Diagnosis ng laboratoryo ng tuberculosis

Ang tuberculosis ay isang sakit na madaling masuri sa mga modernong kondisyon at siyentipikong tagumpay. Ang mga diagnostic ng laboratoryo ng tuberculosis ay sumasakop sa isang sentral na lugar bukod sa iba pang mga diagnostic na pamamaraan, pangalawa lamang sa mga pamamaraan ng pagsusuri sa X-ray.

[ 1 ], [ 2 ], [ 3 ], [ 4 ]

Klinikal na pagsusuri sa dugo

Sa mga pasyente na may tuberculosis, ang mga pagbabago sa pangkalahatang pagsusuri sa dugo ay hindi pathognomonic. Sa limitado at mababang-aktibong anyo ng tuberculosis, ang hypochromia ng mga erythrocytes na may normal na bilang ay katangian. Sa napakalaking infiltrates o caseous pneumonia, na may malawak na caseous lymphadenitis, ang partikular na pinsala sa bituka, pati na rin ang malalaking pulmonary o postoperative hemorrhages, erythropenia at microcytosis, oligochromasia, polychromasia ay nabanggit. Ang macrocytosis, at lalo na ang poikilocytosis, ay hindi gaanong madalas, kadalasang may malubhang anemia. Ang bilang ng mga reticulocytes sa nabayarang yugto ng tuberculosis ay nag-iiba mula 0.1 hanggang 0.6%, sa subcompensated na yugto - mula 0.6 hanggang 1.0%, at para sa decompensated na yugto, 1% ng mga reticulocytes ay katangian.

Sa ilang mga kaso ng tuberculosis, ang katamtamang leukocytosis (hanggang sa 15 libong leukocytes) ay maaaring maobserbahan, mas madalas na leukopenia, na nangyayari sa 2-7% ng mga kaso sa mga pasyente na may limitado at banayad na mga anyo ng proseso at sa 12.5% sa mapanirang at progresibong pulmonary tuberculosis.

Kadalasan, ang mga pagbabago ay nangyayari sa leukocyte formula. Ang parehong kamag-anak at ganap na neutrophilia ay nabanggit, isang katamtamang paglilipat sa leukocyte formula sa kaliwa sa promyelocytes. Ang mga myelocytes ay napakabihirang nakatagpo sa mga kaso ng hindi komplikadong tuberculosis. Ang isang pagtaas sa bilang ng mga neutrophil na may pathological granularity sa hemogram ng isang pasyente na may tuberculosis ay palaging nagpapahiwatig ng tagal ng proseso: sa mga pasyente na may malubhang tuberculosis, halos lahat ng neutrophils ay naglalaman ng pathological granularity. Kapag ang pagsiklab ng tuberculosis ay humupa, ang nuclear shift ay bumalik sa normal na medyo mabilis. Ang pathological granularity ng neutrophils ay karaniwang nagpapatuloy nang mas mahaba kaysa sa iba pang mga pagbabago sa hemogram.

Ang nilalaman ng mga eosinophil sa peripheral na dugo ay nagbabago din depende sa yugto ng proseso at ang allergic na estado ng organismo. Ang kanilang bilang ay bumababa sa aneosinophilia sa malubha at matagal na paglaganap ng sakit at, sa kabaligtaran, ay tumataas sa panahon ng resorption ng infiltrates at pleural effusion, pati na rin sa mga maagang anyo ng pangunahing tuberculosis.

Karamihan sa mga anyo ng pangunahing tuberculosis ay sinamahan ng lymphopenia, na kung minsan ay sinusunod sa loob ng ilang taon kahit na pagkatapos ng pagkakapilat ng mga partikular na pagbabago. Ang pangalawang tuberculosis sa talamak na yugto, depende sa kalubhaan ng proseso, ay maaaring sinamahan ng alinman sa isang normal na bilang ng mga lymphocytes o lymphopenia.

Kabilang sa mga pagsusuri para sa pagtatasa ng proseso ng tuberculosis, isang espesyal na lugar ang inookupahan sa pamamagitan ng pagtukoy ng erythrocyte sedimentation rate (ESR), na mahalaga sa pagtatasa ng kurso ng proseso ng tuberculosis at pagtukoy sa mga aktibong anyo nito. Ang pagtaas sa ESR ay nagpapahiwatig ng pagkakaroon ng isang proseso ng pathological (nakakahawa at nagpapasiklab, purulent, septic, hemoblastosis, lymphogranulomatosis, atbp.) At nagsisilbing tagapagpahiwatig ng kalubhaan nito, ngunit ang mga normal na halaga ng ESR ay hindi palaging nagpapahiwatig ng kawalan ng patolohiya. Ang pagpabilis ng erythrocyte sedimentation ay pinadali ng isang pagtaas sa nilalaman ng globulins, fibrinogen, kolesterol sa dugo at pagbaba sa lagkit ng dugo. Ang pagbagal ng erythrocyte sedimentation ay katangian ng mga kondisyon na sinamahan ng hemoconcentration, isang pagtaas sa nilalaman ng albumin at bile acid.

Ang hemogram ng mga pasyente ng tuberculosis ay nagbabago sa panahon ng paggamot. Kung mas matagumpay ang therapeutic intervention, mas mabilis na nawawala ang mga pagbabago sa hematological. Kasabay nito, dapat tandaan ang epekto ng iba't ibang antibacterial na gamot sa hematopoiesis. Madalas silang nagiging sanhi ng eosinophilia, sa ilang mga kaso - leukocytosis, at mas madalas na leukopenia hanggang sa agranulocytosis at lymphoid-reticular reaksyon. Ang sistematikong pagsubaybay sa hematological at tamang pagsusuri ng data na nakuha ay mahalaga para sa pagtatasa ng klinikal na kondisyon ng pasyente, ang dynamics ng proseso at ang pagiging epektibo ng paggamot.

[ 5 ], [ 6 ], [ 7 ], [ 8 ], [ 9 ]

Pagsusuri ng klinikal na ihi

Sa kaso ng urinary tract tuberculosis, ang pagsusuri sa ihi ay ang pangunahing pamamaraan ng diagnostic ng laboratoryo. Maaaring maobserbahan ang leukocyturia, erythrocyturia, proteinuria, hypoisosthenuria, tuberculous mycobacteriuria, non-specific bacteriuria.

Ang leukocyturia ay ang pinaka-karaniwang sintomas ng urinary tract tuberculosis bago ang partikular na chemotherapy at wala lamang sa mga pambihirang kaso, tulad ng kumpletong pagkawasak ng ureter lumen. Ang pagsusuri ni Nechiporenko (pagpapasiya ng bilang ng mga leukocytes sa 1 ml ng ihi) ay nakakatulong upang mas obhetibong masuri ang antas ng leukocyturia sa nephrotuberculosis, at sa ilang mga kaso upang makita ito sa isang normal na pangkalahatang pagsusuri ng ihi. Gayunpaman, dapat itong isaalang-alang na ang leukocyturia ay maaaring mangyari sa talamak at talamak na pyelonephritis, cystitis, urethritis, bato sa bato at ureter.

Ang Erythrocyturia, tulad ng leukocyturia, ay itinuturing na isa sa mga pinakakaraniwang palatandaan ng laboratoryo ng genitourinary tuberculosis. Ang dalas ng hematuria ay depende sa pagkalat ng proseso; ito ay tumataas habang ang mapanirang tuberculous na proseso sa bato ay nabubuo. Ang Erythrocyturia na walang leukocyturia ay mas karaniwan para sa mga unang yugto ng renal tuberculosis. Ang hematuria, na nangingibabaw sa leukocyturia, ay isang mahalagang argumento na pabor sa renal tuberculosis kapag iniiba ito mula sa hindi tiyak na pyelonephritis.

[ 10 ], [ 11 ], [ 12 ], [ 13 ], [ 14 ], [ 15 ], [ 16 ]

Pagsusuri ng dugo ng biochemical

Sa tuberculosis, ang mga pagbabago sa ilang mga biochemical na indeks ay pangunahing nakasalalay sa yugto ng proseso, mga komplikasyon at iba't ibang magkakatulad na sakit. Sa mga pasyente na may hindi aktibong tuberculosis ng mga baga at iba pang mga organo, ang kabuuang mga bahagi ng protina at protina ng serum ng dugo ay hindi nagbabago at tinutukoy ang kanilang normal na nilalaman.

Sa talamak na anyo ng sakit, pati na rin sa paglala at pag-unlad ng mga talamak na anyo ng tuberculosis, bumababa ang koepisyent ng albumin-globulin.

Ang makabuluhang kahalagahan sa pagtatasa ng functional state at organic na pinsala sa atay sa tuberculosis at ang mga komplikasyon nito ay ang pagpapasiya ng direkta at kabuuang bilirubin, aspartate aminotransferase (AST), alanine aminotransferase (ALT) sa serum ng dugo. Dynamic na pagpapasiya ng antas ng aminotransferases. Ang bilirubin sa paggamot ng mga pasyente na may tuberculosis, lalo na sa mga malubhang anyo nito, ay isang obligadong bahagi ng biochemical na pagsusuri ng mga pasyente na may tuberculosis at isinasagawa buwan-buwan.

Ang pagsusuri sa functional na estado ng mga bato ay kinabibilangan ng pagpapasiya ng serum creatinine at pagkalkula ng glomerular filtration rate gamit ang Cockcroft-Gault formula. Ang pagkalkula ng glomerular filtration rate gamit ang Reberg test ay nagbibigay ng hindi gaanong tumpak na mga resulta.

Ang pangunahing layunin ng mga dinamikong biochemical na pag-aaral ng mga pasyente na may tuberculosis ay upang subaybayan ang kurso ng proseso, napapanahong pagtuklas ng mga side effect ng mga gamot at sapat na pagwawasto ng mga umuusbong na homeostasis disorder.

[ 17 ], [ 18 ], [ 19 ]

Application ng biochemical research method sa extrapulmonary tuberculosis

Ang pinaka-kaalaman na tagapagpahiwatig ay itinuturing na nilalaman ng tuberculostearic acid sa mga biological fluid, gayunpaman, ang pagpapasiya nito ay nauugnay sa mga teknikal na paghihirap (ang pangangailangan na gumamit ng gas chromatography at mass spectrometry).

Nangangako na sukatin ang aktibidad ng adenosine deaminase - isang enzyme na tinutukoy sa mga likido: synovial, pericardial, ascitic o cerebrospinal. Ang pangunahing gumagawa ng adenosine deaminase ay mga lymphocytes at monocytes. Ang pagpapasiya ng aktibidad ng adenosine deaminase sa mga biological fluid ay nagpapadali sa pagsusuri ng tuberculous synovitis, tuberculosis ng mga lymph node, tuberculous meningitis, tuberculous serositis.

Ang ilang mga biochemical indicator, dahil sa kanilang di-tiyak, ay tinutukoy lamang sa mga biological fluid na malapit sa lesyon. Ang antas ng mga tagapagpahiwatig ay sinusukat bilang tugon sa subcutaneous o intradermal na pangangasiwa ng tuberculin (karaniwan ay bago ang pangangasiwa at 48 at 72 na oras pagkatapos nito). Pagkatapos nito, ang antas ng pagtaas sa antas ng marker (sa %) ay kinakalkula na may kaugnayan sa paunang antas.

Pinakamainam, ang aktibidad ng organ-specific enzyme transamidinase ay tinutukoy sa ihi; ang hitsura nito ay nabanggit sa pinsala sa bato ng iba't ibang pinagmulan. Ang pag-aaral ng transamidinase ay makatwiran lamang sa mga kondisyon ng subcutaneous administration ng tuberculin upang palalain ang lokal na proseso ng pamamaga. Ang aktibidad ng transamidinase ay tinutukoy sa ihi sa simula at 24-72 oras pagkatapos ng pangangasiwa ng 50 TE tuberculin. Ang pagtaas ng fermenturia ng 2 beses o higit pa ay nagpapahintulot sa 82% ng mga kaso na makilala ang aktibong tuberculosis ng mga bato mula sa exacerbation ng talamak na pyelonephritis.

Sa kaso ng tuberculosis ng mga babaeng genital organ, ang mga konsentrasyon ng haptoglobin at malondialdehyde sa dugo ay tinutukoy sa ilalim ng mga kondisyon ng provocative tuberculin test. Ang tuberculin ay ibinibigay sa subcutaneously sa isang dosis na 50 TE at isang paulit-ulit na biochemical na pag-aaral ay isinasagawa pagkatapos ng 72 oras. Sa kaso ng tuberculous etiology, ang antas ng pagtaas sa antas ng haptoglobin ay hindi bababa sa 28%, at ang antas ng malondialdehyde ay 39% o higit pa. Ang pagpapasiya ng aktibidad ng adenosine deaminase sa peritoneal fluid na nakuha mula sa Douglas pouch ay ginagamit din. Ang pagbutas ay muling sinusuri 72 oras pagkatapos ng intradermal na pangangasiwa ng tuberculin sa mga dosis na 0.1 TE at 0.01 TE sa lugar ng projection ng mga panloob na genital organ sa anterior na dingding ng tiyan. Ang pagtaas sa aktibidad ng adenosine deaminase ng 10% o higit pa kumpara sa paunang halaga ay nagpapahiwatig ng isang tuberculous na proseso.

Sa kaso ng pinsala sa mata, ang focal reaction na nagaganap sa mata bilang tugon sa antigen stimulation ay sinusuri. Sa kasong ito, ang pagbuo ng isang malinaw na ipinahayag na tugon na sinamahan ng pagbawas sa mga visual na pag-andar ay hindi kanais-nais. Dahil ang pagtatasa ng mga minimal na focal reaction ay kadalasang mahirap, inirerekomenda na tumuon nang kahanay sa antas ng pagtaas ng haptoglobin o adenosine deaminase sa serum ng dugo upang matukoy ang konklusyon.

Ang lahat ng mga pag-aaral ng biochemical ay dapat isagawa kasama ng iba pang mga pamamaraan.

[ 20 ], [ 21 ], [ 22 ], [ 23 ]

Pag-aaral ng sistema ng coagulation ng dugo

Ang kaugnayan ng pag-aaral ng estado ng sistema ng coagulation ng dugo sa phthisiology ay dahil sa pagkakaroon ng hemoptysis o pulmonary hemorrhages sa isang bilang ng mga pasyente na may tuberculosis ng mga baga, pati na rin ang mga komplikasyon ng hemocoagulation sa surgical treatment ng tuberculosis. Bilang karagdagan, ang likas na kasamang nakatagong intravascular hemocoagulation ay nakakaapekto sa kurso ng sakit at ang pagiging epektibo ng chemotherapy.

Sa mga pasyente na may pulmonary tuberculosis na may isang nangingibabaw na bahagi ng exudative ng pamamaga, ang pagbawas sa aktibidad ng anticoagulant ng dugo ay sinusunod. Sa mga pasyente na may mababang pagkalat ng partikular na pinsala sa baga na may isang nangingibabaw na produktibong bahagi ng pamamaga, ang intravascular hemocoagulation ay ipinahayag nang hindi gaanong mahalaga. Sa mga pasyente na may pulmonary tuberculosis na may hemoptysis at pulmonary hemorrhages, ang estado ng sistema ng coagulation ng dugo ay naiiba: sa mga pasyente na may menor de edad na pagkawala ng dugo sa taas ng hemoptoea o kaagad pagkatapos ng pagtigil nito, ang isang matalim na pagtaas sa kapasidad ng coagulation ng dugo ay sinusunod dahil sa isang binibigkas na pagtindi ng mga proseso ng pagbuo ng thrombin habang pinapanatili ang pagtaas ng "structural" ng coagulation. Sa mga pasyente na may napakalaking pagkawala ng dugo, ang pagbawas sa potensyal ng coagulation ay sinusunod dahil sa pagbawas sa konsentrasyon ng fibrinogen, aktibidad ng factor XIII, at bilang ng platelet. Sa yugto ng paggamot sa kirurhiko sa mga pasyente na may limitadong mga anyo ng pulmonary tuberculosis, ang mga makabuluhang kaguluhan sa sistema ng homeostasis ay hindi nangyayari. Sa mga pasyente na may malawak na proseso, kapag nagsasagawa ng pneumonectomy o pleuropneumonectomy, ang DIC syndrome ay madalas na bubuo, na maaaring tumagal ng anyo ng isang "pangalawang sakit".

Upang masubaybayan ang estado ng sistema ng coagulation ng dugo sa mga pasyente na may pulmonary tuberculosis, kinakailangan upang matukoy ang activated partial thromboplastin time (APTT), fibrinogen, thrombin time, prothrombin index, pati na rin ang oras ng pagdurugo at oras ng pamumuo ng dugo.

[ 24 ], [ 25 ], [ 26 ], [ 27 ], [ 28 ]

Pag-aaral sa hormonal

Ang mga modernong eksperimental at klinikal na obserbasyon ay nagpapahiwatig ng pagkakaroon ng mga pagbabago sa hormonal status sa tiyak na tuberculous na pamamaga ng mga baga. Napatunayan na ang pagwawasto ng dysfunction ng pituitary-adrenal, pituitary-thyroid system at pancreatic function kasama ng anti-tuberculosis therapy ay nag-aambag sa pag-activate ng fibrogenesis at mga proseso ng reparasyon sa pokus ng partikular na pamamaga.

