan ang mekanismo ng molekular para sa pagpapatupad ng kanilang mga potensyal ay ganap na hindi nakakonekta mula sa programa ng pag-unlad ng genetic, at ang mga ESC mismo ay pinagkaitan ng kakayahang makipag-ugnay sa iba pang mga cell dahil sa pagharang ng parehong mga receptor perception at transsignaling system. Gayunpaman, ang sapat na pag-activate ng mga ESC ay humahantong sa isang hakbang-hakbang na pag-unlad ng programa ng embryogenesis, na nagtatapos sa pagsilang ng isang ganap na nabuong organismo, na binubuo ng bilyun-bilyong mga selula, na handa para sa extrauterine na buhay. Sa panandaliang ngunit hindi maisip na pangmatagalang landas na ito sa cellular space, ang mga pagkakamali ay hindi maiiwasang lumitaw kapwa sa mga mekanismo ng molekular na nagsisiguro sa mahahalagang aktibidad ng mga selula at sa mga programang kumokontrol sa kanilang paglaganap, pagkakaiba-iba at pagdadalubhasa. Samakatuwid, sa modernong pharmacogenomics, ang mga sakit ng molekular na istraktura at mga sakit ng cell programming ay isinasaalang-alang nang hiwalay. Bukod dito, ang pagkilos ng karamihan sa mga bagong gamot ay naglalayong iwasto ang mga programa ng pagkita ng kaibhan, paglaganap at organogenesis, pati na rin ang pagbabagong-buhay ng mga organo at tisyu. Sa isang pang-adultong organismo, ginagawang posible ng mga ESC na kontrolin ang pag-uugali ng mga stem/progenitor cell na inilipat sa utak, atay, spleen, bone marrow, at iba pang mga organo ng tao upang maibalik ang nasirang parenchyma ng mga organo ng tatanggap sa pamamagitan ng pag-iiba at pagpapakadalubhasa sa mga donor cell sa napanatili na mesenchymal matrix. Sa esensya, ang programang totipotensiya ay nagsisimulang maisakatuparan sa antas ng oocyte, zygote, at blastomere genome; gayunpaman, ang mga cell na ito ay hindi pa na-clone at naipasa sa dami na kinakailangan para sa mga pangangailangan ng eksperimental at praktikal na gamot. Samakatuwid, ang mga ESC ay nananatiling isang natatanging mapagkukunan ng genetic na impormasyon na naglalaman ng mga code para sa isang three-dimensional na mapa ng embryo at mga code para sa linear na paghihigpit ng mga dalubhasang linya ng cell sa panahon ng gastrulation.

Ang halos walang limitasyong potensyal na pagbabagong-buhay ng mga ESC ay dahil sa ang katunayan na ang kanilang genome, hindi katulad ng genetic apparatus ng magkakaibang mga somatic cells, ay nagpapanatili ng pluripotency. Ang isa sa mga pagpapakita ng natutulog na estado ng genetic na impormasyon na naka-embed sa mga ESC ay ang tinatawag na minimal na phenotype - isang limitadong bilang ng mga receptor ang ipinahayag sa ibabaw ng mga ESC, at, nang naaayon, napakakaunting mga trans-signaling program ang na-deploy para sa pakikipag-ugnayan ng nuclear apparatus ng cell sa microenvironment nito. Laban sa background ng hibernation ng mga gene na responsable para sa paghihigpit ng mga dalubhasang linya ng cell at pagkita ng kaibhan ng cell, halos 30 lamang sa 500 na mga gene ang naisaaktibo, ang mga produkto kung saan tinitiyak ang koneksyon ng cell sa nakapalibot na microenvironment. Gamit ang paraan ng serial analysis ng gene expression, ipinakita na sa karaniwang gawain ng mga pangunahing functional na kahon ng genome na kumokontrol sa energetics at metabolismo sa somatic cells at ESCs, ang huli ay may napakababang antas ng mRNA ng mga receptor, G protein, pangalawang messenger, transcriptases, expression at repression cofactors, ibig sabihin, ang buong sistema ng signal ng transmembrane ng cell. Ito ay dahil sa kawalan o napakababang pagpapahayag ng mga transsignaling gen. Sa panahon ng sapilitan na pagkita ng kaibhan sa ESC genome, 18 gumaganang mga gene ang sabay-sabay na huminto sa pagtatrabaho laban sa background ng pag-activate ng 61 transsignaling gene na kumokontrol sa synthesis ng mga cell adhesion receptor, mga bahagi ng extracellular matrix, restriction transcriptases at mga elemento ng messenger ng signal transmission system sa mga nuclear apparatus mula sa receptor ng plasma membrane. Kasabay nito, ang pagpapahayag ng mga gene na responsable para sa synthesis ng mga protina ng silencer ay naharang, pati na rin ang mga co-inhibitor ng expression ng gene na tinitiyak ang totipotensi ng ESC genome.

Ang mga marker ng gene ay natagpuan para sa mga cell ng lahat ng tatlong layer ng mikrobyo. Ang pagkilala sa layer ng ectodermal cell ay isinasagawa sa pamamagitan ng pagpapahayag ng nodal, oct3 at fgf-5 genes, mesoderm cells - sa pamamagitan ng brachyury, zeta-globin genes, endoderm - sa pamamagitan ng pagpapahayag ng gata-4 gene. Sa normal na embryogenesis sa panahon ng gastrulation, ang aktibong paglipat ng mga immature na populasyon ng mga stem at progenitor cells ay sinusunod, na lokal na minarkahan ang mga zone ng pag-unlad ng facial bones ng bungo, ilang bahagi ng utak, peripheral nervous system, cardiac conduction system at thymus, ang mga tisyu na nabuo mula sa mga clone ng migrant cells. Ang pagmamarka ng mga cell sa pamamagitan ng maagang mga gene ng mga layer ng mikrobyo ay nagpapadali sa gawain ng topographic analysis ng mga proseso ng paglipat ng mga precursor cell sa pagbuo ng embryo. Ito ay itinatag, sa partikular, na sa mga pinagsama-samang P19 embryocarcinoma cells, ang pagpapahayag ng unang mesoderm gene brachyury ay nagsisimula sa panahon ng pagbaba ng pagpapahayag ng mga gene ng tissue plasminogen activator, a-fetoprotein, keratin 8 at keratin 19, na mga marker ng unang paglipat ng populasyon ng mesoderm. Dahil dito, ang pagbuo ng mga tisyu ng mesodermal na pinagmulan ay nagsisimula lamang pagkatapos makumpleto ang proseso ng paglipat ng punto at pagpapakalat ng mga mesodermal progenitor cells.

Sa kabila ng sobrang limitadong mga tampok na phenotypic at ang kawalan ng karamihan sa mga trans-signaling unit, ang mga ESC ay nagpapahayag pa rin ng ilang mga molekula ng receptor na maaaring magamit para sa kanilang pagkakakilanlan. Kapansin-pansin na ang ESC marker antigens sa mga tao at primates ay naging karaniwan. Kadalasan, ang mga may label na antibodies sa membrane-bound antigens SSEA-3, SSEA-4 (natatanging lipid antigens na kumakatawan sa isang complex ng glycolipid GL7 na may sialic acid), pati na rin ang high-polymer glycoproteins TRA-1-81, TRA-1-60 ay ginagamit para sa ESC labeling. Bilang karagdagan, ang mga ESC ay nagpapahayag ng tiyak na embryonic antigen SSEA-1 at endogenous alkaline phosphatase, pati na rin ang tiyak na transcription factor Oct4. Ang huli ay kinakailangan para sa pagpapanatili ng mga mekanismo ng paglaganap ng ESC - ang tiyak na salik ng transkripsyon na Oct4 ay nagpapagana sa pagpapahayag ng fibroblast growth factor 4 na gene at nagpapatatag sa pagpapahayag ng kahon ng mga gene na responsable para sa walang limitasyong pagtitiklop ng DNA sa mga immature na selula. Ang pinakamahalagang intracellular marker protein ay ang Oct3, Oct4, Tcf at Groucho, na nauugnay sa chromatin silencer proteins.

Halos kaagad pagkatapos ng maraming taon ng mga pagtatangka upang linangin ang mga ESC sa labas ng katawan ay matagumpay at ang mga unang kultura ng mga stem cell na nakahiwalay sa mga blastocyst ng mouse at mga kultura ng mga pangunahing selula ng mikrobyo ay nakuha, isang yugto ng pananaliksik sa pluripotent potensyal ng mga ESC ay nagsimula noong sila ay ipinakilala sa mga embryo sa mga unang yugto ng pag-unlad. Ipinakita na sa mga yugto ng morula at blastocyst, ang mga ESC ay may kakayahang bumuo ng mga chimeric embryo kung saan ang mga inapo ng mga donor ESC ay napansin sa lahat ng mga somatic na tisyu at maging sa mga gametes. Kaya, sa biology ng pag-unlad, gamit ang mga ESC, isang "tulay" ang itinatag sa pagitan ng mga eksperimentong pag-aaral sa vivo at in vitro, na makabuluhang pinalawak ang mga posibilidad para sa pag-aaral ng mga proseso ng paglalagay ng mga pangunahing tisyu at organo, ang kanilang pagkita ng kaibhan at embryonic organogenesis.

Malinaw na itinatag na sa vivo sa panahon ng embryogenesis ESCs ay isinama sa cell mass ng maagang embryo, at ang kanilang mga derivatives ay matatagpuan sa lahat ng mga organo at tisyu. Kino-kolonya ng mga ESC ang isang linya ng mga selula ng mikrobyo sa chimeric embryo, ang mga inapo nito ay bumubuo ng mga ganap na itlog at tamud. Ang mga embryonic stem cell ay clonogenic - ang isang solong ESC ay may kakayahang lumikha ng isang genetically identical na kolonya ng mga cell na may mga molecular marker, na kinabibilangan ng pagpapahayag ng oct4 gene at alkaline phosphatase, mataas na aktibidad ng telomerase, at pagpapahayag ng ilang partikular na embryonic antigens.

