Laboratory diagnosis ng tuberculosis

Ang tuberculosis ay isang sakit na madaling ma-diagnose sa mga modernong kondisyon at pang-agham na tagumpay. Ang diagnosis ng laboratoryo ng tuberkulosis ay mahalaga sa iba pang mga diagnostic na pamamaraan, pangalawa lamang sa mga pamamaraan ng pananaliksik ng X-ray.

[1], [2], [3], [4],

Pagsusuri ng klinikal na dugo

Mga pasyente na may tuberculosis pagbabago sa pangkalahatang pagsusuri ng dugo ay hindi pathognomonic. Na may limitadong at hindi aktibo paraan ng tuberculosis hypochromia katangian ng erythrocytes sa kanilang normal na dami. Kapag napakalaking infiltrates o caseous pneumonia, habang pagkalat ng caseous lymphadenitis, tiyak na bituka lesyon, pati na rin para sa mga malalaking baga o postoperative dumudugo at note erythropenia microcytosis, oligohromaziyu, polihromaziyu. Macrocytosis, at kahit na higit pa poikilocytosis magkano rarer, karaniwan na may malubhang anemia. Bilang ng reticulocytes sa step tuberculosis bayad saklaw 0.1-0.6%, na may subcompensated - 0.6-1.0% at 1% ay nailalarawan sa pamamagitan decompensated reticulocytes.

Kapag tuberculosis sa ilang mga kaso maaaring may katamtamang leucocytosis (hanggang sa 15 thousand ng mga leukocytes.), Mas mababa radiation, na nagaganap sa 2-7% ng mga pasyente na may limitado at madaling proseso na nagaganap forms at sa 12.5% - sa pamamagitan ng mapanira at progresibong baga tuberculosis .

Ang pinaka-madalas na shift ay nagaganap sa leukocyte formula. Markahan ang parehong kamag-anak at absolute neutrophilia, isang katamtamang paglilipat ng formula ng leukocyte sa kaliwa bago promyelocytes. Ang mga Myelocytes ay napakabihirang sa kaso ng di-komplikadong tuberculosis. Ang pagtaas ng bilang ng mga neutrophils na may abnormal na butil sa mga pasyente haemogram TB palaging nagpapahiwatig ng tagal ng proseso: sa mga pasyente na may malubhang tuberkulosis halos lahat ng neutrophils naglalaman abnormal grain. Kapag tumigil ang pag-aalsa ng tubercular, ang normal na paglilipat ng nuclear ay medyo madali. Ang pathological granularity ng neutrophils karaniwang nagpatuloy na mas mahaba kaysa sa iba pang mga pagbabago sa hemogram.

Ang nilalaman ng eosinophils sa paligid ng dugo ay nag-iiba rin depende sa bahagi ng proseso at ang allergic na estado ng organismo. Ang kanilang halaga ay bumababa sa aneosinophilia sa malubhang at pinahaba na paglaganap ng sakit at, sa kabaligtaran, ay nagdaragdag na may resorption ng mga infiltrate at pleural effusion, pati na rin sa mga naunang paraan ng pangunahing tuberculosis.

Karamihan sa mga uri ng pangunahing tuberculosis ay sinamahan ng lymphopenia, kung minsan ay sinusunod para sa isang bilang ng mga taon, kahit na pagkatapos ng pagkakapilat ng mga tiyak na pagbabago. Ang pangalawang tuberculosis sa phase of exacerbation, depende sa kalubhaan ng proseso, ay maaaring sinamahan ng alinman sa isang normal na bilang ng mga lymphocytes, o lymphopenia.

Ito ay sumasakop sa isang espesyal na lugar sa pagtukoy ng erythrocyte sedimentation rate Karagdagang mga pagsubok upang suriin sakit na tuyo proseso (ESR) pagkakaroon ng isang halaga sa evaluate ang daloy tuberculosis proseso at pagkilala sa kanyang aktibong form. Pagtaas sa ESR ay nagpapahiwatig ng pagkakaroon ng pathological proseso (nakahahawang-namumula, suppurative naimpeksyon, hemoblastosis, Hodgkin et al.) At ay nagpapakilala ng kanyang kalubhaan, ngunit normal na mga antas ng ESR hindi laging nagpapahiwatig ng kawalan ng patolohiya. Acceleration ng erythrocyte sedimentation magbigay ng kontribusyon sa isang pagtaas sa mga antas ng dugo ng globulin, fibrinogen, kolesterol, at bawasan ang lapot ng dugo. Slow erythrocyte sedimentation katangian ng mga kondisyon sinamahan haemoconcentration, pagdaragdag ng nilalaman ng mga puti ng itlog at apdo acids.

Ang hemogram sa mga pasyente na may tuberculosis ay nagbabago sa panahon ng paggamot. Hematologic shifts nawawala ang mas mabilis, mas matagumpay ang panterapeutika interbensyon. Gayunman, dapat isaisip ng isa ang epekto sa hemopoiesis ng iba't ibang mga antibacterial na gamot. Kadalasan sila ay nagiging sanhi ng eosinophilia, sa ilang mga kaso - leukocytosis, at mas madalas leukopenia hanggang sa agranulocytosis at lymphoid-reticular reaction. Ang sistematikong hematological control at tamang pagtatasa ng nakuha na data ay mahalaga para sa pagtatasa ng klinikal na kalagayan ng pasyente, ang dynamics ng proseso at ang pagiging epektibo ng paggamot na ginamit.