Ang functional na estado ng pituitary-thyroid system ay hinuhusgahan ng nilalaman ng triiodothyronine (T3), thyroxine (T4), at pituitary thyroid-stimulating hormone (TSH) sa serum ng dugo _. Ito _ay itinatag na ang subclinical hypothyroidism ay nakita sa 38-45% ng mga pasyente na may pulmonary tuberculosis, at ito ay madalas na nasuri sa disseminated at fibrous-cavernous forms ng proseso. Sa mga form na ito, ang mga antas ng parehong T3 at T4 ay pinakamabilis na nababawasan _, at _ang kawalan ng balanse ng mga hormone na ito ay nangyayari sa anyo ng pagtaas sa _{ratio ng T4/} T3.

Ang pag-andar ng adrenal cortex ay tinasa ng antas ng serum cortisol, at ang endocrine function ng pancreas ay tinasa ng konsentrasyon ng immunoreactive insulin. Sa talamak na yugto ng isang nakakahawang sakit, ang pangangailangan para sa endogenous cortisol at pagtaas ng insulin. Ang hyperinsulinemia ay nagpapahiwatig din ng insulin resistance ng mga tisyu ng katawan, na karaniwan para sa anumang aktibong proseso ng pamamaga, lalo na sa isang partikular na proseso. Ang pagpapasiya ng glucocorticoid function ng adrenal glands sa aktibong pulmonary tuberculosis ay nagpapahintulot sa amin na makita ang pagkakaroon ng hypercorticism sa karamihan ng mga pasyente. Ang mga normal na konsentrasyon ng cortisol sa dugo sa isang pasyente na may nakakahawang pamamaga sa talamak na panahon ay dapat ituring bilang isang kamag-anak na kakulangan ng pag-andar ng glucocorticoid ng adrenal cortex, na maaaring magsilbing batayan para sa kapalit na therapy na may sapat na dosis ng glucocorticoids.

Halos isang katlo ng mga pasyente na may pulmonary tuberculosis ay may mababang antas ng insulinemia na lumalapit sa mas mababang limitasyon ng pamantayan, habang 13-20% ay may makabuluhang hyperinsulinism. Ang parehong kamag-anak na hypo- at hyperinsulinism ay mataas na panganib na mga kadahilanan para sa pagbuo ng mga karamdaman sa metabolismo ng carbohydrate na may iba't ibang kalubhaan. Ang mga pagbabagong ito sa functional na aktibidad ng pancreatic B-cells ay nangangailangan ng regular na pagsubaybay sa glycemia sa mga pasyenteng may tuberculosis at napapanahong pag-iwas sa diabetes mellitus. Bilang karagdagan, ito ay nagsisilbing isang karagdagang katwiran para sa pagiging angkop ng paggamit ng physiological na dosis ng insulin sa kumplikadong therapy ng tuberculosis.

Sa pangkalahatan, ang pagbaba sa mga antas ng thyroid hormone, ang kanilang kawalan ng timbang, hypercortisolemia at hyperinsulinism ay pinaka-binibigkas sa mga pasyente na may malubhang kurso ng proseso ng tuberculosis, na may malawak na mga sugat sa baga at binibigkas na mga sintomas ng pagkalasing sa tuberculosis.

Microbiological diagnostics ng tuberculosis

Ang mga microbiological na pag-aaral ay kinakailangan para sa pagtukoy ng mga pasyente na may tuberculosis, pag-verify ng diagnosis, pagsubaybay at pagwawasto ng chemotherapy, pagtatasa ng mga resulta ng paggamot, sa madaling salita, mula sa sandaling ang isang pasyente na may tuberculosis ay nakarehistro hanggang sa siya ay tinanggal mula sa rehistro.

Ang lahat ng mga programa at proyekto ng epidemiological ay batay sa pagtatasa ng bilang ng mga excretor ng bakterya, na imposibleng gawin nang walang paggamit ng mga pamamaraan ng laboratoryo para sa pagtuklas ng tuberculosis mycobacteria. Kapag sinusuri ang apela ng tinatawag na hindi organisadong populasyon, ang porsyento ng mga bacteria excretors ay umabot sa 70 o higit pa, na ginagawang medyo epektibong paraan ang mga pamamaraan ng laboratoryo upang makilala ang mga pasyente ng tuberculosis sa pangkat ng populasyon na ito.

Ang mga tradisyonal na microbiological na pamamaraan ng pag-diagnose ng tuberculosis ay bacterioscopic at kultural na pag-aaral. Kasama sa mga modernong pamamaraan ang pag-culture ng tuberculosis mycobacteria sa mga automated system at PCR. Gayunpaman, ang lahat ng mga pamamaraan na ito ay kinakailangang pinagsama sa mga klasikal na pamamaraan ng bacteriological.

Koleksyon ng diagnostic na materyal

Ang pagiging epektibo ng mga pagsubok sa laboratoryo ay higit sa lahat ay nakasalalay sa kalidad ng diagnostic na materyal. Ang pagsunod sa mga patakaran para sa pagkolekta, pag-iimbak at pagdadala ng diagnostic na materyal at ang tumpak na pagpapatupad ng algorithm ng pagsusuri ng pasyente ay direktang nakakaapekto sa resulta at tinitiyak ang kaligtasan ng biyolohikal.

Iba't ibang materyales ang ginagamit upang masuri ang tuberkulosis. Dahil ang pulmonary tuberculosis ay ang pinakakaraniwang anyo ng tuberculous infection, ang pangunahing materyal para sa pagsusuri ay itinuturing na plema at iba pang uri ng tracheobronchial tree discharge: upper respiratory tract discharge na nakuha pagkatapos ng aerosol inhalations: bronchial lavage waters; bronchoalveolar lavages; materyal na nakuha sa panahon ng bronchoscopy, transtracheal at intrapulmonary biopsy: bronchial aspirate, laryngeal smears, exudates, wound smears, atbp.

Ang pagiging epektibo ng pananaliksik ay tumataas kung ang kinokontrol na koleksyon ng materyal mula sa pasyente ay isinasagawa. Para sa layuning ito, ang isang espesyal na kagamitan na silid ay inilalaan o mga espesyal na booth ay binili. Ang pagkolekta ng materyal ay isang mapanganib na pamamaraan, samakatuwid, ang materyal para sa pananaliksik ay dapat kolektahin bilang pagsunod sa mga panuntunan sa kaligtasan ng impeksyon.

Ang materyal para sa pagsusuri para sa Mycobacterium tuberculosis ay kinokolekta sa mga sterile vial na may mahigpit na screwed caps upang maiwasan ang kontaminasyon ng kapaligiran at protektahan ang nakolektang materyal mula sa kontaminasyon.

Ang mga vial para sa pagkolekta ng diagnostic na materyal ay dapat matugunan ang mga sumusunod na kinakailangan:

• dapat na gawa sa materyal na lumalaban sa epekto;
• dapat madaling matunaw kapag na-autoclave;
• magkaroon ng sapat na dami (40-50 ml):
• magkaroon ng malawak na pagbubukas para sa pagkolekta ng plema (diameter na hindi kukulangin sa 30 mm);
• maging madaling hawakan, transparent o translucent, upang masuri ang dami at kalidad ng nakolektang sample nang hindi binubuksan ang takip.

Upang makakuha ng pinakamainam na resulta ng pananaliksik, ang mga sumusunod na kondisyon ay dapat matugunan:

• ang koleksyon ng materyal ay dapat isagawa bago magsimula ang chemotherapy;
• ang materyal para sa pag-aaral ay dapat kolektahin bago kumain o uminom ng mga gamot sa umaga;
• Para sa pag-aaral, ipinapayong mangolekta ng hindi bababa sa 3 mga sample ng plema sa umaga. Kinokolekta ang plema sa loob ng 3 magkakasunod na araw;
• Ang nakolektang materyal ay dapat maihatid sa laboratoryo sa lalong madaling panahon:
• sa mga kaso kung saan imposibleng maihatid kaagad ang materyal sa laboratoryo, ito ay nakaimbak sa refrigerator sa temperatura ng hangin na 4 °C nang hindi hihigit sa 48 oras;
• Kapag nagdadala ng materyal, kinakailangang bigyang-pansin ang integridad ng mga bote.

Ang wastong nakolektang plema ay may mauhog o mucopurulent na karakter. Ang pinakamainam na dami ng napagmasdan na bahagi ng plema ay 3-5 ml.

Kinokolekta ang plema sa ilalim ng pangangasiwa ng isang health worker. Ang mga taong responsable sa pagkolekta ng plema ay dapat tiyakin na ang ilang mga patakaran ay sinusunod:

• Kinakailangan na ipaliwanag sa pasyente ang layunin ng pagsusuri at ang pangangailangan na umubo hindi laway o nasopharyngeal mucus, ngunit ang mga nilalaman ng malalim na mga seksyon ng respiratory tract. Ito ay maaaring makamit bilang resulta ng isang produktibong ubo na nangyayari pagkatapos ng ilang (2-3) malalim na paghinga. Kinakailangan din na bigyan ng babala ang pasyente na kailangan muna niyang banlawan ang kanyang bibig ng pinakuluang tubig upang alisin ang pangunahing bahagi ng microflora na namumulaklak sa oral cavity at mga labi ng pagkain na nagpapalubha sa pagsusuri ng plema;
• Ang manggagawang medikal na kasangkot sa pagkolekta ng plema, bilang karagdagan sa isang gown at cap, ay dapat magsuot ng maskara, guwantes na goma at isang goma na apron;
• habang nakatayo sa likod ng pasyente, pinapayuhan siyang hawakan ang bote nang malapit sa kanyang mga labi hangga't maaari at agad na ihiwalay ang plema dito habang inuubo niya ito, habang kinakailangan upang matiyak na ang daloy ng hangin ay nakadirekta palayo sa manggagawang pangkalusugan:
• Kapag kumpleto na ang koleksyon ng plema, dapat na maingat na isara ng health worker ang bote na may takip at tasahin ang dami at kalidad ng nakolektang plema. Ang bote ay pagkatapos ay may label at inilagay sa isang espesyal na kahon para sa transportasyon sa laboratoryo.

Kung ang pasyente ay hindi gumagawa ng plema, pagkatapos ay sa gabi bago at maaga sa umaga sa araw ng pagkolekta ng materyal, dapat siyang bigyan ng expectorant: katas ng mga ugat ng marshmallow (mucaltin), bromhexine, ambroxol, atbp - o isang nakakainis na paglanghap ay dapat gamitin, gamit ang mga kagamitan na naka-install sa silid para sa pagkolekta ng plema. Ang materyal na nakolekta sa ganitong paraan ay hindi napapailalim sa pangangalaga at dapat suriin sa araw ng koleksyon. Upang maiwasan ang "pagtanggi" nito sa laboratoryo, isang espesyal na tala ang dapat gawin sa referral.

Kung ang mga microbiological na pag-aaral ay hindi isinagawa sa isang partikular na institusyon, ang nakolektang diagnostic na materyal ay dapat na maihatid sa laboratoryo sa gitna, sa kondisyon na ang materyal ay itinatago sa refrigerator o may mga preservative sa pagitan ng mga paghahatid. Ang materyal ay inihahatid sa laboratoryo sa mga kahon ng transportasyon na madaling madidisimpekta. Ang bawat sample ay dapat bigyan ng naaangkop na label, at ang buong batch ay dapat may kumpletong kasamang form.

[ 29 ], [ 30 ], [ 31 ]

Mga mode at dalas ng pagsusuri ng mga pasyente

Sa panahon ng paunang, tinatawag na diagnostic, pagsusuri ng isang pasyente para sa tuberculosis, kinakailangang suriin ang hindi bababa sa 3 bahagi ng plema na nakolekta sa ilalim ng pangangasiwa ng mga tauhan ng medikal sa loob ng 2 o 3 araw, na nagpapataas ng pagiging epektibo ng mikroskopya.

Ang pangunahing pagsusuri para sa tuberculosis ay dapat isagawa ng lahat ng institusyong medikal at diagnostic ng sistema ng pangangalagang pangkalusugan. Kamakailan lamang, upang madagdagan ang pagiging epektibo ng pangunahing pagsusuri, ang mga tinatawag na microscopy centers ay inayos batay sa mga klinikal na diagnostic laboratories, na nilagyan ng mga modernong mikroskopyo at kagamitan upang matiyak ang kaligtasan ng epidemya.

Gumagamit ang mga institusyong anti-tuberculosis ng survey scheme na nagbibigay ng hindi bababa sa 3 beses na pagsusuri ng plema o iba pang diagnostic na materyal sa loob ng 3 araw. Sa panahon ng paggamot, ang mga microbiological na pag-aaral ay regular na isinasagawa nang hindi bababa sa isang beses sa isang buwan sa masinsinang yugto ng chemotherapy. Kapag lumipat sa follow-up na yugto, ang mga pag-aaral ay isinasagawa nang hindi gaanong madalas - sa pagitan ng 2-3 buwan, habang ang dalas ng pag-aaral ay nabawasan sa dalawa.

Mga tampok ng pagkolekta ng diagnostic na materyal para sa extrapulmonary tuberculosis

Ang isang tampok ng pathological na materyal sa extrapulmonary na mga anyo ng tuberculosis ay ang mababang konsentrasyon ng mycobacteria tuberculosis sa loob nito, na nangangailangan ng mas sensitibong pamamaraan ng microbiological na pananaliksik, pangunahin ang mga pamamaraan ng paghahasik sa isang nutrient medium.

Sa kaso ng genitourinary tuberculosis, ang ihi ay ang pinaka-naa-access na materyal para sa pagsusuri. Ang pagkolekta ng ihi ay dapat gawin ng isang espesyal na sinanay na nars.

Ang mga panlabas na ari ay hugasan ng tubig at sabon o isang mahinang solusyon ng potassium permanganate. Ang panlabas na pagbubukas ng yuritra ay maingat na ginagamot. Ang gitnang bahagi ng ihi sa umaga ay kinokolekta sa isang sterile na bote: sa mga lalaki - natural, sa mga babae - gamit ang isang catheter. Ang ihi mula sa renal pelvis ay kinokolekta sa sterile test tubes sa panahon ng catheterization ng isa o dalawang bato, sa huling kaso - kinakailangang hiwalay sa bawat bato. Ang isang maliit na halaga ng ihi na ito ay sentripuged, ang sediment ay sinusuri.

Sa mga lalaki, ang sperm, testicular punctures, at prostate secretions ay ini-centrifuge para makakuha ng sediment. Sa anumang lokalisasyon ng isang tiyak na proseso sa genital area sa mga lalaki, ang prostate massage ay maaaring magsulong ng pagpapalabas ng mga pagtatago na naglalaman ng tuberculosis mycobacteria.

Kinokolekta ang dugo ng panregla mula sa mga kababaihan sa pamamagitan ng pagsipsip o paggamit ng takip ng Kafka. Ang resultang materyal ay napalaya mula sa mga erythrocytes sa pamamagitan ng paghuhugas nito ng distilled water at pagkatapos ay centrifuging. Sinusuri ang sediment.

Ang paglabas mula sa cervical canal ng matris ay nakolekta sa ilang lalagyan o Kafka cap, iyon ay, ito ay kanais-nais na makaipon ng 1-2 ML ng pathological na materyal.

Ang materyal na nakuha sa panahon ng mga surgical intervention sa mga bato, maselang bahagi ng katawan, biopsy, endometrial scrapings, ay homogenized. Upang gawin ito, inilalagay ito sa isang sterile mortar at lubusan na durog na may sterile na gunting. Ang sterile na buhangin ng ilog ay idinagdag sa nagresultang suspensyon sa isang halaga na katumbas ng masa nito, pagkatapos ay idinagdag ang 0.5-1.0 ml ng isotonic sodium chloride solution at ang lahat ay giling hanggang sa mabuo ang isang mushy mass kasama ang pagdaragdag ng isotonic sodium chloride solution (4-5 ml). Pagkatapos ang masa ay pinapayagan na manirahan sa loob ng 1-1.5 minuto, ang supernatant ay sinusuri.

Tuberculosis ng mga buto at kasukasuan. Ang pagbutas (pus mula sa mga abscesses) na nakuha gamit ang isang sterile syringe ay inilalagay sa isang sterile na lalagyan at agad na inihatid sa laboratoryo. Gamit ang isang sterile pipette, na dating moistened sa sterile isotonic sodium chloride solution, 2-5 ml ng nana ay kinuha, inilipat sa isang bote na may mga kuwintas at isa pang 2-3 ml ng isotonic sodium chloride solution ay idinagdag. Ang bote ay sarado na may takip at inalog sa isang shaker sa loob ng 8-10 minuto. Ang homogenized na suspensyon ay sinusuri.

Sa fistulous forms ng osteoarticular tuberculosis, ang nana ay kinuha mula sa fistula. Ang masaganang discharge ay direktang kinokolekta sa isang test tube. Sa mga kaso ng kakaunting pus discharge, ang fistula tract ay hinuhugasan ng sterile isotonic sodium chloride solution, at ang mga paghuhugas na nakolekta sa isang test tube o isang piraso ng tampon na ibinabad sa nana ay ipinadala para sa pagsusuri.