Upang pag-aralan ang mga mekanismo ng embryogenesis gamit ang mga ESC, isang paraan ng morula chimerization ay binuo sa pamamagitan ng paglikha ng isang biological na konstruksyon, sa labas kung saan mayroong isang layer ng tatanggap na tetraploid blastomeres, at ang mga donor ESC ay ipinakilala sa loob. Kaya, ang trophoblast ay nabuo mula sa mga inapo ng tetraploid blastomeres ng tatanggap, na nagsisiguro ng pagtatanim at paglalagay, at ang mga donor ESC ay kumikilos bilang isang panloob na masa ng cell kung saan nabuo ang katawan ng isang mabubuhay na embryo at isang linya ng pangunahing progenitor germ cells. Ang halaga ng pananaliksik ng mga ESC ay namamalagi hindi lamang sa katotohanan na ang pluripotency ay napanatili sa panahon ng in vitro manipulations kasama ang kanilang genome, kundi pati na rin sa katotohanan na ang kakayahan ng mga ESC na lumahok sa pagbuo ng mga pangunahing selula ng mikrobyo ng isang chimeric embryo ay napanatili. Ipinakita na ang mga inapo ng isang genetically modified ESC ay naninirahan sa lahat ng mga pangunahing simulain at pagbuo ng mga tisyu ng isang chimeric embryo na nakuha sa pamamagitan ng pagsasama-sama o pag-cocultivation ng cell na ito na may 8-cell na embryo. Kapag ang mga ESC na inilipat kasama ang berdeng fluorescent protein gene ay inilipat sa morula ng mga daga, ang mga fluorescent na inapo ng cell na ito ay natagpuan sa lahat ng pinag-aralan na mga tisyu ng pagbuo ng embryo (Shimada, 1999). Ang paglipat ng mga ESC sa morula ay nagpapahintulot sa paglikha ng mga mabubuhay na daga na ang organismo ay binubuo lamang ng mga inapo ng donor ESC, na nagbubukas ng mga prospect para sa iba't ibang mga opsyon para sa therapeutic cloning. Ang pamamaraang ito ay matagumpay na ginagamit ngayon upang pag-aralan ang mga problema ng biology ng pag-unlad, lalo na, ginagamit ito upang pag-aralan ang mga mekanismo ng genetic inactivation ng X chromosome o epigenetic instability ng ESCs. Ang paglipat ng mga ESC sa isang maagang embryo ay ginagamit din sa agricultural biotechnology, pati na rin sa mga eksperimento sa gene therapy.

Ang paglipat ng genetically modified ESCs ay ginagamit upang subukan ang mga target na cell ng mutant genes. Ang mga in vitro cultured na ESC ay ginagamit sa biotechnology upang lumikha ng mga knockout na daga. Para sa layuning ito, ang gene na pag-aaralan ay inalis mula sa mga ESC sa pamamagitan ng homologous recombination (knockout) at ang mga cell na kulang sa gene na ito ay nakahiwalay sa selective media. Ang mga Knockout ESC ay ipinapasok sa blastocyst o pinagsama-sama sa morula blastomeres. Ang mga chimeric early embryo na nakuha sa ganitong paraan ay inililipat sa mga babaeng tatanggap, at ang mga indibidwal na may gametes nullizygous para sa isang gene ay pinili mula sa mga bagong panganak na daga. Ang teknolohiyang ito ay ginamit upang lumikha ng maraming linya ng knockout na mga daga, na malawakang ginagamit sa pang-eksperimentong biology at pang-eksperimentong gamot. Ang ganitong mga biological na modelo ay ginagamit upang pag-aralan ang kahalagahan ng ilang mga gene sa pag-unlad ng embryonic, pati na rin ang kanilang papel sa mga mekanismo ng mga sakit ng tao at mga kondisyon ng pathological. Bilang karagdagan, ang mga knockout na linya ng hayop ay ginagamit sa preclinical testing ng mga bagong pamamaraan ng gene therapy. Halimbawa, sa pamamagitan ng paglipat ng normal na allele ng isang mutant gene sa ESC genome, posible na epektibong itama ang isang mutation na nakakaapekto sa hematopoietic system. Ang pagpapakilala ng mga dayuhang gene sa mga ESC ay nagbibigay-daan para sa mabilis na paglikha ng mga linya ng homozygous transgenic na mga hayop sa laboratoryo. Gayunpaman, dapat tandaan na ang pamamaraan ng naka-target na pagtanggal ng recombination gene ay hanggang ngayon ay mapagkakatiwalaan lamang na binuo na may kaugnayan sa mga ESC ng mouse. Gamit ang double knockout mouse ESCs, ang functional na papel ng gene cluster region sa chromosome 7 (isang kopya ng genomic region sa human chromosome 19) at ang proximal na rehiyon ng chromosome 11 (isang kopya ng human chromosome 5g) ay naitatag - ang pagtanggal ng mga gene na ito sa mouse ESC ay naging posible upang suriin ang pag-andar ng kanilang mga analog sa mga tao.

Ang mga posibilidad ng pag-aaral ng pag-andar ng mga gene ng embryogenesis ng tao ay lumawak, ang paglipat kung saan sa genome ng ESCs ng mga hayop sa laboratoryo ay naging posible, lalo na, upang linawin ang papel ng crypto gene sa pagbuo at pag-unlad ng cardiogenic mesoderm, ang pax-6 gene - sa embryogenesis ng mata. Ang mga unang mapa ng pagpapahayag ng gene sa hindi pa nabubuong paglaganap ng mga ESC ng teratocarcinoma at mga blastocyst ng mga daga ay pinagsama-sama, at nakumpirma ang suppressive repression ng transsignaling genes sa ESCs. Ang kumbinasyon ng 60-80 mutant ESC at 20-30 na mga cell ng normal na preimplantation mouse embryo ay humahantong sa pagbuo ng mga chimeric embryo kung saan ang organ primordia ay binubuo ng mga donor at recipient na mga cell, na ginagawang posible na linawin ang papel ng hindi kilalang mga gene sa gastrulation at organogenesis. Ang functional na mapa ng mga gene ng pagbuo ng mga embryo ng mouse ay dinagdagan ng impormasyon tungkol sa papel ng sf-1 gene sa pagbuo ng adrenal gland at gonads, ang wt-1 gene sa pagbuo ng kidney, mga gene ng myoD family sa pagbuo ng skeletal muscle, at mga gene ng gata-1-4 family sa restriction rumentation ng erythropiesis at erythropiesis.

Itinuro ang pag-off ng mga maternal at paternal alleles ng mga gene sa ESC gamit ang vector recombinases na pinapayagan upang linawin ang mga pag-andar ng iba't ibang mga gene sa unang bahagi ng panahon ng embryogenesis, at ang teknolohiya ng direktang paglipat ng hindi kilalang mga gene ng tao sa mouse ESCs ay nag-aambag sa pagtuklas ng mga bagong mutant genes na responsable para sa pagbuo ng malubhang namamana na patolohiya. Gamit ang paraan ng knockout, ang obligadong kahalagahan ng ilang mga gene para sa pagbuo ng mga embryonic tissue ay natukoy: gata-4 - para sa myocardium, gata-1 - para sa erythroid lineage ng hematopoietic tissue, myoD - para sa skeletal muscles, brachyury - para sa mesoderm, restriction transcriptases hn4f3 - para sa mga selula ng ragways - ragf2 - stem ng atay. pagbuo ng T- at B-lymphocyte clones (Repin, 2001). Ang dobleng pagtanggal ng mga gene sa ESCs ay nagbukas ng access sa pag-aaral ng functional na papel ng germ layer genes, segmentation at homeosis, at ginawang posible ng ESC transplantation na makakuha ng viable interspecies hybrid embryo. Gamit ang isang pinahusay na pamamaraan para sa paglipat ng isang solong donor ESC sa isang 8-cell na embryo, ang katunayan ng chimerization sa cellular level ng maraming mga organo ng recipient embryo ay napatunayan. Dapat pansinin na ang mga cell sprouts ng tissue ng tao ay natagpuan sa mga organo ng mga mice ng tatanggap pagkatapos ng pagpapakilala ng mga hematopoietic stem cell ng tao sa blastocyst. Naitatag na ang mga pluripotent ESC ay umiikot sa dugo ng mga embryo ng mouse sa panahon ng pagbuo ng organ. Posible na ang kanilang biological function ay nakasalalay sa embryonic na organisasyon ng hinaharap na immune system. Sa tulong ng mga ESC, ang sapat na mga modelo ng genetic pathology ng tao ay muling ginawa sa mga kondisyon ng laboratoryo: double knockout ng mga modelo ng dystrophin gene na Duchenne muscular dystrophy sa mga daga, at ang pagsara ng atm gene (kontrol ng chromatin signal kinase synthesis) - ataxia-telangectasia. Sa nakamamatay na namamana na sakit na ito sa mga bata, ang pagkabulok ng mga selula ng Purkinje sa cerebellum ay bubuo dahil sa mga depekto sa reparasyon ng DNA, na sinamahan ng involution ng thymus dahil sa pagkamatay ng mga proliferating na selula. Ang klinikal na larawan, pathophysiology at pathomorphology ng ataxia-telangectasia, na ginawa sa pamamagitan ng pagpapakilala ng pathological genetic na impormasyon sa mga ESC, sa chimera mice ay tumutugma sa mga tao. Bilang karagdagan sa ataxia-telangectasia, gamit ang mga ESC at knockout na mga daga, ang mga eksperimentong modelo ng ilang namamana na homozygous na mga sakit ng tao na nauugnay sa patolohiya ng karbohidrat at lipid metabolismo, amino acid catabolism, at tanso at bilirubin excretion ay binuo, na makabuluhang pinalawak ang mga kakayahan ng eksperimentong gamot sa yugto ng preclinical na pagsusuri ng mga bagong pamamaraan ng paggamot ng tao.