Ang surgical material na nakuha sa panahon ng surgical intervention sa mga buto at joints ay maaaring binubuo ng purulent-necrotic na masa, granulations, scar tissue, bone tissue, synovial membrane tissue at iba pang substrate. Ang pagproseso nito ay isinasagawa tulad ng sa kaso ng renal tuberculosis.

Ang microbiological na pagsusuri ng synovial fluid sa isang 3% sodium citrate solution (sa ratio na 1:1) upang maiwasan ang clotting ay isinasagawa kaagad pagkatapos ng pagbutas.

Tuberculosis ng mga lymph node. Ang nana na nakuha sa panahon ng pagbutas ng mga lymph node ay sinusuri sa parehong paraan tulad ng nana mula sa mga abscesses. Ang tissue ng lymph node na nakuha sa panahon ng mga surgical intervention at biopsy ay sinusuri tulad ng sa iba pang anyo ng tuberculosis.

Ang pag-aaral ng mga feces para sa Mycobacterium tuberculosis ay napakabihirang ginagawa dahil sa halos kumpletong kawalan ng mga positibong resulta.

[ 32 ], [ 33 ], [ 34 ], [ 35 ], [ 36 ]

Microscopy ng mycobacteria

Ang sputum microscopy ay medyo mabilis, simple at murang paraan na dapat gamitin sa lahat ng kaso kung saan pinaghihinalaan ang tuberculosis. Bilang karagdagan, ang pag-aaral na ito ay isinasagawa upang masuri ang pagiging epektibo ng chemotherapy at upang kumpirmahin ang pagbawi o pagkabigo sa paggamot sa kawalan ng mga resulta ng kultura.

Dalawang paraan ng mikroskopikong pagsusuri ang ginagamit:

• direktang paraan ng mikroskopya, kapag ang isang smear ay inihanda nang direkta mula sa diagnostic na materyal;
• isang paraan ng microscopy ng sediment na inihanda mula sa materyal na ginagamot sa mga decontaminants para sa kultural na pananaliksik.

Ang unang paraan ay ginagamit sa mga laboratoryo kung saan ang mga mikroskopikong pag-aaral lamang ang isinasagawa (mga klinikal na diagnostic na laboratoryo ng pangkalahatang medikal na network).

Ang pinakamahusay na mga resulta ng mikroskopikong pagsusuri ay nakuha sa pamamagitan ng pag-concentrate sa diagnostic na materyal (halimbawa, sa pamamagitan ng centrifugation).

Upang matukoy ang Mycobacterium tuberculosis na may 50% na posibilidad sa pamamagitan ng microscopy, ang 1 ml ng plema ay dapat maglaman ng higit sa 5,000 microbial cells. Ang plema mula sa mga pasyente na may pulmonary forms ng tuberculosis ay kadalasang naglalaman ng malaking bilang ng acid-fast bacteria, na nagpapahintulot sa kanila na mapagkakatiwalaan na matukoy ng bacterioscopy. Ang diagnostic sensitivity ng pamamaraang ito ay maaaring tumaas sa pamamagitan ng pagsusuri sa ilang mga sample ng plema mula sa isang pasyente. Ang isang negatibong resulta ng pagsusuri sa bacterioscopic ay hindi ibinubukod ang diagnosis ng tuberculosis, dahil ang plema ng ilang mga pasyente ay naglalaman ng mas kaunting Mycobacterium kaysa sa maaaring makita ng microscopy. Ang hindi magandang paghahanda ng sputum smears ay maaari ding maging sanhi ng negatibong resulta ng bacterioscopic examination.

Ang pinakakaraniwang paraan para sa pag-detect ng acid-fast mycobacteria sa isang smear ay Ziehl-Neelsen staining. Ang pamamaraan ay batay sa pagtagos ng carbol fuchsin sa isang microbial cell sa pamamagitan ng isang lamad na may kasamang wax-lipid layer, na may sabay-sabay na epekto ng pag-init at ang malakas na pagkilos ng etching ng phenol. Ang kasunod na decolorization ng smear na may 25% solution ng sulfuric acid o 3% hydrochloric alcohol ay humahantong sa decolorization ng lahat ng non-acid-fast structures. Ang mga decolorized na elemento ng smear ay nabahiran ng 0.3% na solusyon ng methylene blue. Ang Mycobacteria ay hindi nakikita ang maginoo na aniline dyes, bilang isang resulta kung saan ang acid-fast mycobacteria ay nabahiran ng raspberry-red, at ang iba pang mga microbes at cellular na elemento ay nabahiran ng asul.

Upang suriin ang mga smear na nabahiran ayon kay Ziehl-Neelsen, gumamit ng isang light binocular microscope na may layunin ng immersion (90- o 100-fold magnification) at isang eyepiece na may 7- o 10-fold magnification. 100 field of view ang sinusuri, na sapat upang makita ang solong mycobacteria sa smear. Kung negatibo ang resulta ng naturang pagsusuri, inirerekomendang suriin ang isa pang 200 field of view para sa kumpirmasyon. Ang mga resulta ay naitala, na nagpapahiwatig ng bilang ng acid-fast mycobacteria (AFB) na nakita.

Bilang karagdagan sa pamamaraang ito, ginagamit ang fluorochrome staining para sa luminescent microscopy, na nagbibigay-daan sa pagkamit ng pinakamahusay na mga resulta. Ang paggamit ng pamamaraang ito ay nagdaragdag ng kahusayan ng mikroskopya ng 10-15%. Kapag ang mycobacteria ay ginagamot ng mga luminescent dyes (auramine, rhodamine, atbp.), ang mga sangkap na ito ay nagbubuklod din sa mga istrukturang tulad ng wax ng microbial cell. Kapag ang mga stained cell ay na-irradiated ng isang kapana-panabik na pinagmumulan ng liwanag (isang tiyak na spectrum ng ultraviolet radiation), nagsisimula silang kumikinang na orange o maliwanag na pula laban sa isang itim o madilim na berdeng background. Dahil sa mataas na liwanag at kaibahan ng nakikitang imahe, ang pangkalahatang pag-magnify ng mikroskopyo ay maaaring bawasan ng 4-10 beses, na nagpapalawak ng larangan ng pagtingin at binabawasan ang oras ng pagtingin sa paghahanda. Kasabay nito, dahil sa mas malawak na lalim ng larangan, ang ginhawa ng pag-aaral ay maaaring tumaas.

Kapag gumagamit ng fluorescence microscopy, ang pagtingin sa parehong bahagi ng isang smear ay tumatagal ng mas kaunting oras kaysa sa light microscopy ng mga smear na nabahiran ayon kay Ziehl-Neelsen. Kung ang isang microscopist ay tumitingin ng humigit-kumulang 20-25 tulad ng mga smear sa isang araw ng trabaho, pagkatapos ay sa tulong ng fluorescence microscopy maaari niyang suriin ang higit sa 60-80 mga sample sa parehong oras. Alam ng mga bihasang microscopist na ang paglamlam ng mga cell na may pinaghalong auramine at rhodamine ay tiyak para sa acid-fast mycobacteria, na sa kasong ito ay may hitsura ng mga gintong rod. Ang mga saprophyte ay nabahiran ng berde.

Ang isa pang mahalagang bentahe ng pamamaraan ng fluorescence microscopy ay ang kakayahang makita ang binagong mycobacteria na nawala ang kanilang mga katangian na lumalaban sa acid sa ilalim ng impluwensya ng isang bilang ng mga hindi kanais-nais na mga kadahilanan, sa partikular na intensive chemotherapy, at samakatuwid ay hindi napansin ng Ziehl-Neelsen staining.

Ang mga disadvantages ng fluorescence microscopy method ay kinabibilangan ng medyo mataas na halaga ng mikroskopyo at ang operasyon nito. Gayunpaman, sa mga sentralisado o iba pang malalaking laboratoryo, kung saan ang workload ay lumampas sa pamantayan ng tatlong mga technician ng laboratoryo na nagtatrabaho sa tatlong maginoo na mikroskopyo, mas murang gumamit ng isang fluorescence microscope sa halip.

Ang mga pamamaraang bacterioscopic ay may medyo mataas na pagtitiyak (89-100%). Humigit-kumulang 97% ng mga positibong resulta na nakuha ng anumang paraan ng mikroskopya ay malinaw na nakumpirma ng mga resulta ng paghahasik.

Dapat pansinin na ang mikroskopikong pagsusuri ng isang smear ng pathological na materyal ay hindi nagpapahintulot sa isa na matukoy ang mga species ng nakitang acid-resistant mycobacteria. Ang mikroskopikong pamamaraan ay nagpapahintulot sa isa na gumuhit lamang ng isang konklusyon tungkol sa pagkakaroon o kawalan ng acid-resistant microorganisms sa paghahanda, na kung saan ay ipinaliwanag sa pamamagitan ng pagkakaroon sa likas na katangian ng isang malaking bilang ng mga non-tuberculous acid-resistant microorganisms morphologically katulad ng mycobacteria ng tuberculosis complex.

Ang pagsusuri ng mga resulta ng microscopy ay isinasagawa sa mga semi-quantitative unit.

Upang maihambing ang mga resulta ng iba't ibang pamamaraan ng mikroskopya, ipinakilala ang mga empirical coefficient. Halimbawa, upang ihambing ang mga resulta ng isang smear na nabahiran ng mga fluorescent dyes na may data ng isang light microscopy study (1000-fold magnification), kinakailangan na hatiin ang bilang ng acid-fast mycobacteria na nakita gamit ang isang fluorescent microscope ng kaukulang coefficient: sa 250-fold na pag-magnify ng mikroskopyo - sa 450-fold - sa pamamagitan ng 450-fold. 630-fold - ng 2.

Mga tampok ng microscopy sa extrapulmonary tuberculosis

Ang direktang microscopy ay isinasagawa, pati na rin ang mikroskopya ng mga pahid na inihanda pagkatapos ng pagpapayaman na may kasunod na paglamlam ayon sa Ziehl-Neelsen o mga fluorescent dyes. Ang direktang microscopy ng smears ay hindi epektibo dahil sa mababang konsentrasyon ng mycobacteria sa materyal, at samakatuwid ay mas makatwiran na gumamit ng mga pamamaraan ng pagpapayaman. Ang centrifugation ay ang pinaka-epektibo. Kung ang biological na materyal ay malapot, ang centrifugation na may sabay-sabay na homogenization at liquefaction ng materyal ay ginagamit, na isinasagawa gamit ang high-speed centrifuges na may centrifugation force na 3000 g at hypochlorite solution. Ang iba pang mga paraan ng pagpapayaman, tulad ng microflotation, ay kasalukuyang hindi ginagamit dahil sa pagbuo ng mga biologically hazardous aerosol.

[ 37 ]

Pamamaraan ng kultura para sa pag-diagnose ng tuberculosis

Ang pamamaraan ng seeding, o pamamaraan ng kultura, ay mas sensitibo kaysa sa smear microscopy at may ilang mga pakinabang kaysa sa huli. Pinapayagan nito ang pag-detect ng ilang dosenang mabubuhay na mycobacteria sa materyal na sinusuri at may mataas na halaga ng diagnostic. Ito ay lalong mahalaga kapag sinusuri ang materyal mula sa mga bagong diagnosed o ginagamot na mga pasyente na naglalabas ng maliit na bilang ng mycobacteria.

Kung ikukumpara sa mikroskopya, pinahihintulutan ng pananaliksik sa kultura na madagdagan ang bilang ng mga nakitang pasyente ng tuberculosis ng higit sa 15-25%, gayundin ang pag-verify ng tuberculosis sa mga naunang yugto, kapag ang sakit ay madali pa ring gamutin. Ang isang napakahalagang bentahe ng pananaliksik sa kultura ay itinuturing na ang posibilidad ng pagkuha ng isang pathogen culture, na maaaring makilala at pag-aralan na may kaugnayan sa pagiging sensitibo sa droga, virulence at iba pang mga biological na katangian.

Ang mga disadvantages ng mga pamamaraan ng paglilinang ay kinabibilangan ng kanilang tagal (ang panahon ng paghihintay para sa mga materyales ay umabot sa 10 linggo), mas mataas na gastos, at ang pagiging kumplikado ng pagproseso ng diagnostic na materyal.

Mga prinsipyo ng paggamot bago ang paghahasik ng diagnostic na materyal

Ang mga tradisyonal na microbiological na pamamaraan ay hindi maaaring gamitin upang magsagawa ng mga pagsusuri sa tuberculosis. Ito ay dahil sa katotohanan na ang tuberculosis mycobacteria ay napakabagal na lumalaki, at karamihan sa mga klinikal na sample ay naglalaman ng mabilis na lumalagong pyogenic at putrefactive na microorganism at fungi. Ang kanilang mabilis na paglaki sa masaganang nutrient media ay nakakasagabal sa pagbuo ng mycobacteria at hindi pinapayagan ang tuberculosis pathogen na ihiwalay, kaya ang diagnostic na materyal ay dapat na pre-treat bago magtanim. Bilang karagdagan, ang mycobacteria na inilabas mula sa respiratory tract ng pasyente ay kadalasang napapalibutan ng malaking halaga ng mucus, na nagpapahirap sa pag-concentrate sa kanila. Kaugnay nito, bago maghasik ng plema at iba pang katulad na mga materyales, dapat silang tunawin at decontaminated.

Ang lahat ng mga detergent at decontaminant ay may mas marami o hindi gaanong binibigkas na nakakalason na epekto sa mycobacteria. Bilang resulta ng paggamot, hanggang 90% ng mycobacteria ang maaaring mamatay. Upang mapanatili ang isang sapat na bahagi ng populasyon ng mycobacterial, kinakailangan na gumamit ng banayad na mga pamamaraan ng paggamot na nagpapahintulot, sa isang banda, upang sugpuin ang mabilis na lumalagong mga pyogenic at putrefactive na microorganism, at sa kabilang banda, upang mapanatili ang maximum na posibilidad ng mycobacteria na nasa materyal.

Depende sa materyal, ang homogeneity at antas ng kontaminasyon nito, ang iba't ibang mga decontaminant ay ginagamit para sa pre-seeding treatment: para sa plema - 4% sodium hydroxide solution, 10% trisodium phosphate solutions, benzalkonium chloride trisodium phosphate, NALC-NaOH (N-acetyl-L-cysteine-sodium hydroxide) na may konsentrasyon ng ihi ng 1% na pangwakas na likido. sulfuric acid solution, para sa mga kontaminadong sample, fat-containing materials - oxalic acid solution hanggang 5%. Bilang karagdagan, sa ilang mga kaso, ginagamit ang mga enzyme at surfactant (detergents). Ang paggamit ng Tween at ilang iba pang mga detergent ay sinamahan ng mas mababang pagkamatay ng mga mycobacterial cells (40-50% ang nabubuhay). Gayunpaman, maaari lamang silang gamitin para sa mga likidong materyales. Ang NALC-NaOH, na ginawa sa mga kit, ay ang pinakamalawak na ginagamit sa mundo. Ang pamamaraang ito ay nagbibigay-daan upang ihiwalay ang higit sa 85% ng populasyon ng mycobacterial cell. Ang decontamination ng mga solidong materyales na naglalaman ng tissue ay mas mahirap, dahil mahirap hulaan ang antas ng pagpapakalat ng materyal sa panahon ng homogenization. Halimbawa, ang pagpoproseso ng mga lymph node biopsy ay kadalasang sinasamahan ng pagtaas ng dalas ng kontaminasyon sa mga dayuhang flora. Sa kasong ito, maaaring gamitin ang 1% etonium.

Ang hindi homogenous na materyal ay homogenized gamit ang glass beads sa pagkakaroon ng mga decontaminants. Ang mga likidong materyales ay pre-centrifuge at ang sediment lamang ang pinoproseso.

Teknik ng paghahasik at pagpapapisa ng itlog

Pagkatapos ng paunang pagproseso, ang materyal ay na-centrifuged, na nag-uudyok sa mycobacteria at nagpapataas ng kanilang nilalaman sa sediment ("sediment enrichment"). Ang resultang sediment ay neutralisado at inoculated sa ibabaw ng siksik na nutrient media o mga test tube na may likido (semi-liquid) na media. Ang mga pahid para sa mikroskopikong pagsusuri ay inihanda mula sa natitirang sediment. Ang pamamaraan ng seeding ay dapat maiwasan ang cross-contamination ng diagnostic na materyal.

Para sa maaasahang klinikal na interpretasyon ng mga resulta ng microbiological na pananaliksik, ang sumusunod na panuntunan ay dapat sundin: ang mikroskopiko at kultural na pag-aaral ay dapat isagawa nang magkatulad mula sa parehong sample ng diagnostic na materyal.

Ang mga inoculated tubes ay inilalagay sa isang thermostat sa 37 ^o C sa loob ng 2 araw sa isang pahalang na posisyon. Tinitiyak nito ang isang mas pare-parehong pagsipsip ng materyal sa nutrient medium. Pagkatapos ng 2 araw, ang mga tubo ay inilipat sa isang patayong posisyon at hermetically sealed na may goma o silicone stoppers upang maiwasan ang seeded media mula sa pagkatuyo.

Ang mga pananim ay pinananatili sa isang thermostat sa 37 ^° C sa loob ng 10-12 linggo na may regular na lingguhang inspeksyon. Ang mga sumusunod na parameter ay naitala sa bawat inspeksyon ng kontrol:

• panahon ng nakikitang paglaki mula sa araw ng paghahasik;
• rate ng paglago (bilang ng CFU);
• kontaminasyon ng kultura na may mga dayuhang microbial flora o fungi (ang mga naturang test tube ay inalis);
• walang nakikitang paglaki. Ang mga tubo ay naiwan sa termostat hanggang sa susunod na inspeksyon.

Nutrient media

Ang iba't ibang nutrient media ay ginagamit upang linangin ang mycobacteria: solid, semi-liquid, likido. Gayunpaman, wala sa kilalang nutrient media ang may mga katangian na nagsisiguro sa paglaki ng lahat ng mycobacterial cells. Sa pagsasaalang-alang na ito, upang mapabuti ang kahusayan, inirerekumenda na gumamit ng 2-3 nutrient media ng iba't ibang mga komposisyon nang sabay-sabay.

Bilang isang karaniwang daluyan para sa pangunahing paghihiwalay ng tuberculosis pathogen at pagpapasiya ng pagiging sensitibo nito sa gamot, inirerekomenda ng WHO ang Lowenstein-Jensen medium. Ito ay isang siksik na medium ng itlog kung saan ang paglaki ng mycobacteria ay nakukuha sa ika-20-25 araw pagkatapos ng paghahasik ng bacterioscopically positive na materyal. Ang paghahasik ng bacterioscopically negative material ay nangangailangan ng mas mahabang panahon ng incubation (hanggang 10-12 na linggo).

Sa ating bansa, ang Finn-II egg medium na iminungkahi ni ER Finn ay naging laganap. Naiiba ito sa halip na L-asparagine, gumagamit ito ng sodium glutamate, na nagpapalitaw ng iba pang mga daanan para sa synthesis ng mga amino acid sa mycobacteria. Lumalabas ang paglago sa medium na ito nang medyo mas maaga, at ang dalas ng paghihiwalay ng mycobacteria ay 6-8% na mas mataas kaysa sa Lowenstein-Jensen medium.

Upang mapataas ang kahusayan ng bacteriological diagnostics ng extrapulmonary tuberculosis, ipinapayong isama ang binagong Finn-II media sa complex ng nutrient media. Upang mapabilis ang paglaki, ang 0.05% sodium thioglycolate ay idinagdag sa Finn-II nutrient medium, na nagpapababa sa konsentrasyon ng oxygen. Upang maprotektahan ang mga sistema ng enzyme ng mycobacteria mula sa mga nakakalason na produkto ng lipid peroxidation, ang antioxidant α-tocopherol acetate ay ipinakilala sa Finn-II nutrient medium sa isang konsentrasyon na 0.001 μg/ml. Ang diagnostic na materyal ay ibinuhos gamit ang karaniwang pamamaraan.

Sa mga laboratoryo ng anti-tuberculosis sa Russia, ginagamit din ang iba pang mga pagbabago ng siksik na nutrient media: ang nutrient medium na "Novaya" na iminungkahi ni GG Mordovsky, ang nutrient media na A-6 at A-9 na binuo ng VA Anikin, atbp.

Dahil sa ang katunayan na sa panahon ng chemotherapy, ang pinsala ay nangyayari sa iba't ibang mga metabolic system ng microbial cell, ang bahagi ng mycobacterial na populasyon ay nawawalan ng kakayahang umunlad nang normal sa conventional nutrient media at nangangailangan ng osmotically balanced (semi-liquid o liquid) nutrient media.

Pagsusuri at pagtatala ng mga resulta ng kultura ng materyal na diagnostic

Ang ilang mga strain at uri ng mycobacteria ay mabagal na lumalaki, ang paglaki ay maaaring lumitaw kahit na sa ika-90 araw. Ang bilang ng mga naturang kultura ay maliit, ngunit pinipilit nito ang mga paghahasik na itago sa isang termostat sa loob ng 2.5-3 buwan.

Ang mga virulent na kultura ng Mycobacterium tuberculosis ay karaniwang lumalaki sa solid egg media bilang mga kolonya na R-form na may iba't ibang laki at hitsura. Ang mga kolonya ay tuyo, kulubot, kulay garing, at bahagyang may kulay. Sa ibang media, maaaring mas basa ang mga kolonya ng Mycobacterium tuberculosis. Pagkatapos ng isang kurso ng chemotherapy o sa panahon ng paggamot, ang makinis na mga kolonya na may basa-basa na paglaki (S-form) ay maaaring ihiwalay.

Kapag naghihiwalay ng mga kultura, isang hanay ng mga espesyal na pag-aaral ang ginagamit upang makilala ang tuberculosis mycobacteria mula sa non-tuberculous mycobacteria at acid-fast saprophytes.

Ang isang positibong sagot ay ibinibigay pagkatapos ng isang ipinag-uutos na mikroskopikong pagsusuri ng isang pahid mula sa mga lumaking kolonya na nabahiran ayon kay Ziehl-Neelsen. Sa kaso ng paglaki ng mycobacteria, ang mga matingkad na pulang baras ay matatagpuan sa mga pahid, nakahiga nang isa-isa o sa mga grupo, na bumubuo ng mga kumpol sa anyo ng nadama o braids. Sa mga batang kultura, lalo na ang mga nakahiwalay sa mga pasyente na ginagamot sa chemotherapy sa loob ng mahabang panahon, ang mycobacteria ay nakikilala sa pamamagitan ng binibigkas na polymorphism, hanggang sa pagkakaroon ng maikli, halos coccoid o pinahabang mga variant na kahawig ng fungal mycelium, kasama ang mga hugis ng baras.

Ang intensity ng mycobacterial growth ay itinalaga ayon sa sumusunod na pamamaraan: (+) - 1-20 CFU sa isang test tube (mababa ang bacterial excretion); (++) - 20-100 CFU sa isang test tube (moderate bacterial excretion); (+++) - >100 CFU sa isang test tube (masaganang bacterial excretion). Sa mga diagnostic ng laboratoryo ng tuberculosis, hindi sapat na magbigay ng isang sagot na nagpapahiwatig kung ang mycobacteria ay nakita o hindi ng isang partikular na pamamaraan. Kinakailangan din na magkaroon ng isang detalyadong ideya ng dami at likas na katangian ng populasyon ng mycobacterial, ang komposisyon at mga katangian nito. Ang mga data na ito ay nagbibigay-daan sa isa na wastong bigyang-kahulugan ang estado ng proseso, magplano ng mga taktika at agad na ayusin ang paggamot.

Sa mga nagdaang taon, ang agar-based nutrient media na may iba't ibang mga additives sa paglago at ang paggamit ng isang espesyal na halo ng gas ay iminungkahi upang mapabilis ang paglaki ng mycobacteria. Upang makuha ang paglaki ng mycobacteria sa mga media na ito, isang kapaligiran na may mas mataas na nilalaman ng carbon dioxide (4-7%) ay nilikha sa panahon ng paglilinang. Para sa layuning ito, ginagamit ang mga espesyal na CO2 incubator _. Gayunpaman, ang mga automated mycobacteria cultivation system ay nakatanggap ng pinakamalaking pag-unlad: MGIT-BACTEC-960 at MB/Bact.

Ang isa sa mga naturang sistema ay ang MGIT (mycobacteria growth indicating tube) system, na isang high-tech na pag-unlad at idinisenyo para sa pinabilis na bacteriological diagnostics ng tuberculosis at pagtukoy ng mycobacteria sensitivity sa mga first-line na gamot at ilang pangalawang linyang gamot. Idinisenyo ang MGIT para gamitin bilang bahagi ng VASTEC-960 device. Ang mga mikroorganismo ay nililinang sa mga espesyal na test tube na may likidong nutrient medium batay sa isang binagong Middlebrook-7H9 medium. Upang pasiglahin ang paglaki ng mycobacteria at sugpuin ang paglaki ng dayuhang microflora, ginagamit ang MGIT Growth Supplement at pinaghalong PANTA antibacterial na gamot.

Ang paglaki ng mikroorganismo ay nakarehistro sa optically. Ito ay batay sa fluorescence, na nangyayari kapag ang mycobacteria ay kumonsumo ng oxygen sa panahon ng kanilang paglaki. Ang isang fluorochrome dye na umaasa sa oxygen ay nakapaloob sa ilalim ng isang espesyal na test tube at natatakpan ng isang layer ng silicone. Ang pagpaparami ng Mycobacteria ay humahantong sa pagbaba sa dami ng oxygen sa test tube at pagbaba sa konsentrasyon nito, na nagiging sanhi ng pagtaas ng fluorescence, na nagiging nakikita kapag ang test tube ay na-irradiated ng ultraviolet light at awtomatikong nairehistro ng mga photosensor na binuo sa VASTES-960 device. Ang intensity ng luminescence ay nakarehistro sa growth units (GU). Awtomatikong ipinapasok ang data ng paglago sa isang computer, kung saan mai-save ang mga ito. Ang pagsusuri sa computer ng mga curve ng paglago ay maaaring magbigay ng impormasyon sa pagkakaroon ng iba't ibang mga pool ng mycobacteria, kabilang ang mga hindi tuberculous, at tumutulong din upang suriin ang mga katangian ng paglago ng mycobacteria.

Bilang resulta ng pagpapakilala ng mga naturang sistema, ang oras ng paglaki ng mycobacteria ay makabuluhang nabawasan, na may average na 11 araw sa VASTEC-960 at 19 na araw sa MB/Bact kumpara sa 33 araw sa isang karaniwang siksik na nutrient medium. Dapat tandaan na ang mga sistemang ito ay nangangailangan ng mataas na kwalipikadong tauhan. Ang paghahasik ng materyal sa likidong media ay kinakailangang sinamahan ng paghahasik sa Lowenstein-Jensen medium, na gumaganap ng papel na isang backup sa mga kaso kung saan ang tuberculosis mycobacteria ay hindi lumalaki sa ibang media.

[ 38 ], [ 39 ], [ 40 ], [ 41 ], [ 42 ], [ 43 ]

Pagpapasiya ng pagkamaramdamin sa gamot ng mycobacteria

Ang pagpapasiya ng spectrum at antas ng sensitivity ng mycobacteria sa mga anti-tuberculosis na gamot ay may malaking kahalagahan sa klinikal, pati na rin para sa epidemiological na pagtatasa ng pagkalat ng tuberculosis na lumalaban sa droga. Bilang karagdagan, ang pagsubaybay sa paglaban sa droga ay nagbibigay-daan sa amin upang masuri ang bisa ng programang anti-tuberculosis sa kabuuan, bilang isang mahalagang tagapagpahiwatig ng gawain ng lahat ng bahagi ng mga hakbang laban sa tuberculosis.

Dalas at timing ng pagsusuri sa pagiging sensitibo sa droga:

• bago magsimula ang paggamot, isang beses upang matukoy ang diskarte at taktika ng paggamot:
• Kapag naghihiwalay ng mga kultura mula sa iba't ibang mga materyales mula sa isang pasyente (dura, BAL, ihi, exudates, cerebrospinal fluid, atbp.), lahat ng mga nakahiwalay na strain ay sinusuri:
• sa pagtatapos ng masinsinang yugto ng paggamot sa kawalan ng klinikal at radiological dynamics:
• kung kinakailangan upang baguhin ang regimen ng paggamot sa kaganapan ng:
  • kawalan ng negatibiti ng plema;
  • muling kultura pagkatapos ng negatibiti ng plema;
  • isang matalim na pagtaas sa dami ng AFB sa isang smear pagkatapos ng paunang pagbaba. Alam na alam na ang mga strain ng Mycobacterium tuberculosis na may iba't ibang sensitivity sa gamot ay nakahiwalay sa materyal mula sa isang pasyente na may tuberculosis. Ang sensitivity ng mga strain sa mga anti-tuberculosis na gamot ay maaaring mag-iba sa spectrum ng mga gamot, antas, dalas at bilis ng pag-unlad ng paglaban.

Ang antas ng paglaban sa gamot ng Mycobacterium tuberculosis ay tinutukoy alinsunod sa itinatag na pamantayan, na nakatuon sa klinikal na kahalagahan ng paglaban at nakasalalay sa aktibidad ng anti-tuberculosis ng gamot, mga pharmacokinetics nito, konsentrasyon sa sugat, ang maximum na therapeutic dosis, atbp.

Ang pagpapasiya ng pagkamaramdamin sa gamot ng mycobacteria ay kasalukuyang isinasagawa gamit ang mga microbiological na pamamaraan:

• ganap na konsentrasyon (paraan ng pagbabanto sa solid o likidong nutrient media),
• mga sukat,
• koepisyent ng paglaban.

Karaniwan, ang paglaban ay ipinahayag sa anyo ng biswal na sinusunod na paglaki ng mga kolonya ng mycobacteria tuberculosis, gayunpaman, may mga pamamaraan na nag-udyok sa paglaki sa mga unang yugto ng mycobacterial cell division sa anyo ng mga reaksyon ng kulay. Binabawasan ng mga pamamaraang ito ang oras ng pagsubok mula 3-4 hanggang 2 linggo.

Ang ganap na paraan ng konsentrasyon na inirerekomenda ng WHO Chemotherapy Committee ay naging laganap sa Russia bilang isang pinag-isang paraan. Mula sa isang metodolohikal na pananaw, ito ang pinakasimpleng, ngunit nangangailangan ng mataas na standardisasyon at katumpakan ng mga pamamaraan sa laboratoryo. Ang pagsusuri sa pagiging sensitibo sa gamot ay binubuo ng isang set ng mga test tube na may nutrient medium na binago ng mga anti-tuberculosis na gamot. Ang set ay binubuo ng 2-3 test tube na may iba't ibang konsentrasyon ng bawat gamot na ginamit, isang control test tube na may medium na walang gamot, at isang test tube na naglalaman ng 1000 μg/ml sodium salicylate o 500 μg/ml paranitrobenzoic acid upang makita ang paglaki ng non-tuberculous mycobacteria.

Upang maghanda ng isang hanay ng media na may mga paghahanda, gumamit ng binagong daluyan ng Lowenstein-Jensen (walang starch), na ibinuhos sa mga flasks. Ang isang tiyak na dami ng kaukulang pagbabanto ng gamot na anti-tuberculosis ay idinagdag sa bawat isa sa mga flasks. Ang mga nilalaman ng mga flasks ay lubusan na halo-halong, ibinuhos sa mga test tube at pinagsama sa isang hilig na posisyon sa loob ng 40 minuto sa temperatura na 85 ° C. Inirerekomenda na i-coagulate ang daluyan sa isang electric coagulator na may awtomatikong kontrol sa temperatura. Katamtaman na may mga gamot na anti-tuberculosis

Ang 1st row ay maaaring itago sa refrigerator sa 2-4 °C sa loob ng 1 buwan, na may mga gamot sa 2nd row - hindi hihigit sa 2 linggo. Ang pag-iimbak ng media na may mga gamot sa temperatura ng silid ay hindi katanggap-tanggap. Kapag naghahanda ng mga solusyon ng mga gamot na anti-tuberculosis, ang kanilang aktibidad ay isinasaalang-alang, ang pagkalkula ng konsentrasyon na may pagsasaayos para sa molekular na bigat ng di-tiyak na bahagi ng gamot, kadalisayan, atbp. Upang matukoy ang sensitivity ng gamot, tanging mga kemikal na purong sangkap ang ginagamit.

Ang prinsipyo ng pamamaraan ay upang matukoy ang konsentrasyon ng isang anti-tuberculosis na gamot na pinipigilan ang paglaki ng isang makabuluhang bahagi ng populasyon ng mycobacteria. Kapag ginawa nang tama, ang pamamaraang ito ay may mahusay na pagiging maaasahan.

Bago isagawa ang pagsubok, kinakailangang tiyakin na ang nakahiwalay na kultura ng Mycobacterium tuberculosis ay hindi naglalaman ng extraneous microflora. Ang isang homogenous na suspensyon na naglalaman ng 500 milyong microbial body sa 1 ml (optical turbidity standard 5 units) ay inihanda mula sa kultura ng mycobacteria sa isang 0.9% sodium chloride solution. Ang resultang suspensyon ay diluted na may 0.9% sodium chloride solution (1:10) at 0.2 ml ng suspension ay idinagdag sa bawat test tube ng nutrient media set. Ang mga inoculated test tubes ay inilalagay sa isang thermostat sa 37 °C at pinananatiling pahalang sa loob ng 2-3 araw upang ang slanted surface ng nutrient medium ay pantay na na-inoculate ng suspensyon ng Mycobacterium tuberculosis. Pagkatapos ang mga test tube ay inilipat sa isang patayong posisyon at incubated para sa 3-4 na linggo. Ang mga resulta ay naitala pagkatapos ng 3-4 na linggo.