[ 12 ], [ 13 ], [ 14 ], [ 15 ]

Paggamit ng stem cell cytohybrids

Ang mga hybrid na cell na nakuha sa pamamagitan ng pagsasama ng mga ESC na may mga somatic na selula ay isang sapat at promising na modelo para sa pag-aaral ng pluripotency ng mga stem cell at muling pagprograma ng mga chromosome ng magkakaibang mga cell. Ang mga cytohybrids na nakuha sa pamamagitan ng pagsasama-sama ng mga ESC na may magkakaibang mga selula ng isang pang-adultong hayop ay ginagawang posible na pag-aralan ang mga relasyon sa pagitan ng mga genome ng iba't ibang "edad": isang kakaibang sitwasyon ang lumitaw kapag ang mga homologous chromosome na nagmula sa mga cell sa iba't ibang yugto ng pagkita ng kaibhan at iba't ibang antas ng kapanahunan ay matatagpuan sa parehong nucleus, kung saan madali silang magpalitan ng trans-acting regulatory signal. Mahirap hulaan kung paano ang mga cisregulatory epigenetic system ng mga homologous chromosome, na nabuo sa panahon ng indibidwal na pag-unlad, ay tutugon sa impluwensya ng mga trans-acting na signal na nagmumula sa mga embryonic related genome. Bilang karagdagan, ang paghihiwalay ng mga chromosome ng magulang ay nangyayari sa mga hybrid na selula, na nagpapahintulot sa amin na pag-aralan ang pakikipag-ugnayan ng mga genome sa antas ng mga indibidwal na chromosome, iyon ay, upang potensyal na makilala ang pakikilahok ng mga tiyak na chromosome sa pagpapanatili ng pluripotency o, sa kabaligtaran, ang paglabas sa pagkita ng kaibhan.

Ang mga cytohybrids na nakuha sa pamamagitan ng pagsasama ng pluripotent teratocarcinoma at iba't ibang mga somatic cells ay ginamit bilang unang eksperimentong modelo para sa pag-aaral ng pakikipag-ugnayan ng mga genome na may iba't ibang "mga kasaysayan ng pag-unlad". Sa ilang mga kaso, ang mga hybrid na selula ay nagpapanatili ng mga katangian ng pluripotent sa isang medyo mataas na antas. Sa partikular, sa vivo teratocarcinoma-somatic hybrid cells ay nag-udyok sa pagbuo ng mga tunay na teratoma na naglalaman ng mga derivatives ng lahat ng tatlong layer ng mikrobyo, at sa vitro sa mga kultura ng suspensyon ay nabuo nila ang mga embryoid na katawan. Kahit na sa mga interspecific na cytohybrids ng ganitong uri, ang pagkakaroon ng mga embryonic antigens ay nabanggit sa mga kaso kung saan ang mga somatic partner sa pagsasanib sa mga teratocarcinoma cells ay mga lymphocytes o thymocytes. Kapansin-pansin na ang mga cytohybrids na nilikha sa pamamagitan ng pagsasama ng teratocarcinoma cells na may mga fibroblast ay tumutugma sa mga fibroblast sa phenotype.

Ang pinakamahalagang itinatag na katotohanan ay na sa teratocarcinoma-somatic hybrid cells, ang mga palatandaan ng reprogramming ng differentiated cell genome ay lumitaw, na nailalarawan sa pamamagitan ng muling pag-activate ng alinman sa mga indibidwal na gene o ang hindi aktibong X chromosome ng somatic partner. Kaya, ang mga resulta ng mga pag-aaral sa cytohybrids ng teratocarcinoma-somatic cell type ay nagpapahiwatig na ang pluripotency ay madalas na napanatili sa mga hybrid na cell at may mga palatandaan ng reprogramming ng somatic partner genome.

Sa mga eksperimento sa pagkuha ng intraspecific embryonic hybrid cells sa pamamagitan ng pagsasama ng mga ESC ng mouse na may mga adult splenocytes, pinag-aralan ang mga katangian ng naturang cytohybrids, nasuri ang paghihiwalay ng mga chromosome ng magulang, at nasuri ang pluripotency ng hybrid genome. Ang mga intraspecific na hybrid na selula na nakuha sa pamamagitan ng pagsasama ng mga selulang teratocarcinoma na may mga somatic na selula ay karaniwang nailalarawan sa pamamagitan ng mababang antas ng paghihiwalay ng chromosome na may isang tetraploid o malapit-tetraploid na karyotype. Ang isang katulad na komposisyon ng chromosomal ay naobserbahan sa mga cytohybrids sa panahon ng pagsasanib ng mga pangunahing selula ng mikrobyo na may mga lymphocytes. Kasabay nito, ang mga interspecific na hybrid na cell na nakuha sa pamamagitan ng pagsasama ng mouse teratocarcinoma cells na may mink lymphocytes ay nagpakita ng matinding paghihiwalay ng mga chromosome ng somatic partner.

Ang isang qualitatively bagong yugto sa pag-aaral ng segregation ng parental chromosome sa intraspecific hybrids ay nagsimula pagkatapos ng pagbuo ng isang paraan para sa pagsusuri ng microsatellites gamit ang polymerase chain reaction, salamat sa kung saan ilang daang marker ang natagpuan para sa bawat mouse chromosome, na nagpapahintulot sa maaasahang diskriminasyon ng anumang pares ng homologous chromosome sa hybrid na mga cell.

Sa pamamagitan ng pagsasanib ng mga ESC (HM-1 na mga cell na kulang sa aktibidad ng hypoxanthine phosphoribosyltransferase, 2n = 40, XY, na nakahiwalay sa mga blastocyst na 129/01a mice) na may splenocytes ng congenic DD/c mice, posible na makakuha ng isang hanay ng mga hybrid na clone na morphologically katulad ng ESCs. Ang lahat ng mga clone ay nakahiwalay sa isang pumipili na daluyan kung saan ang mga cell lamang na may aktibong hypoxanthine phosphoribosyltransferase ang maaaring lumago. Ang pagsusuri sa electrophoretic ay nagpakita na ang lahat ng mga clone ay mayroong allelic variant ng hypoxanthine phosphoribosyltransferase na katangian ng DD/c mice. Ipinakita ng pagsusuri ng cytogenetic na tatlo sa apat na hybrid na clone ay may malapit na diploid na hanay ng mga chromosome. Ang isang malapit-tetraploid clone ay naglalaman ng dalawang populasyon ng mga hybrid na selula, ang isa ay tetraploid at ang pangalawa, na mas maliit, ay diploid.

Ang pagsusuri ng microsatellite, na nagpapahintulot sa diskriminasyon ng anumang pares ng mga homologous chromosome ng mga daga 129/01a at DD/c, sa mga hybrid na clone na may malapit na diploid set ay nagpakita na sa dalawang clone ay mayroong malinaw na kagustuhan na pag-aalis ng mga autosome ng somatic partner. Karamihan sa mga autosome sa mga clone na HESS2 at HESS3 ay may mga marker ng linyang 129/01a, ibig sabihin, ang pluripotent partner. Ang pagbubukod ay mga chromosome 1 at I: sa mga clone na HESS2 at HESS3, kasama ang mga marker ng HM-1 cells, ang mga marker ng somatic partner ay naroroon sa maliliit na dami. Ang mga naturang resulta ay maaaring magpakita ng hindi kumpletong paghihiwalay ng mga chromosome 1 at I ng somatic partner at naaayon sa cytogenetic data na ang trisomy para sa mga chromosome na ito ay sinusunod sa 30-40% ng mga cell ng mga clone na HESS2 at HESS3. Malaki ang pagkakaiba ng Clone HESS4 sa komposisyon ng chromosomal nito: maraming autosome sa clone na ito ang nagmula sa ESC genome (chromosomes 2, 3, 4, 5, 6, 7, 10, 13, 14, at 17), ngunit ang mga chromosome 1, 9, 11, 11, 15, 8 ay kinakatawan ng homolog. ng parehong magulang. Ang quantitative ratio ng microsatellites na nagmamarka sa mga homologous chromosome na ito ay humigit-kumulang 1:1. Pinahintulutan nito ang mga may-akda na ipalagay na ang isang homolog ay nagmula sa genome ng ESC, at ang isa pa mula sa magkakaibang mga cell. Sa ilang mga subclone ng clone HESS4, tanging mga marker ng chromosome 18 at 19 ng somatic partner ang naroroon. Ang nakuha na mga resulta ay nagpapahiwatig na sa mga cell ng HESS4 clone, bilang karagdagan sa paghihiwalay ng mga chromosome ng somatic partner, ang pag-aalis ng isa o parehong mga homologue ng mga nakalista sa itaas na chromosome ng pluripotent genome ay naganap, iyon ay, nagkaroon ng bilateral segregation ng mga chromosome ng parehong mga magulang - isang napaka hindi pangkaraniwang katangian ng mga magulang - isang hindi pangkaraniwang katangian ng segregation ng mga magulang, dahil ang segregation ay isang hindi pangkaraniwang katangian ng mga magulang cytohybrids.

Bilang karagdagan, pagkatapos ng 20th passage, ang lahat ng mga clone ng hybrid na mga cell ay naglalaman lamang ng mga marker ng X chromosome ng somatic partner, ibig sabihin, ang ESC X chromosome ay pinalitan ng X chromosome ng somatic partner sa mga clone. Ang mahalagang katotohanang ito ay kinumpirma ng in situ hybridization data gamit ang FITC-labeled probe na tukoy para sa mouse X chromosome: isang positibong signal ang nakita lamang sa isang chromosome. Dapat pansinin na sa mga naunang yugto ng paglilinang (bago ang ika-15 na daanan), ayon sa data ng cytogenetic, maraming mga cell ang naglalaman ng dalawang X chromosome. Samakatuwid, ang paggamit ng pumipili na media ay nagbibigay-daan sa pagmamanipula ng chromosomal na komposisyon ng mga hybrid na selula at piling pagpili ng mga clone na nagdadala ng mga solong chromosome ng somatic partner laban sa background ng ESC genome.