Dahil ang oras na kinakailangan upang ihiwalay ang pathogen mula sa klinikal na materyal sa nutrient media ay hindi bababa sa 1-1.5 na buwan, ang mga resulta ng pagtukoy ng pagkamaramdamin sa gamot gamit ang pamamaraang ito ay maaaring makuha nang hindi mas maaga kaysa sa 2-2.5 na buwan pagkatapos ng paghahasik ng materyal. Ito ay isa sa mga pangunahing kawalan ng pamamaraan.

Ang mga resulta ng mycobacterial drug susceptibility testing ay binibigyang-kahulugan batay sa ilang pamantayan. Sa solid media, ang isang kultura ay itinuturing na sensitibo sa konsentrasyon ng gamot na nasa medium kung ang bilang ng mga mycobacterial colonies na lumaki sa isang naibigay na test tube na may gamot ay hindi lalampas sa 20 na may masaganang paglaki sa isang control test tube na walang mga gamot. Tanging kung mayroong higit sa 20 kolonya ang kultura ay itinuturing na lumalaban sa isang naibigay na konsentrasyon. Sa pagsasagawa, kapag ang mga resulta ng paglago sa mga test tube na malapit sa 20 CFU ay nakuha, kinakailangang ipaalam sa klinikal na yunit na ang sensitivity o paglaban sa kasong ito ay hangganan, dahil minsan ay maaaring ipaliwanag nito ang hindi malinaw na dinamika ng mga klinikal na tagapagpahiwatig.

Para sa iba't ibang mga paghahanda, ang isang tiyak na konsentrasyon ay itinatag kung saan ang pagpaparami ng isang kritikal na proporsyon ng populasyon ng mycobacterial ay sinusunod. Ang mga konsentrasyong ito ay tinatawag na "kritikal". Ang laki ng paglaki ng mycobacterial na populasyon sa isang nutrient medium na may paghahanda sa isang kritikal na konsentrasyon ay ginagamit bilang isang criterion para sa katatagan.

Sa domestic phthisiology practice, kapag tinutukoy ang paglaban sa droga, hindi sila limitado sa pagtukoy lamang ng mga kritikal na konsentrasyon. Ito ay dahil sa ang katunayan na ang pinalawak na kahulugan ng antas ng paglaban sa gamot ng pathogen ay nagbibigay-daan sa clinician na mas wastong bumalangkas ng mga taktika sa chemotherapy, gamit ang kaalaman sa potentiating effect ng mga kumbinasyon ng gamot, upang mahulaan ang cross-resistance o gumamit ng mas epektibong mga gamot ng ginamit na grupo ng mga anti-tuberculosis na gamot.

Ang ganap na paraan ng konsentrasyon ay ang pinakasimpleng, ngunit din ang pinaka-sensitibo sa mga error na ginawa sa pagpapatupad nito. Mas maaasahan, lalo na kapag tinutukoy ang pagiging sensitibo sa mga second-line na gamot, at laganap sa labas ng Russia ang paraan ng proporsyon. Isinasaalang-alang nito ang mga pagkukulang ng ganap na paraan ng konsentrasyon, ngunit ito ay mas matrabaho upang ipatupad.

Ang pamamaraan ay halos kapareho sa ganap na paraan ng konsentrasyon. Ang paghahanda ng mga test tube na may mga gamot ay pareho sa paraan ng ganap na konsentrasyon. Gayunpaman, ang dosis ng binhi ng suspensyon ng tuberculosis mycobacterium ay nabawasan ng 10 beses, na nag-aalis ng dalas ng kusang pagtutol ng ilang tuberculosis mycobacterium strains sa mga gamot tulad ng Ethambutol, prothionamide, capreomycin. Bilang mga kontrol, 2 o 3 tubo na may dosis ng binhi na katumbas ng nasa mga tubo ng pagsubok, na sunud-sunod na natunaw ng 10 at 100 beses, ay ginagamit. Ang criterion para sa paglaban ay ang proporsyon ng nakikitang paglaki ng tuberculosis mycobacterium. Para sa 1st-line na gamot, ang criterion para sa paglaban ay labis na paglaki ng 1% ng paunang populasyon, para sa 2nd-line na gamot - paglago ng 1 o higit sa 10% ng inisyal, depende sa napiling kritikal na konsentrasyon.

Noong 1997, ang WHO at International Union Against Tuberculosis working group sa pagtuklas ng anti-tuberculosis drug resistance ay gumawa ng mga pagsasaayos sa mga pamantayang ito, na nagmumungkahi na isaalang-alang ang mycobacteria na lumalaki sa siksik na Lowenstein-Jensen egg medium sa mga sumusunod na konsentrasyon bilang lumalaban:

• dihydrostreptomycin - 4 μg/ml;
• isoniazid - 0.2 µg/ml:
• rifampicin - 40 mcg/ml:
• Ethambutol - 2 mcg/ml.

Noong 2001, iminungkahi ang mga kritikal na konsentrasyon para sa mga sumusunod na pangalawang linyang gamot (para sa isang kritikal na proporsyon na 1%):

• capreomycin - 40 mcg/ml;
• protionamide - 40 mcg/ml;
• kanamycin - 30 μg / ml;
• viomycin - 30 μg/ml;
• cycloserine - 40 mcg/ml;
• aminosalicylic acid - 0.5 mcg/ml;
• ofloxacin - 2 mcg/ml.

Ang mga resulta ng paglago ay tinasa pagkatapos ng 4 na linggo bilang paunang at pagkatapos ng 6 na linggo ng paglilinang bilang pangwakas.

Para sa pagtukoy ng pagkamaramdamin ng gamot sa pyrazinamide, na malawakang ginagamit sa modernong tuberculosis chemotherapy, ang inirerekomendang kritikal na konsentrasyon ay 200 μg/ml. Gayunpaman, wala pa ring pangkalahatang tinatanggap na paraan para sa pagtukoy ng paglaban sa gamot sa gamot na ito sa solid nutrient media, dahil ang aktibidad na antibacterial nito ay ipinapakita lamang sa isang acidic na kapaligiran (pH <6), na teknikal na mahirap mapanatili. Bilang karagdagan, maraming mga klinikal na kultura ng Mycobacterium tuberculosis ang nag-aatubili na lumaki sa media ng itlog na may acidic na kapaligiran.

Upang masuri ang kalidad ng mga resulta ng pagtukoy sa pagkamaramdamin sa gamot ng mycobacteria, inirerekomenda na kontrolin ang bawat bagong batch ng daluyan ng Lowenstein-Jensen sa pamamagitan ng parallel na pagpapasiya ng pagkamaramdamin ng karaniwang strain ng museo na H37Rv. Bilang karagdagan, mayroong ilang mga microbiological na pamantayan na dapat matugunan upang ang mga pamamaraan ay magbigay ng isang mahusay na maaaring kopyahin at wastong binibigyang kahulugan na resulta. Kabilang dito ang posibilidad na mabuhay ng tuberculosis mycobacteria culture, ang mga patakaran para sa pagkuha ng homogenous na suspension at suspension, ang mga patakaran para sa pagpili ng tuberculosis mycobacteria culture, at ang pagiging kinatawan ng napiling bacterial mass. Ang pagiging maaasahan ng pagtukoy ng paglaban sa gamot ay bumababa sa sobrang mahinang bacterial excretion.

Kamakailan, ang paraan ng pagtukoy sa pagkamaramdamin sa droga gamit ang mga automated system ay kinilala bilang promising. Ang pinaka-advanced sa lugar na ito ay mga development batay sa VASTEC MGIT-960. Sa kasong ito, ang pagiging sensitibo ng gamot sa tuberculosis mycobacteria ay tinutukoy batay sa isang binagong paraan ng proporsyon. Sa panahon ng pagpapasiya, ang rate ng paglago ng tuberculosis mycobacteria sa control tube at sa mga tubo na may mga gamot ay inihambing. Upang matukoy ang pagkamaramdamin sa streptomycin, isoniazid, rifampicin at ethambutol, ginagamit ang mga additives at antibiotic na kasama sa SIRE kit. Upang matukoy ang pagkamaramdamin sa pyrazinamide, ginagamit ang PZA kit. Sa panahon ng pagsubok, ang mga test tube na may mga gamot ay inoculated na may suspensyon ng tuberculosis mycobacteria, pati na rin ang mga control tube na may 100-tiklop na pagbabanto ng suspensyon para sa lahat ng mga gamot, maliban sa pyrazinamide, kung saan ang pagbabanto ng suspensyon ay 10 beses. Ang criterion para sa katatagan ay ang mycobacteria growth indicator na 100 GU kapag ang paglaki sa control tube ay umabot sa 400 GU (tingnan ang "Mga pamamaraan sa kultura para sa paghihiwalay ng mycobacteria"). Ang mga resulta ay awtomatikong naitala at binibigyang-kahulugan at itinatakda ng ipinasok o napiling programa.

Ang mga huling konsentrasyon sa test tube na may likidong nutrient medium ay ginagamit bilang mga kritikal na konsentrasyon. Sa kasalukuyan, ang mga kritikal na konsentrasyon ay binuo para sa parehong mga first-line na gamot at ilang second-line na gamot. Dapat tandaan na ang pagpapasiya ng sensitivity ng tuberculosis mycobacteria sa cycloserine at aminosalicylic acid ay isinasagawa lamang sa egg nutrient media.

Ang isang detalyadong protocol para sa pagtatrabaho kasama ang inilarawang sistema ay nagbibigay-daan para sa pagsusuri sa pagkamaramdamin sa gamot kapwa sa isang nakahiwalay na kultura (na may siksik na nutrient medium) at gamit ang pangunahing paglaki ng mycobacteria sa isang MGIT test tube. Ang huling opsyon ay makabuluhang binabawasan ang oras na kinakailangan para sa pagsasagawa ng mga kultural na pag-aaral, na nagbibigay-daan para sa ganap na mga resulta sa kultura ng tuberculosis mycobacteria (kabilang ang impormasyon sa pagkamaramdamin sa droga) na makuha sa loob ng 3 linggo ng pagkolekta ng materyal, habang ang tradisyunal na pamamaraan ay maibibigay lamang ito sa ika-3 buwan. Ang mga napapanahong resulta, kapag ang pasyente ay nasa masinsinang yugto ng paggamot, ay maaaring makatumbas sa mataas na halaga ng mga pag-aaral.

[ 44 ], [ 45 ], [ 46 ], [ 47 ], [ 48 ], [ 49 ], [ 50 ]

Pagkita ng kaibhan ng mycobacteria

Isinasaalang-alang na ang nutrient media na ginamit ay hindi mahigpit na pumipili, ang kasunod na pagkakaiba-iba ng nakahiwalay na mycobacteria ay itinuturing na sapilitan. Ang pangangailangan para sa pagkita ng kaibhan ng mycobacteria ay dahil sa isang bilang ng mga tampok ng mga proseso ng pathological na dulot ng mga kinatawan ng genus: iba't ibang kurso at kinalabasan ng tuberculosis at mycobacteriosis, ang pagkakaroon ng natural na paglaban sa gamot sa ilang mga anti-tuberculosis na gamot.

Kinikilala na ang pangunahing pagkakakilanlan ng mycobacteria ng M. tuberculosis complex mula sa non-tuberculous mycobacteria ay isinasagawa ayon sa mga sumusunod na katangian: rate ng paglago sa siksik na nutrient media, pigment formation, colony morphology, ang pagkakaroon ng acid resistance at ang temperatura na pinakamainam para sa paglago.

Sa kasamaang palad, walang iisang paraan ng laboratoryo na mapagkakatiwalaan na makilala ang mycobacteria ng M. tuberculosis complex mula sa iba pang acid-fast mycobacteria; gayunpaman, ang isang kumbinasyon ng mga inilarawan sa itaas na mga palatandaan na may mga resulta ng isang bilang ng mga biochemical test na ibinigay sa ibaba ay nagbibigay-daan para sa pagkakakilanlan ng mycobacteria ng M. tuberculosis complex na may posibilidad na hanggang 95%.

Upang pag-iba-ibahin ang mycobacteria ng M. tuberculosis complex (M. tuberculosis, M. bovis, M. bovisBCG, M. africanum, M. microti, M. canettii at iba pa) mula sa dahan-dahang lumalagong non-tuberculous mycobacteria, ang mga pangunahing biochemical test ay ginagamit upang makita ang pagkakaroon ng mga sumusunod na palatandaan:

• kakayahang makagawa ng nikotinic acid (pagsusuri ng niacin):
• aktibidad ng nitrate reductase;
• thermostable catalase;
• paglaki sa isang medium na may sodium salicylate (1 mg/ml).

Bilang karagdagang pagsubok, ang mga pagsubok sa paglaki sa isang medium na naglalaman ng 500 μg/ml para-nitrobenzoic acid o 5% sodium chloride ay maaari ding gamitin.

Maraming mga bacteriological laboratories ang nagpapakilala sa mga microorganism na ito lamang sa kumplikadong antas, na dahil sa limitadong mga kakayahan ng mga laboratoryo at ang mga pamamaraan na kakayahan ng mga espesyalista.

Sa karamihan ng mga kaso sa pagsasanay, ang mga sumusunod na pagsusuri ay sapat upang makilala ang M. tuberculosis at M. bovis: niacin, nitrate reductase, pyrazinamidase, at pagpaparehistro ng paglago sa isang medium na naglalaman ng 2 μg/ml thiophene-2-carboxylic acid hydrazide. Isinasaalang-alang na ang mycobacteria ng M. tuberculosis complex ay nailalarawan sa pamamagitan ng mga sumusunod na hanay ng mga tampok:

• mabagal na paglaki (higit sa 3 linggo);
• temperatura ng paglago sa loob ng 35-37 ^o C;
• kawalan ng pigmentation (kulay ng garing);
• binibigkas na acid-fast na kulay;
• positibong pagsusuri sa niacin;
• positibong pagsusuri sa nitrate reductase;
• kawalan ng thermostable catalase (68 ^o C).
• kakulangan ng paglago sa Lowenstein-Jensen medium na naglalaman ng:
  • 1000 µg/ml sodium salicylic acid,
  • 500 mcg/ml para-nitrobenzoic acid,
  • 5% sodium chloride:
• paglago sa pagkakaroon ng 1-5 μg/ml thiophene-2-carboxylic acid.

Ang kaugnayan ng pagkakaiba-iba ng nakahiwalay na mycobacteria ay tataas nang malaki sa paglaki ng dalas ng pagpaparehistro ng mga kaso ng HIV/AIDS na nauugnay sa tuberculosis o mycobacteriosis. Sa kasalukuyan, walang ganap na katiyakan sa kahandaan ng mga praktikal na rehiyonal na laboratoryo upang maisagawa nang tama ang dami ng gawaing ito.

[ 51 ], [ 52 ], [ 53 ], [ 54 ], [ 55 ], [ 56 ], [ 57 ], [ 58 ]

Immunological diagnostics ng tuberculosis

Mayroong isang bilang ng mga unibersal na phenomena, paghahanda at mga pagsusuri sa immunological na unang natuklasan partikular sa tuberculosis o sa modelo ng immune response sa mycobacteria. Kabilang dito ang BCG at tuberculin, tulad ng isang kababalaghan tulad ng balat DST (tuberculin pagsusulit - Pirquet at Mantoux reaksyon), ang reaksyon sa subcutaneous pangangasiwa ng tuberculin sa sensitized hayop (Koch phenomenon). Ang ilan sa mga unang antibodies sa mga nakakahawang sakit ay natuklasan din sa tuberculosis. Siyempre, mas malalim ang pag-unawa sa mga mekanismo ng anti-tuberculosis immunity at ang kanilang genetic control, mas malawak ang paggamit ng mga immunological na pamamaraan at paghahanda na nakakaapekto sa immunity para sa paglutas ng mga praktikal na problema ng phthisiology.

Ang pinakamahalaga at kumplikadong praktikal na problema sa kasalukuyan ay ang pagtuklas ng tuberculosis sa proseso ng mass screening ng populasyon. Gayunpaman, sa kabila ng maraming ulat ng "mga tagumpay" (sa limitadong materyal), walang immunological na paraan (magagawang muli sa "anumang mga kamay") o gamot na angkop para sa mga layuning ito.

Ang mga pamamaraan ng immunological, sa partikular na mga pag-aaral ng serological (pagpapasiya ng mga antigen, antibodies) at mga pagsubok sa pagpukaw ng tuberculin, ay malawakang ginagamit sa klinikal na kasanayan.

Ang mga serological na pamamaraan, na tumutukoy sa mga antigen at antibodies sa iba't ibang mga kapaligiran ng katawan, ay nasa unang lugar sa mga immunological na pag-aaral na ginagamit sa differential diagnostics.

Ang pagtitiyak ng pagpapasiya ng mga antibodies sa mycobacteria tuberculosis ay nakasalalay sa mga antigen na ginamit sa pagsusuri ng immune. Ang isang makabuluhang bilang ng mga antigens ay iminungkahi, ang una ay ang tuberculin PPD:

• PPD at iba pang kumplikadong paghahanda mula sa fluid ng kultura;
• ultrasonic disintegrant;
• Triton extract at iba pang kumplikadong paghahanda sa cell wall;
• 5-antigen (Daniel);
• 60-antigen (Coccito);
• lipoarabinomannan;
• cord factor (trehalose-6,6-di-mycolate);
• phenolic at iba pang glycolipids;
• lipopolysaccharides;
• fibronectin-binding antigen;
• mga protina (kadalasang recombinant); 81,65,38,34,30,19,18,16,15.12 KDA, atbp.