Dahil ang isang natatanging tampok ng cytohybrid genome ay ang lokalisasyon ng mga genome ng magulang sa isang nucleus, natural na lumitaw ang tanong tungkol sa pangangalaga ng mga pluripotent na katangian ng embryonic genome sa ESC-somatic cell hybrids sa ilalim ng mga kondisyon ng malapit na pakikipag-ugnay nito sa genome ng isang differentiated cell. Morphologically, ang cytohybrids ng ESCs at somatic cells ay katulad ng parental ESC line. Ang pagsusuri ng pluripotency ay nagpakita na ang lahat ng mga clone na may malapit-diploid na hanay ng mga chromosome ay may kakayahang bumuo ng mga embryoid na katawan sa mga kultura ng suspensyon, kung saan naroroon ang mga derivatives ng tatlong layer ng mikrobyo.

Karamihan sa mga hybrid na cell ay naglalaman ng ECMA-7 antigen, isang marker na katangian ng mga maagang embryo ng mouse, at mayroon ding mataas na alkaline phosphatase na aktibidad. Ang pinaka-nakakumbinsi na data sa mataas na pluripotent na katangian ng mga hybrid na selula ay nakuha sa mga eksperimento sa pagkuha ng isang serye ng mga iniksyon na chimera na kinasasangkutan ng mga hybrid na selula ng HESS2 clone. Ang pagsusuri ng mga biochemical marker ay nagpakita na ang mga inapo ng mga donor hybrid na selula ay naroroon sa karamihan ng mga tisyu ng mga chimera. Samakatuwid, ang mga hybrid na cell na nakuha sa pamamagitan ng pagsasama ng mga ESC at somatic differentiated na mga cell ay nagpapanatili ng pluripotency sa isang mataas na antas, kabilang ang kakayahang bumuo ng mga chimera kapag na-injected sa blastocyst cavity.

Ang mga clone na HESS2 at HESS4 ay malaki ang pagkakaiba sa komposisyon ng mga chromosome ng magulang, ngunit may mga katulad na katangian ng pluripotent. Maaaring ipagpalagay na ang pluripotency sa hybrid genome ay nagpapakita ng sarili bilang isang nangingibabaw na katangian, ngunit posible na hindi lahat ng chromosome ng embryonic genome ay kasangkot sa proseso ng pagpapanatili ng pluripotency. Kung tama ang palagay na ito, maaari itong asahan na ang pag-aalis ng ilang chromosome ng pluripotent partner mula sa genome ng hybrid cells ay hindi sasamahan ng pagbabago sa kanilang pluripotent status. Sa kasong ito, ang pagsusuri ng paghihiwalay ng mga kromosom ng magulang sa mga embryonic hybrid na selula ay magbibigay-daan sa amin na malapit na lapitan ang pagkakakilanlan ng mga kromosom na responsable para sa kontrol ng pluripotency ng mga embryonic cells.

O. Serov et al. (2001) ay hindi nakahanap ng anumang supling sa 50 supling na nakuha sa pamamagitan ng pagtawid sa mga chimera na may mga normal na daga na mayroong 129/01a mouse genotype at nagdala ng X chromosome ng DD mice. Naniniwala ang mga may-akda na ito ay dahil sa pagbaba ng pluripotency sa mga hybrid na selula sa ilalim ng impluwensya ng somatic genome. Ang isang alternatibong paliwanag ay maaaring ang negatibong epekto ng trisomy sa ilang autosome at kawalan ng balanse sa mga sex chromosome (naobserbahan ang XXY sa mga cell hanggang sa ika-15 na daanan) sa mga hybrid na selula sa panahon ng meiosis. Ito ay kilala na ang XXY cells ay hindi makakaranas ng meiosis at bumuo ng mga gametes. Ang trisomy ay maaari ring maging sanhi ng pagbawas sa proliferative na aktibidad ng mga hybrid na selula, bilang isang resulta kung saan ang pumipili na kalamangan sa pagbuo ng mga chimera ay maaaring kabilang sa mga selula ng embryo ng tatanggap. Kasunod nito na para sa isang sapat na pagtatasa ng pluripotent potensyal ng mga hybrid na selula, kinakailangan upang makakuha ng mga hybrid na clone na may normal na diploid na hanay ng mga chromosome.

Sa mga eksperimento ni O. Serov at mga co-authors (2001), ang posibilidad ng reprogramming ng X chromosome ng isang somatic cell sa genome ng hybrid na mga cell ay ipinakita sa unang pagkakataon. Ang konklusyon na ito ng mga may-akda ay sumusunod mula sa pagsusuri ng pagpapahayag ng hprt gene (isang X chromosome marker) sa chimeras: ang pagkakaroon ng allelic variant ng hprt ng DD/c mice ay nakita sa lahat ng nasuri na chimeric tissues. Angkop na bigyang-diin na pagkatapos ng pagpapakilala ng mga hybrid na selula sa blastocyst na lukab, ang mga cytohybrids ay nahuhulog sa mga hindi pumipili na mga kondisyon at ang pangangalaga ng X chromosome sa genome ng mga hybrid na selula ay nangangahulugan na ito ay naging obligadong bahagi nito at ang genome ay hindi nagdidiskrimina nito mula sa Y chromosome ng pluripotent partner.

Summarizing ang mga resulta ng pagsusuri ng pakikipag-ugnayan ng somatic at pluripotent genome sa hybrid embryonic cells, ang mga may-akda ay nagtapos na sa ilang mga cytohybrids pluripotency ay ipinahayag bilang isang nangingibabaw na katangian. Ang hybrid genome ay may kakayahang mag-reprogramming ng mga indibidwal na chromosome ng magkakaibang mga cell, na, gayunpaman, ay hindi ibinubukod ang posibilidad ng isang reverse effect ng somatic genome sa pluripotency ng embryonic genome. Kapag nag-culture ng mga hybrid na cell, ang induction ng pagkita ng kaibhan ay nangyayari nang mas madalas kaysa sa orihinal na linya ng magulang ng ESCs HM-1. Ang isang katulad na epekto ay sinusunod sa panahon ng pagbuo ng mga pangunahing kolonya: maraming mga pangunahing kolonya ng mga embryonic hybrid na selula ang naiiba sa mga unang yugto ng pagbuo na may malaking pagkawala ng mga clone sa panahon ng kanilang pagpili at pagpaparami.

Kaya, ang mga cytohybrids na nilikha ng pagsasanib ng mga ESC na may mga somatic na selula, sa kabila ng malapit na pakikipag-ugnay sa genome ng magkakaibang mga cell, ay nagpapanatili ng pluripotency bilang isang natatanging pag-aari ng embryonic genome. Bukod dito, sa gayong mga hybrid na selula, ang reprogramming ng mga indibidwal na chromosome na nagmula sa magkakaibang mga cell ay posible. Ito ay nananatiling hindi malinaw kung hanggang saan ang mga pluripotent na katangian ng embryonic genome ay nananatili sa mga hybrid na selula, lalo na, ang kanilang kakayahang lumahok sa pagbuo ng linya ng mikrobyo sa mga chimera. Nangangailangan ito ng pagkuha ng embryonic hybrid cells na may normal na karyotype. Sa anumang kaso, ang pluripotent embryonic hybrid na mga cell ay maaaring maging isang tunay na genetic na modelo para sa pagtukoy ng mga chromosome na kasangkot sa pagpapanatili ng pluripotency o pagkontrol nito, dahil ang bilateral na paghihiwalay ng mga parental chromosome ay potensyal na nagbibigay ng ganoong pagkakataon.

Walang gaanong kaakit-akit ang pag-aaral ng kababalaghan na O. Serov et al. (2001) ay tinukoy bilang "chromosomal memory". Sa hybrid genome, ang mga homologous chromosome ay nasa dalawang alternatibong pagsasaayos: ang mga homolog ng somatic partner ay minsang sumailalim sa pagkakaiba-iba, samantalang sa mga homolog ng pluripotent partner ang prosesong ito ay nagsisimula pa lamang. Dahil dito, ang pag-iingat ng mataas na pluripotent na katangian ng mga hybrid na selula ay nagpapahiwatig na ang "pluripotent" na pagsasaayos ng ESC homologs ay sapat na matatag sa hybrid genome, sa kabila ng impluwensya ng mga transacting factor na nagmumula sa somatic partner. Ang inilarawan sa itaas na mga palatandaan ng reprogramming ng homologous chromosomes ng differentiated genome sa panahon ng pagbuo ng chimeras ay hindi ibinubukod ang posibilidad na sa mga unang yugto ng pagbuo at paglilinang ng cytohybrids in vitro napanatili nila ang kanilang katayuan na nakuha sa panahon ng pagkita ng kaibahan sa vivo. Ayon sa kamakailang nakuhang data, kapag ang mga embryonic hybrid na selula ay inilipat sa isang hindi pumipili na kapaligiran, nagpapakita sila ng masinsinang pag-aalis ng mga chromosome ng somatic partner lamang, ibig sabihin, ang genome ng mga hybrid na selula ay madaling nagtatangi ng mga homologue pagkatapos ng in vitro cultivation para sa 10-15 na mga sipi. Kaya, ang mga embryonic hybrid cells ay kumakatawan sa isang promising experimental model para sa pag-aaral hindi lamang tulad ng isang pangunahing pag-aari ng embryonic genome bilang pluripotency, kundi pati na rin ang alternatibo nito - embryonic differentiation.

Therapeutic efficacy ng embryonic stem cell transplantation

Bago pag-aralan ang therapeutic efficacy ng paglipat ng mga ESC at ang kanilang mga derivatives, ibubuod namin ang materyal sa itaas. Ang mga kakayahan ng mga ESC sa mga tuntunin ng buong pagpapatupad ng embryogenesis sa vitro ay hindi sapat, dahil ang mga depekto sa pag-unlad sa kasong ito ay dahil sa kawalan ng mga mesenchymal stem cell, na bumangon sa katawan ng autonomously at independiyenteng mga ESC. Ang genetic na potensyal ng mga ESC ay mas mababa kaysa sa genetic na potensyal ng zygote, samakatuwid ang mga ESC ay hindi direktang ginagamit para sa pag-clone ng mga embryo. Ang natatanging biological na potensyal ng mga ESC bilang ang tanging mga cell kung saan ang mga programa sa pag-unlad ay ganap na naka-deploy sa isang pare-parehong pagpapatupad ay ginagamit sa mga pag-aaral ng gene function. Sa tulong ng mga ESC, ang mga unang kumbinasyon ng mga senyas na nagpapagana sa pagpapahayag ng maaga at huli na mga gene na naka-encode sa pagbuo ng tatlong layer ng mikrobyo ay na-decode. Ang pagpapanatili ng pluripotency ng ESC genome sa vitro ay ginagawa silang isang natatanging tool para sa reparative regeneration, na may kakayahang awtomatikong replenishing ang mga pagkalugi ng cellular sa kaso ng pinsala sa mga organo at tisyu. Sa isang perpektong hypothetical na senaryo, maaaring ipagpalagay na "... kapag naglilipat ng mga donor ESC, ang mga compactly packed na programa ay inililipat sa katawan ng tatanggap, na, sa ilalim ng paborableng mga kondisyon, ay naisasakatuparan sa pagbuo ng bagong tissue'7, na may kakayahang "... na mabisang isinama sa katawan ng tatanggap sa parehong morphological at functional na antas."

Naturally, kasunod ng pagbuo ng mga pamamaraan para sa monodifferentiation ng mga ESC, nagsimula ang in vivo na pag-aaral ng functional na aktibidad ng mga cell na nakuha sa vitro mula sa isang dalubhasang clone. Ang isang lumalaganap na clone ng ESC ay bumubuo ng mga populasyon ng lumilipat na mga progenitor cell na tunay na may kakayahang aktibong pagsamahin sa mga lugar ng pinsala sa tissue ng tatanggap, na ginagamit sa regenerative-plastic na gamot. Itinatag na ang paglipat ng mga neuron ng DOPA sa substantia nigra ay binabawasan ang mga klinikal na pagpapakita sa eksperimentong hemiparkinsonism. Ang mga rehiyonal na transplant ng mga donor neural stem cell ay nagbabawas sa antas ng mga sakit sa motor na dulot ng trauma o contusion ng spinal cord at utak. Ang mga unang positibong resulta ng paglipat ng stem cell sa mga demyelinating na sakit ay nakuha din. Tila na ang regenerative-plastic na potensyal ng ESCs ay nagbubukas ng walang limitasyong mga posibilidad para sa paggamit ng cell transplantation sa praktikal na gamot. Gayunpaman, kapag inilipat sa mga ectopic zone, ang mga ESC ay hindi maiiwasang magbago sa mga tumor. Nabubuo ang mga teratoma kapag ang mga ESC ay iniksyon nang subcutaneously sa immunodeficient na mga daga. Kapag ang mga suspensyon ng ESC ay inilipat sa ilalim ng kapsula ng testicle sa mga syngeneic na daga, ang mga teratoma ay nabuo din, na binubuo ng iba't ibang mga tisyu, ang mga cell na kung saan ay mga derivatives ng lahat ng tatlong mga layer ng mikrobyo. Sa ganitong mga teratoma, ang mga proseso ng pinababang organogenesis ay napakabihirang.

Ang isang bilang ng mga pag-aaral ay nagbibigay ng impormasyon sa mga positibong resulta ng paglipat ng maagang mga derivatives ng ESC sa mga hayop na may eksperimentong patolohiya. Ang cellular neurotransplantation gamit ang ESC derivatives ay higit na binuo sa mga eksperimento at ang unang mga klinikal na pagsubok upang iwasto ang mga functional disorder sa mga pinsala sa utak at spinal, at upang gamutin ang syringomyelia at multiple sclerosis (Repin, 2001). Sa pagdating ng pamamaraan ng in vitro neurogenesis mula sa ESCs, sa halip na gumamit ng embryonic brain tissue, ang mga pamamaraan ay binuo para sa paglipat ng neurosphere derivatives na nakuha mula sa embryonic nervous tissue culture. Ang ganitong mga pagsususpinde ng transplant ay higit na homogenous at naglalaman ng mga nakatuong precursors ng mga neuron at neuroglia.

Sa regular na pagdaragdag ng retinoic acid sa isang dosis na 10 μg/ml sa medium ng kultura sa loob ng 6 na linggo, higit sa 80% ng mga postmitotic neuron ay nabuo sa human embryo-(terato)-carcinoma line NTERA-2. Ang kumpletong homogeneity ng neuronal na populasyon ay nakakamit sa pamamagitan ng pag-uuri ng daloy ng mga mature na neuron na may label na immunophenotypic marker, na nagbibigay-daan sa pag-alis ng mga labi ng teratocarcinoma at mga immature na cell. Pagkatapos ng paglipat sa iba't ibang mga rehiyon ng utak ng mga eksperimentong hayop, ang mga naturang neuron ay hindi lamang nabubuhay, ngunit nagsasama rin sa mga rehiyonal na neural network. Sa mga hayop na may mga eksperimentong modelo ng mga lokal na depekto sa CNS, binabawasan ng neurotransplantation ang mga klinikal na pagpapakita ng naturang mga pathologies ng tao bilang mga kahihinatnan ng traumatic brain injury, stroke, demyelinating disease, hereditary defects sa pagbuo ng cerebellum, mga sakit ng lipid at polysaccharide deposition.

Upang ma-optimize ang mga proseso ng pagbabagong-buhay sa mga degenerative na sakit ng central nervous system, ang mga teknolohiya ay binuo para sa pagkuha ng myelin-producing oligodendrocytes mula sa ESCs. Ang unang yugto ay tradisyonal na kinabibilangan ng paglaganap ng mga ESC na may pagpaparami ng bilang ng mga selula na kinakailangan para sa paglipat. Sa ikalawang yugto, ang naka-target na pagkita ng kaibahan ng mga cell sa isang populasyon ng myelin-producing oligodendrocyte precursors ay isinasagawa, na kinokontrol ng mga selective marker antigens.

Ang ilang mga prospect ay nagbubukas para sa paggamit ng mga derivatives ng ESC para sa pagbuo ng mga pamamaraan para sa pagwawasto ng mga immunodeficiencies na dulot ng genetic defects sa thymus maturation. Sa mga pag-aaral sa knockout (rag 1) na mga daga na may induced gene defect - isang pagkagambala sa recombination mechanism ng V(D)J loci ng TCR genes, na humahantong sa pagkawala ng T-lymphocyte function, ang paglipat ng maagang ESC derivatives sa thymus ng mga hayop ay nagpapanumbalik ng maturation ng normal na populasyon ng immune clones na responsable para sa cellular immunity. Ang mga klinikal na pagsubok ng paglipat ng in vitro preformed ESCs para sa paggamot ng mga nakamamatay na namamana na anemia sa mga bata ay isinasagawa.

Ang mga pagtutol sa mabilis na pagpapakilala ng stem cell transplantation sa klinika ay batay sa limitadong bilang ng mga matatag na linya ng mga human embryonic stem cell at ang pangangailangan para sa kanilang standardisasyon. Upang mapataas ang kadalisayan ng mga standardized na linya ng ESC, pati na rin ang mga adult na stem cell ng tao, iminungkahi na gumamit ng paraan ng pagpili ng linya batay sa molecular genetic analysis ng maikling tandem DNA repeats. Kinakailangan din na subukan ang mga linya ng ESC para sa pagkakaroon ng maliliit na chromosomal rearrangements at genetic mutations, ang potensyal na mangyari sa ilalim ng mga kondisyon ng cell culture ay medyo mataas. Ang isang tesis ay iniharap tungkol sa ipinag-uutos na pagsusuri ng mga katangian ng lahat ng uri ng ESC at rehiyonal na pluripotent stem cell, dahil ang kanilang pagpaparami sa vitro ay maaaring humantong sa paglitaw ng mga bagong katangian na hindi likas sa mga embryonic stem cell o tiyak na mga tisyu. Sa partikular, ipinapalagay na ang pangmatagalang paglilinang sa media na may mga cytokine ay nagdudulot ng mga linya ng ESC na mas malapit sa mga selula ng tumor, dahil sumasailalim sila sa mga katulad na pagbabago sa mga landas ng regulasyon ng cell cycle na may pagkuha ng kakayahang magsagawa ng walang limitasyong bilang ng mga dibisyon ng cell. Ang ilang mga may-akda, batay sa potensyal para sa pag-unlad ng tumor, ay isinasaalang-alang ang paglipat ng maagang embryonic stem cell derivatives sa mga tao bilang walang ingat. Sa kanilang opinyon, mas ligtas na gumamit ng mga nakatuong inapo ng mga ESC, ibig sabihin, mga linya ng magkakaibang cell progenitor. Gayunpaman, sa kasalukuyan, ang isang maaasahang pamamaraan para sa pagkuha ng matatag na mga linya ng cell ng tao na naiiba sa nais na direksyon ay hindi pa nabuo.

Kaya, parami nang parami ang data sa positibong therapeutic effect ng paglipat ng mga human embryonic stem cell derivatives ay lumilitaw sa panitikan. Gayunpaman, marami sa mga pag-aaral na ito ay sinusuri at pinupuna. Ang ilang mga mananaliksik ay naniniwala na ang mga resulta ng maagang mga klinikal na pagsubok ay paunang likas at nagpapahiwatig lamang na ang mga stem cell ay may kakayahang magbigay ng magandang epekto sa klinikal na kurso ng isang partikular na sakit. Samakatuwid, kinakailangan upang makakuha ng data sa mga malalayong resulta ng paglipat ng cell. Ang mga yugto ng pag-unlad ng klinikal na neurotransplantology ay binanggit bilang isang argumento. Sa katunayan, sa una, ang mga publikasyon sa mataas na kahusayan ng paglipat ng mga fragment ng embryonic na utak sa sakit na Parkinson ay nanaig sa panitikan, ngunit pagkatapos ay nagsimulang lumitaw ang mga ulat na tinatanggihan ang therapeutic na kahusayan ng embryonic o fetal nerve tissue na inilipat sa utak ng mga pasyente.