Bilang resulta ng maraming taon ng pananaliksik ng mga Ruso at dayuhang siyentipiko, ang mga pangunahing pattern ng pagbuo ng antibody at ang pagiging epektibo ng serological diagnostics ng tuberculosis ay nakilala: mas kumplikado ang antigen, mas mataas ang sensitivity at mas mababa ang pagtitiyak ng mga pagsubok. Ang pagtitiyak ay nag-iiba sa iba't ibang bansa depende sa impeksyon ng populasyon na may M. tuberculosis at non-tuberculous mycobacteria, sa pagbabakuna ng BCG, atbp. Sa mga bata, ang pagiging informative ng serodiagnostics ay mas mababa kaysa sa mga matatanda. Sa pangunahing tuberculosis (mas madalas na mga bata), ang pagpapasiya ng IgM ay mas nagbibigay-kaalaman; sa pangalawang tuberculosis - IgG. Sa mga taong nahawaan ng HIV, ang pagiging informative ng serodiagnostics sa pagtukoy ng mga antibodies ay nabawasan. Ang pagiging epektibo ng pagpapasiya ng antibody ay nakasalalay sa isang bilang ng mga "klinikal na sandali": ang aktibidad ng proseso (ang pagkakaroon o kawalan ng "paghihiwalay" ng mycobacteria, ang pagkakaroon ng mga nabubulok na lukab, ang antas ng paglusot), ang pagkalat ng proseso, ang tagal ng kurso nito.

Ang sensitivity ng enzyme immunoassay (EIA) na pamamaraan ay halos 70%. Ang hindi sapat na bisa ng pag-aaral ay dahil sa mababang pagtitiyak nito. Noong nakaraan, ang mga posibilidad ng paggamit ng serological screening sa mga high-risk na grupo ay isinasaalang-alang, lalo na sa mga taong may mga pagbabago sa post-tuberculosis sa mga baga.

Upang madagdagan ang pagtitiyak ng ELISA, mas tiyak na mga antigen ang hinahanap, kabilang ang mga nakuha sa pamamagitan ng genetic engineering: ESAT-6, atbp. (tingnan sa itaas). Ang paggamit ng mahigpit na tiyak na antigens (38 kDa, ESAT) ay nagpapataas ng pagtitiyak, ngunit makabuluhang binabawasan ang sensitivity ng pagsusuri. Kasama ng ELISA (mga eksperimentong sistema ng pagsubok sa laboratoryo, tulad ng Pathozyme ELISA kit), ang mga immunochromatographic kit na may lateral filtration (Mycodot) ay inaalok din, pati na rin ang iba pang katulad na mga pagsubok (membrane dot analysis) na may visual na pagtatasa ng resulta ng pagsubok. Kapag isinasagawa ang mga pagsubok na ito, ang pagsusuri ay tumatagal ng 10-30 minuto; hindi sila nangangailangan ng mga espesyal na kagamitan, nangangailangan sila ng visual na pagtatasa ng mga resulta, na nauugnay sa isang tiyak na subjectivity. Ang mga pamamaraan na ito ay may humigit-kumulang na parehong sensitivity at specificity na mga katangian (70% at 90-93%, ayon sa pagkakabanggit) gaya ng tradisyonal na ELISA.

Ang paggamit ng mga pamamaraan ng pagtatasa ng immune ay may isang tiyak na halaga bilang isang karagdagang pamamaraan na isinasaalang-alang sa kumplikadong mga pamamaraan na ginamit sa kaugalian na diagnosis ng tuberculosis, lalo na sa pagsusuri ng mga extrapulmonary form nito. Ang pamamaraan ng ELISA ay pinaka-epektibo sa pagsusuri ng tuberculous meningitis kapag sinusuri ang cerebrospinal fluid. Sa kasong ito, ang sensitivity ng pagsusuri ay 80-85%, at ang pagtitiyak ay 97-98%. Mayroong impormasyon sa pagiging epektibo ng pagtukoy ng mga antibodies sa Mycobacterium tuberculosis sa tear fluid sa diagnosis ng tuberculous uveitis.

Induction ng gamma interferon synthesis sa vitro

Ang gamma interferon (IFN-γ) ay isang kadahilanan ng tiyak na proteksyon sa immune, na natanto sa pamamagitan ng pag-activate ng mga sistema ng enzyme ng macrophage. Ang induction ng IFN-γ synthesis ng sensitized T-lymphocytes ay sanhi ng kanilang pakikipag-ugnayan sa mycobacterial antigens.

Ang parehong tuberculin PPD at mga partikular na antigen na nakuha ng genetic engineering ay ginagamit bilang mga antigen, sa partikular na ESAT-6 antigen (maagang sikretong antigen na may molekular na timbang na 6 kDa) at CFP-10 (culture filtrate protein, 10 kDa). Ang genetically engineered o recombinant na mga antigen ay wala sa mga selula ng bakuna sa BCG at iba pang mycobacteria. Kapag gumagamit ng tuberculin, ang mga resulta ng IFN-γ induction test ay maihahambing sa mga resulta ng tuberculin skin test (direktang ugnayan). Kapag gumagamit ng genetically engineered na antigens, ang mga resulta ng pagsusuri ay mas tiyak at hindi nakadepende sa nakaraang pagbabakuna sa BCG. Kapag sinusuri ang mga nabakunahan na indibidwal na hindi nakipag-ugnayan sa impeksyon sa tuberculosis, ang pagtitiyak ng pagsusulit ay 99%. Ang sensitivity ng pagsusuri sa mga pasyente ng tuberculosis ay mula 81 hanggang 89%.

Ang mga pagsusuri at diagnostic ay binuo batay sa panandaliang paglilinang ng buong mga selula ng dugo o mga selulang mononuklear na nakahiwalay sa dugo na may tuberculosis mycobacteria antigens sa vitro, na sinusundan ng pagpapasiya ng konsentrasyon ng IFN-γ o pagbibilang ng bilang ng mga T-lymphocytes na nagsi-synthesize ng IFN-γ. Ang konsentrasyon ng interferon na na-synthesize sa isang test tube ay tinutukoy ng ELISA gamit ang mga monoclonal antibodies na nagbubuklod sa IFN-γ. Pagkatapos, gamit ang pagkakalibrate ng karaniwang IFN-γ, ang konsentrasyon nito sa test tube o mga balon ng plato ay tinutukoy.

Sa Elispot test, ang bilang ng mga T cell na nag-synthesize ng IFN-γ ay binibilang sa ibabaw ng isang dish na pinahiran ng mga antibodies sa IFN-γ.

Ang mga nag-develop ng in vitro IFN-γ induction diagnostic, na inaprubahan ng US Food and Drug Administration, ay nag-aangkin na ang pagsubok ay hindi makakapag-iba ng latent na impeksyon sa tuberculosis mula sa aktibong tuberculosis. Samakatuwid, sa mga rehiyon na may mataas na rate ng impeksyon, ang pagsusuri ay walang direktang diagnostic na halaga. Gayunpaman, sa ating bansa, maaari itong magamit upang maiiba ang impeksyon sa tuberculosis sa mga bata mula sa post-vaccination allergy, pati na rin upang masuri ang antas ng tiyak na kaligtasan sa sakit sa panahon ng paggamot.

Sa kasalukuyan, sumasailalim sa pag-aaral ang isang domestic test system para sa pagtukoy sa induction ng IFN-γ synthesis ng mga tiyak na tuberculosis antigens in vitro.

Katayuan ng immune at kurso ng tuberculosis, immunocorrection

Sa panahon ng paggamot ng tuberculosis, ang mga pagbabago sa antigenemia at ang estado ng immune system ay nangyayari sa mga tao.

Ang data sa mga pagbabago sa mga exudate at mga tisyu ay higit na nagkakasalungatan. Ang tanging bagay na maaaring mapansin nang may buong katwiran ay ang tuberculous granulomas, bilang panuntunan, ay naglalaman ng isang makabuluhang bilang ng mga activated T-lymphocytes.

Makatuwirang pag-isipan ang dalawa pang punto na kinakailangan upang maunawaan ang papel ng mga mekanismo ng immunological sa paggamot ng tuberculosis sa mga tao:

• Ang mga pasyente ng AIDS ay may partikular na mataas na saklaw ng pagkakaroon ng maramihang paglaban sa droga;
• Sa kaso ng maraming paglaban sa droga (at sa kawalan ng impeksyon sa HIV), ang mga sakit sa immune (pangunahin ang T-cell immunity) ay partikular na makabuluhan.

Sa tuberculosis, ang iba't ibang mga paraan ng immunocorrection ay malawakang ginagamit: una sa lahat, ito ay mga gamot na pangunahing kumikilos sa T-cell immunity at ang mononuclear phagocyte system (thymus hormones, isophone, licopid, polyoxidonium, atbp.), Pati na rin ang buo (attenuated) mycobacteria at ang kanilang mga bahagi.

Molecular biological diagnostics ng tuberculosis

Ang mga pamamaraan ng molecular biology sa mga diagnostic ng nakakahawang sakit ay pangunahing kinabibilangan ng mga pamamaraan batay sa pagmamanipula ng mga genomic na materyales ng bacterial at viral pathogens upang matukoy ang partikular na genetic material - mga seksyon ng DNA na may nucleotide sequence na partikular sa isang partikular na species o strain ng pathogen, para sa pagsusuri ng mga partikular na sequence ng DNA sa mga gene na tumutukoy sa sensitivity ng pathogen sa ilang partikular na gamot, pati na rin ang aktibidad ng paggana ng pathogen. Ang mga molecular biological na pamamaraan ay naging laganap sa siyentipikong pananaliksik at praktikal na aplikasyon sa mga diagnostic at pagsubaybay sa iba't ibang bacterial at viral infection pagkatapos ng pagtuklas ng polymerase chain reaction noong 1985 ni Carrie Mullis (Nobel Prize laureate. 1989).

Mga prinsipyo at kakayahan ng polymerase chain reaction method

Pinapayagan ng PCR ang pagpapalakas (multiplication) ng isang nucleotide sequence (isang fragment ng pathogen DNA) sa isang test tube sa ilang oras nang milyun-milyong beses. Ang pagsasagawa ng reaksyon sa pagkakaroon ng iisang DNA chain ay tumutukoy sa napakataas na sensitivity ng pagsusuri.

Ang nucleotide sequence ng ilang mga seksyon ng DNA chain ay tumutukoy sa genetic uniqueness ng microorganism, na nagpapaliwanag sa mataas na specificity ng PCR.

Ang kahalagahan ng pamamaraang ito para sa pagtuklas at pag-aaral ng mga katangian ng Mycobacterium tuberculosis ay dahil sa mga biological na katangian ng microorganism, na may napakabagal na paglaki: ang pagdodoble ng oras ng DNA ng Mycobacterium tuberculosis sa panahon ng kanilang paglilinang ay 12-24 na oras.

Ang prinsipyo ng pamamaraan ng PCR ay amplification - maramihang, milyun-milyong beses na pagpaparami ng mga seksyon ng isang tiyak na pagkakasunud-sunod ng DNA sa isang microvolume ng test tube na may paikot na pag-uulit ng sumusunod na tatlong yugto ng reaksyon, na ang bawat isa ay nagaganap sa ibang temperatura ng rehimen:

• Stage I - denaturation ng double-stranded DNA sa pag-init na may divergence ng mga chain nito;
• Stage II - komplementaryong pagbubuklod (hybridization) ng mga panimulang aklat (priming oligonucleotides) na may mga dulong seksyon ng mga chain ng isang mahigpit na tiyak na fragment ng DNA na pinili para sa amplification;
• Stage III – pagkumpleto ng DNA fragment chain gamit ang thermostable DNA polymerase.

Para sa amplification, ang test tube ay dapat maglaman ng mga molecule ng matrix DNA. Apat na uri ng deoxynucleoside triphosphate (nucleotides) na naglalaman ng kaukulang nitrogenous base: adenine (A), thymine (T), guanine (G), cytosine (C); artificially synthesized priming oligonucleotides (primers) na binubuo ng 18-20 base pairs; isang thermostable enzyme, DNA polymerase, na may pinakamainam na temperatura na 68-72 ^° C, at mga magnesium ions.

Ang pagtitiyak ng PCR ay nakasalalay sa pagpili ng fragment ng DNA. Alinsunod dito, ang flanking primer oligonucleotides ay na-synthesize. Ang pagiging tiyak ng hybridization at pagkumpleto ng DNA chain ay tinutukoy ng prinsipyo ng complementarity ng mga sumusunod na pares ng nitrogenous base: adenine-thymine, guanine-cytosine.

Upang matukoy ang genome ng tuberculosis complex mycobacteria, ang pinaka-epektibong target na amplification sa karamihan ng mga sistema ng pagsubok ay ang IS6110 DNA fragment, na sa karamihan ng tuberculosis mycobacteria strains ay may makabuluhang bilang (10-20) ng mga pag-uulit sa genome, na nagsisiguro, kasama ang specificity, mataas na sensitivity ng pagsusuri. Kasabay nito, ang tuberculosis mycobacteria strains na may maliit na bilang ng mga pag-uulit o ang kawalan ng IS6110 fragment ay inilarawan.

Pagkuha ng mga molekula ng DNA mula sa isang biological sample

Upang maisagawa ang PCR, ang mga molekula ng DNA ng pathogen ay dapat na ihiwalay mula sa biological na materyal sa isang minimal na dami, na may kaunting halaga ng hindi tiyak na DNA at iba't ibang mga inhibitor ng enzyme - DNA polymerase.

Ang paghahanda ng sample ay dapat isagawa sa ilalim ng mga kondisyon na pumipigil sa cross-contamination ng mga sample na pinag-aaralan sa mga nakahiwalay na molekula ng DNA. Nangangailangan ito ng paunang paggamot sa silid na may ultraviolet light, mga sahig at mga ibabaw ng trabaho ng mga mesa at aparato - na may mga solusyon na naglalaman ng klorin. Kinakailangan din na gumamit ng malinis na guwantes, mga disposable test tube at mga tip para sa mga awtomatikong pipette.

Upang ihiwalay ang DNA ng Mycobacterium tuberculosis mula sa mga klinikal na sample (cerebrospinal fluid, bronchial lavage) na hindi naglalaman ng isang malaking bilang ng mga leukocytes, cellular debris o salts, sapat na upang i-centrifuge ang sample sa 3-4 thousand revolutions kada minuto, magdagdag ng 20-30 µl ng isang X-1000 na solusyon ng Triton at 20-30 ^μl 30 minuto.

Ang paghahanda ng sample ng plema ay nangangailangan ng mahusay na liquefaction, karaniwang gumagamit ng 4% sodium hydroxide at N-acetyl-L-cysteine (NALC) sa 50-80 mg bawat sample, depende sa lagkit ng sample. Ang NALC solution ay dapat ihanda ex tempore, o ang NALC powder ay maaaring idagdag ng tuyo nang direkta sa sample. Pagkatapos ng liquefaction, ang mga sample ay dapat i-centrifuge sa loob ng 15 min sa 3,500-4,000 rpm (3,000 g) sa 50 ml screw-cap tubes, ibig sabihin, sa ilalim ng parehong mga kondisyon na inirerekomenda para sa pre-culture sputum preparation.

Para i-extract ang DNA mula sa sediment, isang paraan batay sa paggamit ng 5-6 molar solution ng guanidine isothiocyanate bilang lysing reagent at microporous silicon oxide particle ("diatomaceous earth") na kadalasang ginagamit ang sorb DNA molecules. Ang mga di-tiyak na sangkap, kabilang ang mga posibleng inhibitor, ay hinuhugasan sa isang 2.5 molar na solusyon ng guanidine isothiocyanate at isang ethanol solution, pagkatapos nito ang mga molekula ng DNA ay na-desorbed sa tubig, at ang mga sample na ito ay ginagamit upang magsagawa ng PCR. Upang gawing simple ang teknolohiya ng pagkuha ng DNA, ang "diatomaceous earth" ay kadalasang pinapalitan ng mga magnetic microparticle na pinahiran ng silicon oxide. Sa kasong ito, ang isang espesyal na magnetic stand para sa microtubes ay ginagamit upang mamuo ang mga particle sa halip na centrifugation.

Ang isang orihinal na paraan ng immunomagnetic na paghihiwalay ng mycobacteria na may kasunod na pagkuha ng pathogen DNA ay binuo sa Russia. Para sa immunomagnetic separation ng tuberculosis mycobacteria, ferroparticle na 3-5 μm ang laki, na pinahiran ng silicon oxide, ay ginagamit, kung saan ang polyclonal (kuneho) antibodies sa tuberculosis mycobacteria ay nakakabit sa pamamagitan ng isang kemikal na bono. Ang mga sample ng plema pagkatapos ng alkaline lysis ay na-neutralize sa isang acidic na Tris-HCl solution at natuburan ng isang immunomagnetic sorbent. Pagkatapos ang immunoferroparticle ay kinokolekta gamit ang isang magnetic rod na may palitan na tip, inilipat sa isang microtube, at namuo. Ang 20-30 μl ng isang 2% Triton X-100 solution ay idinagdag at pinainit ng 30 minuto sa 90 ^o C. Ang supernatant ay ginagamit bilang DNA matrix para sa pagsusuri ng PCR.