Ang mga unang klinikal na pagsubok ay isinagawa upang masuri ang kaligtasan ng paglipat ng mga neuroblast na nagmula sa NTERA-2 teratocarcinoma ESCs, ang mga wala pa sa gulang na mga cell na kung saan ay sumailalim sa paglaganap sa kultura hanggang sa akumulasyon ng 100 milyong cell mass. Ang ilan sa mga cell na nakuha sa ganitong paraan ay ginamit upang makilala ang phenotype at matukoy ang mga cellular impurities, pati na rin upang subukan para sa posibleng kontaminasyon sa mga virus at bakterya. Ang LIF at ang feeder layer ng fetal stromal cells ay inalis mula sa culture medium, at ang mga kondisyon ay nilikha para sa naka-target na pagkita ng kaibahan ng mga ESC sa mga neuroblast gamit ang kumbinasyon ng mga cytokine at growth factor. Pagkatapos ang mga neuroblast ay nalinis mula sa mga wala pa sa gulang na teratocarcinoma cells sa isang flow cell sorter. Pagkatapos ng pangalawang purification at phenotype characterization ng mga transplanted cells, isang suspensyon ng neuroblasts (10-12 milyon) ang iniksyon sa basal nucleus ng utak ng mga pasyente (sa ikapitong buwan pagkatapos ng hemorrhagic stroke) gamit ang isang espesyal na microcannula at syringe sa ilalim ng stereotaxic at computed tomography control. Ang post-transplant na isang taong screening ng mga kahihinatnan ng paglipat ng neuron sa stroke zone ay hindi nagpahayag ng anumang mga side o hindi kanais-nais na mga epekto. Kalahati ng mga pasyente ay nagpakita ng pagpapabuti sa pag-andar ng motor sa panahon mula 6 hanggang 12 buwan pagkatapos ng paglipat. Ang mga positibong klinikal na pagbabago ay sinamahan ng pagtaas ng suplay ng dugo sa stroke zone pagkatapos ng paglipat ng cell: ang average na pagtaas sa pagsipsip ng fluorescently na may label na 2-deoxyglucose, ayon sa positron emission tomography, ay umabot sa 18%, at sa ilang mga pasyente - 35%.

Gayunpaman, ang US National Institutes of Health ay nagsagawa ng isang independiyenteng pag-aaral ng klinikal na bisa ng neurotransplantation sa mga pasyente na may Parkinsonism. Ang mga pasyente sa unang grupo ay inilipat ng mga seksyon ng embryonic nerve tissue na gumagawa ng dopamine, habang ang pangalawang grupo ng mga pasyente ay sumailalim sa isang sham operation. Ang mga resulta ay nagpapahiwatig ng zero klinikal na bisa ng naturang neurotransplantation, sa kabila ng katotohanan na ang dopamine-producing embryonic neurons ay nakaligtas sa utak ng mga tatanggap. Bukod dito, 2 taon pagkatapos ng paglipat ng embryonic nerve tissue, 15% ng mga pasyente ay nagkaroon ng patuloy na dyskinesia, na wala sa mga pasyente sa placebo group (Stem cells: siyentipikong pag-unlad at mga direksyon sa pananaliksik sa hinaharap. Nat. Inst, ng Health. USA). Ang mga obserbasyon ng karagdagang pag-unlad ng sakit sa mga pasyenteng ito ay patuloy.

Ang ilang mga may-akda ay nag-uugnay sa magkasalungat na data ng literatura sa pagtatasa ng klinikal na pagiging epektibo ng neurotransplantation na may iba't ibang mga diskarte sa pagpili ng mga grupo ng pasyente, hindi sapat na pagpili ng mga pamamaraan para sa layunin na pagtatasa ng kanilang kondisyon, at, pinaka-mahalaga, iba't ibang mga panahon ng pag-unlad ng embryonic nervous tissue at iba't ibang mga lugar ng utak kung saan nakuha ang tissue na ito, iba't ibang laki ng transplant at mga tampok na pamamaraan ng interbensyon sa kirurhiko.

Dapat pansinin na ang mga pagtatangka sa direktang paglipat ng pluripotent embryonic stem cells sa striatum na rehiyon ng utak ng mga daga na may eksperimentong hemiparkinsonism ay sinamahan ng paglaganap ng mga ESC at ang kanilang pagkakaiba-iba sa mga dopaminergic neuron. Dapat ipagpalagay na ang mga bagong nabuo na neuron ay epektibong isinama sa mga neural network, dahil pagkatapos ng paglipat ng ESC, ang pagwawasto ng mga anomalya sa pag-uugali at kawalaan ng simetrya ng motor sa pagsubok ng apomorphine ay naobserbahan. Kasabay nito, ang ilang mga hayop ay namatay dahil sa pagbabago ng mga inilipat na ESC sa mga tumor sa utak.

Ang mga eksperto mula sa National and Medical Academies ng USA, mga espesyalista mula sa National Institute of Health ng USA ay naniniwala na ang klinikal na potensyal ng ESCs ay nararapat sa pinaka-seryosong pansin, ngunit igiit ang pangangailangan para sa isang detalyadong pag-aaral ng kanilang mga ari-arian, ang posibilidad ng mga komplikasyon at pangmatagalang kahihinatnan sa mga eksperimento sa sapat na biological na mga modelo ng mga sakit ng tao (Stem cell at hinaharap na direksyon ng Stem. Nat. Inst, ng Health USA).

Mula sa puntong ito ng pananaw, mahalaga na ang isang paghahambing na pagsusuri sa histological ng mga eksperimentong teratoma na nakuha sa pamamagitan ng paglipat ng suspensyon ng ESC sa testis na may mga teratoma na nabuo bilang resulta ng paglipat ng isang maagang embryo, na naglalaman din ng ESC, ay nagpakita na ang ESC, anuman ang kanilang pinagmulan o pakikipag-ugnayan sa ilang mga nakapaligid na selula, ay nagpapatupad ng kanilang potensyal na tumorigenic sa parehong paraan. Napatunayan na ang mga naturang teratoma ay may clonal na pinagmulan, dahil ang mga tumor na binubuo ng mga derivatives ng lahat ng tatlong layer ng mikrobyo ay maaaring lumabas mula sa isang ESC (Rega, 2001). Kapansin-pansin na kapag ang mga naka-clone na ESC na may normal na karyotype ay inilipat sa mga immunodeficient na daga, nabuo din ang mga teratoma na binubuo ng iba't ibang uri ng magkakaibang mga somatic cells. Ang mga pang-eksperimentong data na ito ay hindi nagkakamali na patunay ng clonal na pinagmulan ng teratomas. Mula sa punto ng view ng developmental biology, ipinapahiwatig nila na hindi maramihang naka-commit na progenitor cells, ngunit isang solong pluripotent stem cell ang gumaganap bilang isang pinagmumulan ng magkakaibang mga derivatives ng lahat ng tatlong layer ng mikrobyo na bumubuo sa isang teratoma. Gayunpaman, sa landas sa praktikal na paglipat ng cell, ang mga resulta ng mga pag-aaral na ito ay, kung hindi isang nagbabawal, pagkatapos ay isang babala na senyales ng potensyal na panganib, dahil ang inoculation ng ESCs o primordial germ cells sa iba't ibang mga tisyu ng mga adult immunodeficient na daga ay hindi maiiwasang nagiging sanhi ng pag-unlad ng mga tumor mula sa transplanted stem cell. Ang neoplastic degeneration ng ectopically transplanted ESCs ay sinamahan ng paglitaw ng satellite populations ng differentiated cells - dahil sa partial differentiation ng ESCs at progenitor clone sa mga espesyal na linya. Kapansin-pansin, kapag ang mga ESC ay inilipat sa mga kalamnan ng kalansay, ang mga neuron ay kadalasang nabuo sa tabi ng mga selulang teratocarcinoma. Gayunpaman, ang pagpapakilala ng mga ESC sa isang naghahati na itlog o blastocyst ay sinamahan ng kumpletong pagsasama ng mga selula sa embryo nang walang pagbuo ng mga neoplastic na elemento. Sa kasong ito, ang mga ESC ay isinama sa halos lahat ng mga organo at tisyu ng embryo, kabilang ang genital primordium. Ang ganitong mga hayop na allophene ay unang nakuha sa pamamagitan ng pagpapakilala ng teratocarcinoma 129 na mga selula sa mga maagang embryo sa 8-100 na yugto ng cell. Sa allophene mice, ang mga populasyon ng mga heterogenous na cell na nagmula sa mga donor ESC ay isinama sa mga tisyu ng bone marrow, bituka, balat, atay, at maselang bahagi ng katawan, na ginagawang posible na lumikha ng kahit na mga interspecies na cell chimera sa eksperimento. Ang mas maikli ang panahon ng pag-unlad ng maagang embryo, mas mataas ang porsyento ng cell chimerization, na may pinakamataas na antas ng chimerization na sinusunod sa hematopoietic system, balat, nervous system, atay, at maliit na bituka ng allophene embryo. Sa isang pang-adultong organismo, ang mga tisyu na protektado mula sa immune system ng tatanggap ng histohematic barrier ay madaling kapitan ng chimerization:Ang paglipat ng mga pangunahing selula ng mikrobyo sa testicular parenchyma ay sinamahan ng pagsasama ng mga donor stem cell sa germinal tissue layer ng tatanggap. Gayunpaman,Kapag inilipat ang mga ESC sa isang blastocyst, ang pagbuo ng mga chimeric na simula ng mga sekswal na organo na may henerasyon ng mga donor na pangunahing mikrobyo ay hindi nangyayari. Ang pluripotency ng ESCs, kapag nilikha ang mga espesyal na kondisyon, ay maaari ding gamitin para sa pag-clone: ang paglipat ng mga ESC ng mouse sa isang 8-16-cell na embryo ng mouse, kung saan ang mga cellular mitoses ay hinarangan ng cytocalsin, ay nagtataguyod ng pagpapatupad ng normal na embryogenesis sa pagbuo ng isang embryo mula sa mga donor ESC.

Samakatuwid, ang isang alternatibo sa allogeneic ESC transplantation ay therapeutic cloning batay sa paglipat ng somatic cell nuclei sa isang enucleated egg upang lumikha ng isang blastocyst, mula sa inner cell mass kung saan ang mga linya ng ESCs na genetically identical sa donor ng somatic nucleus ay pagkatapos ay ihiwalay. Sa teknikal, ang ideyang ito ay lubos na magagawa, dahil ang posibilidad ng paglikha ng mga linya ng ESC mula sa mga blastocyst na nakuha pagkatapos ng paglipat ng somatic nuclei sa mga enucleated na itlog ay paulit-ulit na napatunayan sa mga eksperimento sa mga hayop sa laboratoryo (Nagy, 1990; Munsie, 2000). Sa partikular, sa mga mice homozygous para sa rag2 gene mutation, ang mga fibroblast na nakuha sa pamamagitan ng pag-culture ng subepidermal tissue cells ay ginamit bilang mga donor ng nuclei, na inilipat sa enucleated oocytes. Matapos ang pag-activate ng oocyte, ang "zygote" ay nilinang hanggang sa pagbuo ng blastocyst, mula sa inner cell mass kung saan ang mga ESC ay nakahiwalay at inilipat sa isang linya ng mga cell na nullizygous para sa mutant gene (rag2~/~). Ang mutation ng isang allelic gene ay naitama sa naturang mga ESC sa pamamagitan ng paraan ng homologous recombination. Sa unang serye ng mga eksperimento, ang mga katawan ng embryoid ay nakuha mula sa mga ESC na may isang recombinant na naibalik na gene, ang kanilang mga cell ay inilipat na may isang recombinant retrovirus (HoxB4i / GFP) at, pagkatapos ng pagpaparami, ay na-injected sa ugat ng rag2~/~ mice. Sa pangalawang serye, ang mga tetraploid blastomeres ay pinagsama-sama sa mga genetically modified na ESC at inilipat sa mga babaeng tatanggap. Ang nagresultang immunocompetent na mga daga ay nagsilbing bone marrow donor para sa paglipat sa rag2~/~ mutant mice. Sa parehong serye, positibo ang resulta: pagkaraan ng 3-4 na linggo, ang mga normal na myeloid at lymphoid cells na may kakayahang gumawa ng immunoglobulin ay natagpuan sa lahat ng daga. Kaya, ang paglipat ng somatic cell nuclei sa mga oocytes ay maaaring gamitin hindi lamang upang makakuha ng mga linya ng ESC, kundi pati na rin para sa cytogenotherapy - pagwawasto ng mga hereditary anomalya, gamit ang ESC bilang isang vector para sa transportasyon ng corrective genetic na impormasyon. Ngunit ang direksyong ito ng paglipat ng cell, bilang karagdagan sa mga problema sa bioethical, ay may mga limitasyon nito. Ito ay hindi malinaw kung gaano magiging ligtas ang paglipat ng mga therapeutically cloned na mga cell na may genotype na kapareho ng genotype ng isang partikular na pasyente, dahil ang mga naturang cell ay maaaring magpakilala ng mga mutasyon na lumikha ng isang predisposisyon sa iba pang mga sakit. Ang mga normal na itlog ng tao ay nananatiling isang bagay na mahirap ma-access, samantalang kahit na sa paglipat ng somatic nuclei sa mga enucleated na itlog ng hayop, 15-25% lamang ng mga itinayong "zygotes" ang bubuo sa yugto ng blastocyst. Hindi pa natutukoy kung gaano karaming mga blastocyst ang kinakailangan upang makakuha ng isang linya ng pluripotent cloned ESCs. Dapat ding tandaan ang mataas na antas ng mga gastos sa pananalapi na nauugnay sa pagiging kumplikado ng pamamaraan ng therapeutic cloning.

Sa konklusyon, dapat tandaan na sa mga ESC, ang pluripotency ng genome na may hypomethylated DNA ay pinagsama sa mataas na aktibidad ng telomerase at isang maikling C^ phase ng cell cycle, na nagsisiguro ng kanilang intensive at potensyal na walang katapusang pagpaparami, kung saan ang mga ESC ay nagpapanatili ng isang diploid set ng mga chromosome at isang "juvenile" na hanay ng mga phenotypic na katangian. Ang paglaki ng clonal ng mga ESC sa kultura ay hindi nakakasagabal sa kanilang pagkakaiba-iba sa anumang espesyal na linya ng cell ng organismo kapag ang paglaganap ay itinigil at ang mga naaangkop na signal ng regulasyon ay idinagdag. Ang paghihigpit sa pagkita ng kaibhan ng mga ESC sa mga somatic cell line sa vitro ay natanto nang walang paglahok ng mesenchyme, pag-bypass sa Nochteys, sa labas ng organogenesis at walang pagbuo ng embryo. Ang ectopic na pagpapakilala ng mga ESC sa vivo ay hindi maiiwasang humahantong sa pagbuo ng mga teratocarcinomas. Ang paglipat ng mga ESC sa isang blastocyst o maagang embryo ay sinamahan ng kanilang pagsasama sa mga embryonic na tisyu at matatag na chimerization ng mga organo nito.

Ang mga regenerative-plastic na teknolohiya batay sa cell transplantation ay ang punto ng intersection ng mga interes ng mga kinatawan ng cell biology, developmental biology, experimental genetics, immunology, neurology, cardiology, hematology at marami pang ibang sangay ng eksperimental at praktikal na gamot. Ang pinakamahalagang resulta ng mga eksperimentong pag-aaral ay nagpapatunay sa posibilidad ng reprogramming stem cell na may naka-target na pagbabago sa kanilang mga pag-aari, na nagbubukas ng mga prospect para sa pagkontrol sa mga proseso ng cytodifferentiation gamit ang growth factor - para sa myocardial regeneration, pagpapanumbalik ng CNS lesions at normalization ng function ng islet apparatus ng pancreas. Gayunpaman, para sa malawakang pagpapakilala ng paglipat ng mga derivatives ng ESC sa praktikal na gamot, kinakailangan na pag-aralan ang mga katangian ng mga stem cell ng tao nang mas detalyado at ipagpatuloy ang mga eksperimento sa mga ESC sa mga modelo ng eksperimentong sakit.

Ang mga isyu sa bioethical at ang problema ng pagtanggi sa isang allogeneic cell transplant ay maaaring malutas sa pamamagitan ng natuklasang plasticity ng genome ng mga regional stem cell ng isang adult na organismo. Gayunpaman, ang paunang impormasyon na kapag ang paglipat ng mga nakahiwalay at maingat na nailalarawan na mga hematopoietic autologous na mga cell sa atay, kung saan nagmula ang mga bagong hepatocytes, na nagsasama sa mga lobules ng atay, ay binago at pinupuna ngayon. Gayunpaman, ang data ay nai-publish na ang paglipat ng mga neural stem cell sa thymus ay nagiging sanhi ng pagbuo ng mga bagong donor T- at B-lymphocyte sprouts, at ang paglipat ng brain neural stem cell sa bone marrow ay humahantong sa pagbuo ng hematopoietic sprouts na may pangmatagalang donor myelo- at erythropoiesis. Dahil dito, ang mga pluripotent stem cell na may kakayahang i-reprogramming ang genome sa potensyal ng mga ESC ay maaaring manatili sa mga organo ng isang pang-adultong organismo.

Ang pinagmulan ng pagkuha ng ESC para sa mga layuning medikal ay nananatiling ang embryo ng tao, na predetermine ang hindi maiiwasang isang bagong intersection ng moral, etikal, legal at relihiyosong mga isyu sa punto ng pinagmulan ng buhay ng tao. Ang pagtuklas ng ESC ay nagbigay ng malakas na puwersa sa pagpapatuloy ng mahihirap na talakayan tungkol sa kung saan ang linya sa pagitan ng mga buhay na selula at bagay, pagkatao at personalidad. Kasabay nito, walang mga unibersal na pamantayan, tuntunin at batas tungkol sa paggamit ng ESC sa medisina, sa kabila ng paulit-ulit na pagtatangka na likhain at pagtibayin ang mga ito. Ang bawat estado, sa loob ng balangkas ng batas nito, ay malulutas ang problemang ito nang nakapag-iisa. Para sa kanilang bahagi, ang mga doktor sa buong mundo ay patuloy na sumusubok na kumuha ng regenerative-plastic na gamot na lampas sa saklaw ng naturang mga talakayan, pangunahin sa pamamagitan ng paggamit ng mga adult stem cell reserves sa halip na mga embryonic stem cell.

Ang kaunting kasaysayan ng paghihiwalay ng mga embryonic stem cell

Ang mga terato(embryo)carcinoma cells ay ibinukod mula sa mga kusang nagaganap na testicular teratoma ng 129/ter-Sv mice, spontaneous ovarian teratomas ng Lt/Sv mice, at mula sa mga teratoma na nagmula sa ectopically transplanted embryonic cells o tissues. Kabilang sa mga stable na mouse terato(embryo)carcinoma cell lines na nakuha sa ganitong paraan, ang ilan ay pluripotent, ang iba ay naiba lamang sa isang partikular na uri ng cell, at ang ilan ay ganap na walang kakayahan sa cytodifferentiation.