Ang isang mahirap na problema ay ang pagkuha ng tuberculosis mycobacterium DNA mula sa biopsy specimens. Para sa biopsy lysis, ang enzyme proteinase K ay ginagamit sa panghuling konsentrasyon na 200-500 mg/l sa temperatura na 56 ^o C magdamag. Pagkatapos, ito ay nakuha gamit ang isa sa mga kilalang pamamaraan. Ang labis na di-tiyak na DNA sa pagsusuri ng PCR ng mga biopsy specimen ay kadalasang nagiging sanhi ng pagsugpo sa reaksyon, na nangangailangan ng paulit-ulit na pagkuha ng DNA.

Mga paraan ng pagtuklas ng mga resulta

Matapos makumpleto ang reaksyon, ang mga amplified na fragment ng pathogen DNA ay nakilala gamit ang iba't ibang mga pamamaraan.

Ang pamamaraan ng gel electrophoresis ay kilala. Sa kasong ito, ang nakuha na fragment ng DNA ay nakikilala sa pamamagitan ng isang positibong kontrol na naglalaman ng nais na partikular na fragment ng DNA, o sa pamamagitan ng isang dating kilalang laki (bilang ng mga pares ng nucleotide) ng fragment, na tinutukoy gamit ang isang karaniwang molecular marker.

Sa pagkakaroon ng isang tiyak na tina - ethidium bromide, na kasama sa double-stranded DNA, ang synthesized DNA fragment ay ipinahayag bilang isang banda na kumikinang sa ilalim ng impluwensya ng ultraviolet light.

Ang laki ng fragment ng DNA, na tinutukoy ng electrophoresis batay sa distansyang nilakbay mula sa simula, ay dapat na tumutugma sa isang kilalang marker ng timbang ng molekula o positibong kontrol.

Ang iba pang mga pamamaraan para sa pagtukoy ng mga resulta ng PCR ay batay sa hybridization ng mga single-stranded na produkto ng PCR na may komplementaryong oligonucleotide - isang DNA probe na may label na biotin, na sinusundan ng pagtuklas gamit ang isang enzymatic na reaksyon sa pamamagitan ng, halimbawa, na nagbubuklod ng isang streptavidin-alkaline phosphatase conjugate sa biotin.

Batay sa ganitong uri ng pagtuklas, ang mga PCR analyzer ay nilikha kung saan ang pagtuklas ng mga resulta ng PCR ay awtomatikong isinasagawa bilang resulta ng pagbabasa ng optical density sa mga sample pagkatapos maganap ang enzymatic reaction.

Ang mga disadvantages ng mga pamamaraang ito ay kinabibilangan ng posibilidad ng intralaboratory contamination na may medyo maikling mga fragment ng DNA molecules. Kapag ang mga molekulang ito ay pumasok sa mga bagong pagsubok na sample, sila ay nagiging isang matrix para sa PCR at humahantong sa mga maling positibong resulta.

Kaugnay nito, upang maiwasan ang mga maling positibong resulta, ang mga mahigpit na panuntunan ay ipinakilala para sa paghihiwalay at paghihiwalay ng mga silid: para sa pagkuha ng DNA mula sa mga biological sample; mga silid para sa pagtuklas ng mga resulta (electrophoresis) mula sa malinis na sona. Ang mga silid na ito ay kumakatawan sa isang sona ng posibleng kontaminasyon. Ang isa pang nakahiwalay na zone ay isang malinis na silid para sa pagpasok ng mga sample ng DNA na pinag-aaralan sa mga test tube na may pinaghalong reaksyon para sa PCR. At sa wakas, ipinapalagay na ang pangunahing aparato - ang amplifier ng DNA - ay dapat dalhin sa isang hiwalay, posibleng opisina, silid.

Upang maiwasan ang kontaminasyon ng mga produkto ng mga nakaraang reaksyon - amplicons, ang ilang mga PCR test system ay naglalaman ng deoxynucleoside uridine sa halip na deoxynucleoside thymidine, na itinayo sa kaukulang posisyon sa panahon ng in vitro chain synthesis, ibig sabihin, ang nitrogenous base thymine na naroroon sa katutubong DNA ay pinalitan ng uracil. Ang Uracil DNA glycosylase na idinagdag sa pinaghalong reaksyon ng pinag-aralan na materyal ay sumisira lamang sa mga kontaminadong fragment na may deoxyuridine, ngunit hindi ang katutubong nasuri na DNA na naglalaman ng deoxythymidine. Ang kasunod na pag-init sa 94 ^o C ay inactivate ang enzyme na ito at hindi nakakasagabal sa amplification sa PCR.

Mayroong isang sistema ng pagsubok batay sa isothermal amplification ng rRNA, kung saan ang reverse transcription at synthesis ng mga molekula ng DNA ay unang ginanap. na kung saan ay ang matrix para sa kasunod na synthesis ng RNA molecules. Ang mga RNA amplicon ay nakita gamit ang isang acridine-stained DNA probe sa panahon ng hybridization sa isang reaction tube solution. Ang pamamaraang ito, bilang karagdagan sa mataas na sensitivity, ay may kalamangan sa pagsasagawa ng pagsusuri sa isang tubo, na pumipigil sa kontaminasyon. Ayon sa mga may-akda, ang sensitivity ng pamamaraang ito sa mga sample ng paghinga ay umabot sa 90% na may isang tiyak na 99-100%.

Ang mga bagong paraan ng pagtuklas ay ipinatupad sa real-time na PCR. Ang mga pamamaraang ito ay pangunahing naiiba sa PCR na iyon at ang pagtuklas ng mga resulta nito ay isinasagawa nang sabay-sabay sa isang saradong test tube. Ito ay hindi lamang teknolohikal na pinapasimple ang paraan ng pagsusuri, ngunit pinipigilan din ang kontaminasyon ng mga lugar ng laboratoryo at mga sample ng mga produkto ng nakaraang PCR.

Sa real-time na PCR, ang mga resulta ay nakita sa pamamagitan ng fluorescence na nagmumula sa hybridization ng isang fluorogenic DNA probe na may partikular na fragment ng DNA na pinalaki sa panahon ng PCR. Ang istraktura ng fluorogenic DNA probes ay itinayo sa paraang ang fluorescent marker ay inilabas bilang isang resulta ng isang enzymatic reaction o distansiya mismo mula sa fluorescence quencher molecule lamang sa partikular na hybridization na may nais na DNA molecule na pinalaki sa panahon ng PCR. Habang tumataas ang bilang ng mga molecule na na-hybrid sa probe, ang pagtaas ng fluorescence sa isang detectable level ay proporsyonal sa bilang ng mga molecule ng amplified na produkto. Dahil ang bilang ng mga molekula ng fragment ng DNA ay nadoble sa bawat cycle ng PCR, ang numero ng cycle kung saan natukoy at tumataas ang fluorescence ay inversely proportional sa bilang ng mga molekula ng DNA sa orihinal na sample. Kung ang ilang iba't ibang kilalang konsentrasyon ng mga molekula ng kaukulang fragment ng tuberculosis mycobacterium DNA ay ipinakilala sa reaksyon bilang isang calibrator, kung gayon ang bilang ng mga genome ng DNA sa materyal na pinag-aaralan ay maaaring kalkulahin gamit ang isang computer program.

Ang bawat karaniwang sample ay nadoble. Ang quantitative criterion ay ang pinakamababang bilang ng mga PCR cycle na kinakailangan para sa pagsisimula at paglaki ng detectable fluorescence. Ang abscissa axis ay ang bilang ng mga cycle; ang ordinate axis ay ang fluorescence value. Ang mga konsentrasyon ng DNA ay inversely proportional sa bilang ng mga cycle na kinakailangan para lumitaw ang fluorescence. Ang mga bintana sa kanang hanay (21-32) ay nagpapakita ng mga numero ng cycle para sa mga kaukulang konsentrasyon. Ang mga pagkakaiba sa pagitan ng 10-tiklop na konsentrasyon ng mga fragment ng DNA 10 ² -10 ⁶ ml ay 3.2-3.4 na mga cycle. Para sa dalawang pasyente, ang mga konsentrasyon ng mga fragment ng IS6110 ay humigit-kumulang 10 ³ / ml at 10 ⁴ / ml. Isinasaalang-alang ang bilang ng mga pag-uulit (6-20) ng nasuri na mga fragment sa genome ng Mycobacterium tuberculosis, ang bilang ng Mycobacterium tuberculosis sa mga klinikal na sample ay humigit-kumulang 100 at 1000 na mga cell, ayon sa pagkakabanggit.

Application ng PCR sa diagnosis ng tuberculosis

Ang paraan ng PCR ay ginagamit sa pinakadakilang lawak para sa mabilis na pagsusuri ng tuberculosis - pagtuklas ng Mycobacterium tuberculosis sa mga klinikal na sample: plema, bronchial washings, pleural exudate, ihi, cerebrospinal fluid, osteolysis punctures, aspirates ng babaeng genital tract at iba't ibang biopsy. Sa isang pag-aaral sa Holland ng humigit-kumulang 500 sample ng sputum at bronchial washings mula sa 340 pasyente na may kumpirmadong diagnosis ng pulmonary tuberculosis, pinag-aralan ang comparative sensitivity ng PCR, culture at smear microscopy na pamamaraan. Ang sensitivity ng pagsusuri ay 92.6, 88.9 at 52.4%, ayon sa pagkakabanggit. Ang pagtitiyak ng lahat ng mga pamamaraan ay tungkol sa 99%.

Ang isang paghahambing ay ginawa ng kahusayan ng pagtuklas ng Mycobacterium tuberculosis gamit ang smear microscopy, paghahasik sa Lowenstein-Jensen medium, ang VASTES test system at PCR analysis. Nagpakita ang PCR ng sensitivity ng 74.4%, microscopy - 33.8%, paghahasik sa solid medium - 48.9% at VASTES - 55.8%. Ang average na oras ng pagtuklas para sa paghahasik sa Lowenstein-Jensen medium ay 24 na araw. VASTES - 13 araw, PCR - 1 araw.

Ang potensyal para sa paggamit ng PCR bilang isang sensitibo at mabilis na paraan para sa pagsubaybay sa pagiging epektibo ng paggamot sa tuberculosis ay tinalakay din.

Ang pagtuklas ng Mycobacterium tuberculosis DNA sa pamamagitan ng PCR method na may epektibong chemotherapy ay tinutukoy sa mas mahabang panahon - sa average na 1.7 buwan kumpara sa bacterial excretion na tinutukoy ng fluorescent microscopy, at 2.5 buwan kumpara sa bacteriological examination.

Diagnosis ng extrapulmonary forms ng tuberculosis

Ang kahalagahan ng PCR bilang isang sensitibong pamamaraan ay lalong mahusay para sa mga extrapulmonary form, dahil tiyak sa mga form na ito na ang mga klinikal at radiological na pamamaraan at tradisyonal na bacteriological na pamamaraan para sa pagtukoy ng Mycobacterium tuberculosis sa mga diagnostic na materyales ay hindi epektibo.

Kapag sinusuri ang mga sample ng ihi, ang mga resulta ng pagsusuri ng PCR ay positibo sa 16 sa 17 mga pasyente na may aktibong tuberculosis ng sistema ng ihi at negatibo sa 4 na mga pasyente na may hindi aktibong renal tuberculosis at 39 na mga pasyente na may mga non-tuberculous na sakit ng sistema ng ihi.

Ang kahusayan ng pagsusuri ng PCR sa pag-aaral ng bone marrow aspirates sa mga pasyente na may lagnat ng hindi kilalang genesis na may pinaghihinalaang tuberculous na kalikasan ng sakit ay ipinakita. Para sa diagnosis ng tuberculous lymphadenitis sa mga bata, 102 puncture aspirates at biopsy sample ng 67 mga bata na may pinaghihinalaang tuberculous lymphadenitis ay pinag-aralan. Ang mga positibong resulta ay nakuha: sa pamamagitan ng real-time na PCR - 71.6%, fluorescence microscopy - 46.3%, pag-aaral ng kultura - 41.8%. Sa pag-aaral ng 50 lymph node biopsy sa mga pasyenteng may sakit na cat-scratch, lahat ng resulta ay negatibo. Kaya, ipinakita ang 100% na pagtitiyak ng pagsusuri sa PCR. Sa parehong gawain, ang posibilidad ng pag-detect ng M. avium ay ipinakita sa puncture biopsy ng mga lymph node.

Ang diagnosis ng female genital tuberculosis sa kawalan ng katabaan ay kilala bilang isa sa pinakamahirap na mga problema sa diagnostic. Ang mga positibong resulta ay nakuha sa mga pag-aaral ng PCR ng endometrial biopsies, endometrial aspirates, at Douglas pouch fluid sample sa 14 (56%) ng 25 na pasyente na sinuri ng laparoscopically na may pinaghihinalaang tuberculosis. Ang smear microscopy at pag-aaral sa kultura ay nagbunga ng 1 at 2 positibong resulta, ayon sa pagkakabanggit. Ang mga kasong ito ay positibo rin sa PCR. Karamihan sa mga resulta ng PCR-positive ay sa mga kaso na may katangiang katangian ng tuberculosis ayon sa histological examination; ang isang mas maliit na bilang ay sa mga kaso ng pinaghihinalaang tuberculosis ayon sa laparoscopy. Isang positibong resulta ng PCR lamang ang nakuha sa kawalan ng laparoscopic data para sa tuberculosis.

Kapag nag-diagnose ng extrapulmonary forms ng tuberculosis, ang mga clinician ay madalas na may tanong tungkol sa posibilidad na makilala ang pathogen kapag sinusuri ang mga sample ng dugo gamit ang PCR method. Ang data ng panitikan ay nagpapahiwatig na ang pagtuklas ng Mycobacterium tuberculosis DNA mula sa mga sample ng dugo ay posible sa mga advanced na anyo ng impeksyon sa HIV. Ang Mycobacterium tuberculosis DNA ay nakita lamang sa pangkalahatang tuberculosis ng iba't ibang mga organo sa mga pasyente na may transplanted na bato at immunosuppression.

[ 59 ], [ 60 ], [ 61 ], [ 62 ], [ 63 ]

Pagkilala sa mga species ng mycobacteria

Ang paraan ng PCR ay maaaring maging epektibo para sa mabilis na pagkilala sa mycobacteria ng tuberculosis complex at ilang uri ng non-tuberculous mycobacteria pagkatapos makuha ang kanilang pangunahing paglaki. Sa kasong ito, ang paggamit ng PCR ay maaaring makatipid ng 7-10 araw na kinakailangan para sa kasunod na kultural na pagkakakilanlan ng isang positibong resulta. Ang pag-aaral ng PCR ay teknikal na napakasimple, dahil hindi ito nangangailangan ng kumplikadong sample na paghahanda ng klinikal na materyal upang makamit ang mataas na sensitivity. Kapag sinusuri ang 80 positibong kultura sa naturang sistema ng pagsubok (MB BacT. ni Organon), ang lahat ng positibong resulta ng pagsusuri sa PCR ay mahigpit na partikular at isinagawa sa loob ng 1 araw. Upang matukoy ang iba pang mga uri ng mycobacteria kapag nakuha ang mga ito sa kultura, ang pathogen DNA ay na-hybrid sa mga partikular na DNA probes na may label na acridine, at ang mga strain ay nakita sa pamamagitan ng paglitaw ng chemiluminescence gamit ang isang chemiluminometer o sa nitrocellulose strips na may visual na pagtatasa pagkatapos ng hybridization. Tinutukoy ng kit na ito ang limitadong bilang ng mga species: Mycobacterium tuberculosis complex, M. avium, M. avium complex, M. kansasii, at M. gordonae.

A. Telenti et al. nakabuo din ng medyo simple at murang paraan para sa pagkilala sa mga species ng clinically important mycobacteria batay sa PCR at kasunod na paggamot na may dalawang restriction enzymes (mga enzyme na may kakayahang magputol ng molekula ng DNA sa mga partikular na punto). Sa kasong ito, ang isang fragment ng DNA na nag-encode ng heat shock protein (65 kDa) ay pinalaki, pagkatapos nito ang DNA fragment na nakuha sa PCR, 439 na mga pares ng nucleotide sa laki, ay ginagamot nang hiwalay sa dalawang enzyme - Bste II at Нае III. Pagkatapos, gamit ang agarose gel electrophoresis, ang dalawang produktong nakuha ay sinusuri, na tinutukoy ang kanilang mga sukat (bilang ng mga pares ng nucleotide) gamit ang isang hanay ng mga karaniwang fragment ng DNA (mga marker ng molekular ng DNA) mula 100 hanggang 1000 na mga pares ng nucleotide ang haba. Sa bawat isa sa mga tinukoy na species (M. tuberculosis, M. avium, M. intracellulare, M. kansasii, M.fortuitum) 2 o 3 mga fragment ng DNA na may iba't ibang laki ang matatagpuan para sa bawat restriction enzyme. Ang kumbinasyon ng mga nagresultang mga fragment ng DNA na may iba't ibang laki ay nagpapahintulot sa mga species na ito na maiiba sa bawat isa.