Sa isang pagkakataon, ang focus ay sa mga pag-aaral kung saan ang mga resulta ay nagpapahiwatig ng posibilidad ng pagbabalik ng terato-(embryo)-carcinoma cells sa isang normal na phenotype pagkatapos ng kanilang pagpapakilala sa mga tisyu ng isang umuunlad na embryo, pati na rin ang paggawa sa in vitro na paglikha ng genetically modified terato-(embryo)-carcinoma cells, sa tulong kung saan nakuha ang kanyang biological pathology ng mga mice ng tao.

Ginamit ang conditioned suspension cultivation para ihiwalay ang mga linya ng cell ng terato-(embryo)-carcinoma. Sa kultura, ang mga terato-(embryo)-carcinoma cells, tulad ng mga ESC, ay lumalaki upang bumuo ng mga embryoid na katawan at nangangailangan ng mandatoryong dissociation para sa paglilipat ng linya, pagpapanatili ng pluripotency sa isang feeder layer ng mga embryonic fibroblast o sa panahon ng paglilinang ng suspensyon sa isang nakakondisyon na medium. Ang mga cell ng pluripotent terato-(embryo)-carcinoma na mga linya ay malaki, spherical, nailalarawan sa pamamagitan ng mataas na alkaline phosphatase na aktibidad, bumubuo ng mga pinagsama-sama at may kakayahang multidirectional differentiation. Kapag ipinakilala sa isang blastocyst, pinagsama sila sa morula, na humahantong sa pagbuo ng mga chimeric embryo, sa komposisyon ng iba't ibang mga organo at tisyu kung saan matatagpuan ang mga derivatives ng terato-(embryo)-carcinoma cells. Gayunpaman, ang napakaraming karamihan ng naturang mga chimeric embryo ay namamatay sa utero, at sa mga organo ng mga nakaligtas na bagong panganak na chimera, ang mga dayuhang selula ay bihirang natukoy at nasa mababang density. Kasabay nito, ang saklaw ng mga bukol (fibrosarcoma, rhabdomyosarcoma, iba pang mga uri ng malignant na mga bukol at pancreatic adenoma) ay tumataas nang husto, at ang pagkabulok ng tumor ay kadalasang nangyayari sa panahon ng intrauterine development ng chimeric embryo.

Karamihan sa mga terato-(embryo)-carcinoma cells sa microenvironment ng normal na embryonic cells ay halos natural na nakakakuha ng mga malignant na neoplastic na katangian. Ito ay pinaniniwalaan na ang hindi maibabalik na malignancy ay dahil sa pag-activate ng mga proto-oncogenes sa proseso ng mga pagbabago sa istruktura. Ang isa sa mga pagbubukod ay ang mga cell ng embryocarcinoma line na SST3, na nakuha mula sa mouse testicular teratomas (linya 129/Sv-ter), na nagpapakita ng mataas na kakayahang magsama sa mga tisyu at organo ng embryo nang walang kasunod na pagbuo ng tumor sa chimeric mice. Ang mga derivatives ng terato-(embryo)-carcinoma cell lines sa chimeric mice ay halos hindi nakikilahok sa pagbuo ng mga pangunahing gonocytes. Tila, ito ay dahil sa mataas na dalas ng mga chromosomal aberration na katangian ng karamihan sa mga linya ng terato-(embryo)-carcinoma, sa mga selula kung saan ang parehong aneuploidy at chromosomal abnormalities ay sinusunod.

Maraming mga matatag na linya ng terato-(embryo)-carcinoma cells ng tao na nailalarawan sa pamamagitan ng pluripotency, mataas na proliferative na aktibidad at ang kakayahang mag-iba sa panahon ng paglaki sa mga kultura ay nakuha sa mga kondisyon ng laboratoryo. Sa partikular, ang linya ng terato-(embryo)-carcinoma cells ng tao NTERA-2 ay ginamit upang pag-aralan ang mga mekanismo ng neural cytodifferentiation. Pagkatapos ng paglipat ng mga cell ng linyang ito sa subventricular na rehiyon ng forebrain ng bagong panganak na daga, ang kanilang paglipat at neurogenesis ay naobserbahan. Ang mga pagtatangka ay ginawa kahit na i-transplant ang mga neuron na nakuha sa pamamagitan ng pag-culture ng mga cell ng terato-(embryo)-carcinoma line NTERA-2 sa mga pasyente na may mga stroke, na, ayon sa mga may-akda, ay humantong sa isang pagpapabuti sa klinikal na kurso ng sakit. Kasabay nito, walang mga kaso ng malignancy ng mga transplanted cells ng terato-(embryo)-carcinoma line NTERA-2 sa mga pasyenteng may stroke.

Ang mga unang linya ng walang pagkakaiba na pluripotent mouse embryonic stem cell ay nakuha noong unang bahagi ng 1980s nina Evans at Martin, na naghiwalay sa kanila mula sa inner cell mass ng blastocyst - ang embryoblast. Ang mga nakahiwalay na linya ng ESC ay nagpapanatili ng pluripotency at ang kakayahang mag-iba sa iba't ibang uri ng cell sa ilalim ng impluwensya ng mga kadahilanan sa isang espesyal na daluyan ng kultura sa loob ng mahabang panahon.

Ang terminong "embryonic pluripotent stem cell" mismo ay pag-aari ni Leroy Stevens, na, habang pinag-aaralan ang epekto ng tobacco tar sa saklaw ng pag-unlad ng tumor, ay nakakuha ng pansin sa kusang paglitaw ng testicular teratocarcinoma sa linear (129/v) na mga daga ng control group. Ang mga selula ng testicular teratocarcinomas ay nailalarawan sa pamamagitan ng isang mataas na rate ng paglaganap, at sa pagkakaroon ng likido mula sa lukab ng tiyan ay kusang-loob nilang naiiba sa pagbuo ng mga neuron, keratinocytes, chondrocytes, cardiomyocytes, pati na rin ang mga fragment ng buhok at buto, ngunit walang anumang mga palatandaan ng iniutos na cytoarchitecture ng tissue. Kapag inilagay sa kultura, ang mga cell ng teratocarcinoma ay lumago bilang mga pluripotent clone na hindi nakakabit sa substrate at nabuo ang mga embryoid na katawan, pagkatapos nito ay tumigil sila sa paghahati at sumailalim sa kusang hindi pagkakasundo sa mga neuron, glia, mga selula ng kalamnan, at mga cardiomyocytes. Nalaman ni Stevens na ang mouse teratocarcinoma 129/v ay naglalaman ng mas mababa sa 1% ng mga cell na may kakayahang mag-iba sa iba't ibang mga espesyal na somatic na linya, at ang pagkakaiba mismo ay nakasalalay sa mga salik na nakakaapekto sa kanila (ang komposisyon ng peritoneal fluid, mga produkto ng mga mature na selula o mga tisyu na idinagdag sa kultura). Ang hypothesis ni Leroy Stevenson tungkol sa pagkakaroon ng mga embryonic progenitor cells ng germ line sa mga teratocarcinoma cells ay nakumpirma: isang suspensyon ng embryoblast cells mula sa preimplantation embryo sa mga tisyu ng mga adult na daga na nabuo teratocarcinomas, at purong mga linya ng cell na nakahiwalay sa kanila pagkatapos ng intraperitoneal na pangangasiwa sa mga recipient na mga cell na may iba pang mga cardiomyo na naiba-iba mula sa lahat ng mga cell ng neuron ng cardiomyo. mga layer ng mikrobyo. Sa mga eksperimento sa vivo, ang paglipat ng mga ESC (nakuha mula sa embryoblast, ngunit hindi sa trophoblast) sa mga embryo ng mouse ng isa pang linya sa mga yugto ng blastomere 8-32 ay nagresulta sa pagsilang ng mga chimeric na hayop (nang walang pag-unlad ng mga tumor), kung saan natagpuan ang mga organo ng sprouts ng donor tissue. Ang chimerism ay naobserbahan kahit na sa linya ng cell ng mikrobyo.

Ang mga pangunahing progenitor germ cells na nakahiwalay sa genital rudiment ng isang mouse embryo ay tumutugma sa morphology, immunological phenotype at functional na katangian sa mga ESC na nakuha ni Stevenson mula sa teratocarcinoma at embryoblast. Sa mga chimera na ipinanganak pagkatapos na maipasok ang mga ESC sa isang blastocyst, ang allophene morphogenesis ng mga organo ay nailalarawan sa pamamagitan ng isang mosaic na paghalili ng donor at tatanggap na istruktura at functional na mga yunit ng atay, baga at bato. Sa ilang mga kaso, ang pagbuo ng mga intestinal crypts o liver lobules na binubuo ng parehong recipient at donor cells ay naobserbahan. Gayunpaman, ang morphogenesis ay palaging natanto ayon sa genetic na programa ng mga species kung saan kabilang ang tatanggap, at ang chimerism ay limitado lamang sa antas ng cellular.

Noon ay itinatag na ang paglaganap ng mga ESC na walang cytodifferentiation sa isang feeder layer ng mesenchyme-derived cells (fetal fibroblasts) ay nangyayari na may obligadong presensya ng LIF sa selective nutrient media, na piling tinitiyak ang kaligtasan ng mga stem at progenitor cells lamang, habang ang karamihan sa mga dalubhasang elemento ng cellular ay namamatay. Gamit ang gayong mga pamamaraan, noong 1998 ay naghiwalay si James Thomson ng limang imortalized na linya ng mga embryonic stem cell mula sa inner cell mass ng isang blastocyst ng tao. Sa parehong taon, si John Gerhart ay bumuo ng isang paraan para sa paghiwalay ng walang kamatayang mga linya ng ESC mula sa genital tubercle ng apat hanggang limang linggong gulang na mga embryo ng tao. Dahil sa kanilang mga natatanging katangian, makalipas lamang ang dalawang taon, ang mga embryonic stem cell at stem cell ng mga tiyak na tisyu ay nagsimulang gamitin sa pagsasagawa ng regenerative medicine at gene therapy.