Isang teknolohiya para sa biological DNA microarrays ay binuo na makakatulong sa pagtukoy ng higit sa 100 species ng mycobacteria sa isang pag-aaral.

Ang pagkilala sa mga species ay maaari ding isagawa gamit ang PCR amplification ng variable na rehiyon ng 16S rRNA na sinusundan ng pagkakasunud-sunod ng mga amplicons kumpara sa kaukulang pangunahing istraktura, na nagpapahintulot sa pagkilala ng higit sa 40 species ng mycobacteria.

Maaari ding gamitin ang PCR upang matukoy ang mga species sa loob ng tuberculosis mycobacterium complex, kabilang ang pagkakaiba sa pagitan ng M. bovis at M. bovis BCG. Ginagawa ito sa pamamagitan ng pagsusuri sa presensya o kawalan ng ilang mga gene sa mga genomic na rehiyon na RD1, RD9, at RD10. Ang RD1 ay wala sa M. bovis BCG, ngunit naroroon sa virulent species, kabilang ang M. bovis.

Pagpapasiya ng pagiging sensitibo sa gamot ng Mycobacterium tuberculosis gamit ang PCR

Ang mga gawain ng molecular genetic na pamamaraan para sa pagtukoy ng sensitivity ng gamot o paglaban ng Mycobacterium tuberculosis ay binabawasan sa pagtukoy ng mga mutasyon sa ilang mga nucleotide sequence ng mga kilalang gene. Ang mga pangunahing pamamaraan ay batay sa alinman sa direktang pagbabasa (sequencing) ng mga sequence na ito pagkatapos ng amplification, o sa hybridization ng biotin-labeled na mga fragment ng DNA na pinalaki sa panahon ng PCR na may DNA probes. Ang parehong mga opsyon ay kinabibilangan ng pagtukoy ng mga pagpapalit sa mga nucleotide sequence na, kapag gumagamit ng DNA probes, ay humantong sa kawalan o hindi kumpletong hybridization sa isang nitrocellulose membrane gamit ang isang enzyme conjugate (streptavidin-alkaline phosphatase) - ang LIPA-Rif-TB na pamamaraan.

Ang paraan ng pagsukat ng fluorescence sa lokal na naayos na DNA probes sa mga microregion na komplementaryo sa mga kilalang mutasyon sa PCR-amplified gene region na responsable para sa sensitivity o resistensya ng gamot ay tinatawag na microbiochips method. Ang pangunahing algorithm para sa pagsasagawa ng pag-aaral na ito ay ang mga sumusunod. Pagkatapos na ihiwalay ang DNA sa isang klinikal na sample o mycobacterial culture, dapat isagawa ang PCR para palakihin ang kaukulang mga fragment ng groB gene na responsable para sa pagiging sensitibo ng gamot sa rifampicin, o ang katG at inhA na mga gene na nag-encode ng mga mycobacterial protein na responsable para sa pagiging sensitibo sa isoniazid. Ang mga resulta ng PCR ay tinasa gamit ang agarose gel electrophoresis, na nagpapatunay sa pagtanggap ng kaukulang mga fragment ng DNA ng nais na haba. Pagkatapos, ang isang 2nd round ng PCR ay ginanap upang ipasok ang isang fluorescent label sa DNA. Ang mga resulta ng PCR ay muling nakumpirma ng gel electrophoresis. Pagkatapos nito, ang hybridization ay isinasagawa (incubation overnight) na may kasunod na paghuhugas ng nakuha na materyal sa isang biochip, na kung saan ay isang malaking bilang ng mga maikling DNA chain (probes) na naayos sa isang maliit na glass plate, pantulong sa mga nucleotide sequence ng drug-sensitive na uri ng tuberculosis mycobacteria sa mga punto ng posibleng mutations. pati na rin sa mga mutant sequence na responsable para sa paglaban sa droga. Ang lokasyon ng DNA probes sa plato ay mahigpit na tinukoy, at ang antas ng fluorescence na sinusunod sa panahon ng hybridization para sa pagtukoy ng resulta gamit ang isang espesyal na aparato sa pagbabasa ay itinatag. Kaugnay nito, ang mga resulta ng pagsusuri ay tinutukoy gamit ang isang espesyal na programa sa computer.

Sa mga nakalipas na taon, ang mga alternatibong pamamaraan para sa pagtukoy ng sensitivity ng gamot ng Mycobacterium tuberculosis ay binuo batay sa real-time na teknolohiya ng PCR, na nagpapahintulot sa mga pag-aaral na ito na maisagawa sa isang closed test tube mode.

Ipinapakita ng Figure 13-13 ang resulta ng pagsusuri ng mga klinikal na kultura ng Mycobacterium tuberculosis sa pagtukoy ng paglaban sa gamot sa rifampicin gamit ang real-time na PCR: 218 - control sample (sensitibo sa rifampicin); 93 - positibong kontrol para sa Ser-Trp TCG-TGG mutation; 4482 - positibong kontrol para sa Ser-Leu TCG-TTG mutation; 162-322 - mga eksperimentong sample. Ang resulta ng pagkalkula ng kinetic curves ng amplification para sa 4 na channel: channel 1: 393 - positibong kontrol para sa Ser-Trp TCG-TGG mutation; channel 2: 4482 - positibong kontrol para sa mutation ng Ser-Leu TCG-TTG; 162, 163, 172, 295 - mga eksperimentong sample; channel 4: kinetic curves ng amplification ng lahat ng sample na kalahok sa eksperimento. Positibong kontrol ng reaksyon ng amplification. Mga konklusyon: Ang pagsusuri ay nagsiwalat ng mga sumusunod na mutasyon na tumutukoy sa paglaban sa rifampicin: sa mga sample na 162,163,172,295 - Ser-Leu TCG-TTG. Ang parehong prinsipyo ay ginamit upang matukoy ang paglaban sa gamot sa isoniazid ng katG at inhA na mga gene, na tumutukoy sa pinakamadalas na mutasyon.

[ 64 ], [ 65 ], [ 66 ], [ 67 ], [ 68 ], [ 69 ]

Pagkilala sa strain ng Mycobacterium tuberculosis

Ang pinaka-pinag-aralan na paraan ng strain identification ng Mycobacterium tuberculosis ay isang teknolohiyang tinatawag na restriction fragment length polymorphism (RFLP) at nakabatay sa fragmentation (restriction) ng Mycobacterium tuberculosis DNA ng enzyme Pvu II at kasunod na hybridization ng mga nakuhang fragment na may ilang partikular na sequence sa DNA10 ng paulit-ulit na elemento nito na IS61. Naisasakatuparan ang intraspecific na pagkakaiba-iba dahil sa iba't ibang bilang ng pag-uulit ng IS6110 at ang kanilang lokasyon sa DNA, pati na rin ang pagkakaiba-iba ng mga distansya sa pagitan ng ilang partikular na punto ng pag-atake ng restriction enzyme (restriction site) at ng elemento ng IS6110. Ang teknolohiyang ito ay napaka-kumplikado at labor-intensive. Matapos gamutin ang DNA na nakahiwalay mula sa tuberculosis mycobacterium culture na may restriction enzyme, ang gel electrophoresis ay ginaganap, pagkatapos ay ang mga fragment ng DNA na may iba't ibang haba ay inilipat sa isang nitrocellulose membrane, na na-hybrid sa mga fragment ng elementong IS6110, at ang mga resulta ay nakita gamit ang isang reaksyong enzymatic. Ang resultang tiyak na pattern ng banda ay nagpapakilala sa DNA ng isang partikular na tuberculosis mycobacterium strain. Ang pagsusuri sa computer ay nagpapakita ng pagkakakilanlan o kaugnayan ng mga strain. Sa kabila ng katotohanan na ang pamamaraan ng RFLP ay ang pinaka-diskriminado, ibig sabihin, ito ay nagpapakita ng pinakamalaking bilang ng mga pagkakaiba sa nasuri na mga strain, ito ay hindi epektibo sa isang maliit na bilang (mas mababa sa 5) ng IS6110 na pag-uulit, na naobserbahan sa ilang mga strain. Ipinapakita ng mga figure 13-14 ang mga resulta ng pag-type ng RFLP ng mga strain.

Ang isang kahalili ay maaaring ang paraan ng spoligotyping - pagsusuri ng polymorphism ng mga sequence ng spacer DNA - intermediate sa pagitan ng direktang pag-uulit ng rehiyon ng DR. Kapag nagsasagawa ng spoligotyping ng mga strain, ang PCR ay isinasagawa gamit ang mga primer na nililimitahan ang rehiyon ng DR, pagkatapos kung saan ang mga fragment ng iba't ibang haba ay nabuo, na nag-hybrid sa variable na intermediate na mga rehiyon ng DNA. Ang pagsusuri sa mga pagkakasunud-sunod ng spacer ng rehiyon ng DR ay tila, ayon sa mga mananaliksik, mas simple, mas produktibo at angkop para sa pangunahing pag-screen ng mga strain at paunang pagsusuri ng epidemiological, gayundin para sa direktang pag-aaral ng klinikal na materyal.

Malinaw, ang isang mas epektibo at teknolohikal na naa-access na paraan ay ang VNTR (pagpapaikli ng mga salitang Ingles), o ang paraan ng pagtukoy sa variable na bilang ng eksaktong pag-uulit ng tandem sa DNA ng mycobacterium tuberculosis. Ang pamamaraang ito ay batay lamang sa paggamit ng PCR at hindi nangangailangan ng karagdagang mga manipulasyon. Dahil ang bilang ng mga pag-uulit ng tandem sa iba't ibang mga strain at sa iba't ibang loci ay iba, ang mga fragment ng iba't ibang laki ay tinutukoy at sinusuri sa nagresultang electrophoregram ng mga produkto ng PCR. Ayon sa mga mananaliksik, sa tulong ng VNTR, ang isang mas malaking antas ng diskriminasyon ng mga strain ay nakakamit kaysa sa paraan ng RFLP.

Malaking atensiyon ang ibinibigay sa mga nakalipas na taon sa pagkalat ng mga strain ng Mycobacterium tuberculosis ng pamilyang W-Beijing (minsan ay tinatawag na Beijing strain), na higit sa lahat ay lumalaban sa droga.

Mga pangunahing kinakailangan para sa kalidad ng molekular na biological na pananaliksik

[ 70 ], [ 71 ], [ 72 ], [ 73 ]

Mga pangunahing dokumento ng regulasyon para sa pagsasagawa ng PCR

Mga Order ng Ministry of Health ng Russian Federation: No. 45 ng 7.02.2000; 109 ng 21.03.2003; No. 64 ng 21.02.2000. Mga Alituntunin: 1.3.1888-04 "Organisasyon ng trabaho sa panahon ng pananaliksik sa PCR ng materyal na nahawaan ng mga pathogen biological na ahente ng mga pangkat ng pathogenicity ng III-IV"; 1.3.1794-03 "Organisasyon ng trabaho sa panahon ng pananaliksik sa PCR ng materyal na nahawaan ng mga microorganism ng I-II pathogenicity group". 2003; 3.5.5.1034-01 "Pagdidisimpekta ng materyal sa pagsubok na nahawaan ng bakterya ng mga pathogenicity group I-IV kapag nagtatrabaho sa paraan ng PCR", 2001. Appendix 11 sa Mga Tagubilin sa pinag-isang pamamaraan ng microbiological na pananaliksik sa pagtuklas, pagsusuri at paggamot ng tuberculosis.

[ 74 ], [ 75 ], [ 76 ]

Mga tauhan

Molecular biological na pag-aaral ay maaaring isagawa ng clinical laboratory diagnostics na mga doktor, bacteriologist, virologist, clinical diagnostic laboratory biologist, pati na rin ang mga espesyalista na may pangalawang medikal na edukasyon na sumailalim sa espesyalisasyon at advanced na pagsasanay sa itinatag na paraan.

Pag-aayos ng mga lugar ng laboratoryo

Ang mga sumusunod na pasilidad sa laboratoryo ay kinakailangan:

• Sample processing area - isang laboratoryo na inangkop para sa pagtatrabaho sa mga nakakahawang ahente ng pathogenicity group III-IV, alinsunod sa Methodological Guidelines 13.1888-04.
• Ang lugar para sa paghahanda ng PCR reaction mixtures ay isang laboratory room na nagbibigay ng proteksyon mula sa panloob na kontaminasyon ng laboratoryo - isang "malinis" na lugar.
• • Kung ang electrophoresis o hybridization ay ginagamit upang pag-aralan ang mga produkto ng PCR, ang silid ng laboratoryo kung saan ang mga amplified na fragment ng DNA ay kinukuha mula sa amplification tube at, nang naaayon, ay maaaring makapasok sa kapaligiran, alinsunod sa mga kinakailangan para sa mga PCR laboratories (Methodological Guidelines 1.3.1794-03, Methodological Guidelines 1.3.18888-0. Ang paggalaw ng anumang tauhan, kagamitan, anumang materyales at bagay mula sa lugar ng electrophoresis patungo sa lugar ng pagpoproseso ng sample at sa lugar na "malinis", pati na rin ang paglipat ng hangin sa pamamagitan ng sistema ng bentilasyon o bilang resulta ng mga draft, ay dapat na hindi kasama. Ang lugar na ito ay hindi kinakailangan para sa fluorimetric detection ng mga produkto ng PCR.
• Ang silid para sa dokumentasyon at pagproseso ng mga resulta ay nilagyan ng mga computer at mga kinakailangang kagamitan sa opisina. Ang silid na ito ay maaaring maglaman ng kagamitan na nagsisiguro ng pagtuklas ng mga produkto ng PCR nang hindi binubuksan ang tubo. - mga fluorescent PCR detector at thermal cyclers para sa real-time na PCR.

Ang mga kinakailangan sa sanitary at epidemiological para sa pangunahing pagproseso ng plema ay katulad ng karaniwang mga kinakailangan sa microbiological para sa pagtatrabaho sa Mycobacterium tuberculosis.

[ 77 ], [ 78 ], [ 79 ], [ 80 ]

Kumpletong set ng laboratory equipment para sa PCR diagnostics

Kasama sa laboratory kit ang kagamitan para sa mga sumusunod na silid.

• sample preparation room, naglalaman ng mga sumusunod na kagamitan: laminar flow hood ng proteksyon class II "SP-1.2": solid-state thermostat na may heated lid para sa Eppendorf test tubes; microcentrifuge sa 13,000 rpm; centrifuge ("Vortex"); refrigerator na may saklaw ng temperatura mula -20 ^° C hanggang +10 ^° C; variable volume pipettes ng seryeng "Proline"; pump gamit ang isang trap flask OM-1; rack ng pipette; work station rack 200x0.5 ml; work station rack 50x1.5 ml; rack para sa pag-iimbak ng mga test tube 80x1.5 ml;
• reaction mixture paghahanda room: protective chamber PCR box ("Laminar-C. 110 cm); centrifuge "Vortex"; variable volume pipettes ng "Proline" series; pipette rack; workstation rack 200x0.2 ml; rack para sa pag-iimbak ng mga test tubes 80x1.5 ml; refrigerator na may saklaw ng temperatura mula -20 ^° C hanggang +10 ^° C;
• Electrophoresis room: pahalang na electrophoresis chamber; pinagmumulan ng kuryente; transilluminator;
• DNA amplifier o nucleic acid analyzer (real-time PCR) na may computer at software; maaaring ilagay sa anumang magagamit na silid. Kung gagamitin ang real-time na teknolohiya ng PCR, hindi kailangan ang isang electrophoresis room.

[ 81 ], [ 82 ], [ 83 ], [ 84 ]

Panlabas na kontrol sa kalidad

Upang matiyak na nakakakuha sila ng tunay na maaasahang mga resulta, ang mga laboratoryo ay dapat lumahok sa isang sistema ng panlabas na pagtatasa ng kalidad ng pananaliksik sa laboratoryo.

Ang mga kalahok sa quality control system ay tumatanggap ng: 12 ampoules na may lyophilized suspensions ng bacterial cells, dalawa sa mga ito ay naglalaman ng E. coli, 3 ampoules na may tuberculosis mycobacteria (avirulent strain) sa konsentrasyon na 10 ² /ml; 3 ampoules na may mga cell ng isang katulad na strain sa isang konsentrasyon ng 10 ⁴ /ml; 2 ampoules bawat isa ay may non-tuberculous mycobacteria M. avium-intracellulare at M. kansasii sa isang konsentrasyon ng 10 ⁵ /ml.

Ang mga pagsusulit na ipinadala para sa panlabas na pagtatasa ng kalidad ay paunang sinubok sa dalawang independyenteng laboratoryo na may malawak na karanasan sa larangang ito.

[ 85 ], [ 86 ]