[5], [6], [7], [8], [9],

Klinikal na pagsusuri ng ihi

Sa tuberkulosis ng sistema ng ihi, ang urinalysis ang pangunahing pamamaraan ng diagnostic laboratoryo. Maaari mong obserbahan ang leukocyturia, erythrocyturia, proteinuria, hypoisostenuria, tuberculosis mycobacterium, nonspecific bacteriuria.

Leucocyturia - ang pinaka-karaniwang sintomas ng tuberculosis ng urinary system na bago ang chemotherapy at walang tiyak na lamang sa pambihirang mga kaso, tulad ng kumpletong pagwawasak ng lumen ng yuriter. Nechyporenko test (pagpapasiya ng ang bilang ng mga leucocytes sa 1 ML ng ihi) ay tumutulong upang mas objectively masuri ang antas leukocyturia nefrotuberkuloze sa, at sa ilang mga kaso upang makilala ang mga ito sa normal na urinalysis. Gayunpaman, dapat itong isaalang-alang na ang leukocyturia ay maaaring mangyari sa talamak at talamak na pyelonephritis, cystitis, urethritis, bato at yuriter.

Erythrocyturia. Pati na rin ang leukocyturia. Ay itinuturing na isa sa mga madalas na palatandaan ng laboratoryo ng tuberculosis ng genitourinary system. Ang dalas ng hematuria ay nakasalalay sa pagkalat ng proseso, ito ay nagdaragdag habang ang mapangwasak na proseso ng tuberculosis ay lumalabas sa bato. Ang Erythrocyturia na walang leukocyturia ay mas karaniwan para sa maagang yugto ng bato tuberculosis. Ang Hematuria, na namamayani sa paglipas ng leukocyturia, ay isang mahalagang argumento na pabor sa kidney tuberculosis sa pagkita ng kaibhan sa walang pyelonephritis.

[10], [11], [12], [13], [14], [15], [16],

Pagsusuri ng dugo ng biochemical

Sa tuberkulosis, ang mga pagbabago sa ilang mga biochemical parameter ay nakasalalay lalo na sa yugto ng proseso, mga komplikasyon at iba't ibang mga magkakatulad na sakit. Sa mga pasyente na may hindi aktibo na tuberculosis ng baga at iba pang mga organo, ang kabuuang protina at protina na mga fraction ng suwero ng dugo ay hindi nabago at tinutukoy ang kanilang normal na nilalaman.

Sa talamak na mga anyo ng sakit, pati na rin sa paglala at paglala ng mga malalang mga porma ng tuberculosis, bumababa ang koinenyong albumin-globulin.

Mahalaga sa pagtatasa ng functional estado ng organic pinsala at atay sa tuberculosis at mga komplikasyon nito ay ang pagpapasiya ng suwero kabuuang at direktang bilirubin, AST (ACT), alanine aminotransferase (ALT). Dynamic na pagpapasiya ng antas ng aminotransferases. Bilirubin sa paggamot ng tuberculosis pasyente, lalo na sa mga malubhang mga form, - isang ipinag-uutos na bahagi ng biochemical pagsusuri ng mga pasyente na may tuberculosis at ay isinasagawa sa isang buwanang batayan.

Ang pagtatasa ng pagganap na kalagayan ng mga bato ay kinabibilangan ng pagpapasiya ng serum creatinine at pagkalkula ng glomerular filtration rate ayon sa formula ng Cockcroft-Gault. Ang pagkalkula ng glomerular filtration rate gamit ang sample ni Reberg ay nagbibigay ng mas tumpak na mga resulta.

Ang pangunahing layunin ng mga dynamic na biochemical na pag-aaral ng mga pasyente ng tuberkulosis ay upang masubaybayan ang kurso ng proseso, napapanahon na pagtukoy ng mga epekto ng mga droga at sapat na pagwawasto ng mga nagresultang mga karamdaman sa homeostatic.

[17], [18], [19]

Paggamit ng biochemical methods ng pagsisiyasat sa extrapulmonary tuberculosis

Ang pinaka-nakapagtuturo tagapagpahiwatig ay ang nilalaman ng tuberculostearic acid sa biological fluids, ngunit ang kahulugan nito ay nauugnay sa mga teknikal na problema (ang pangangailangan para sa gas chromatography at mass spectrometry).

Prospective measurement ng aktibidad ng adenosine deaminase - isang enzyme, tinutukoy sa mga likido: synovial, pericardial, ascitic o spinal. Ang mga pangunahing producer ng adenosine deaminase ay mga lymphocytes at monocytes. Pagpapasiya ng adenosine deaminase aktibidad sa biological fluids pinapadali ang diagnosis ng sakit na tuyo synovitis, tuberculosis sa mga lymph nodes, sakit na tuyo meningitis, sakit na tuyo serozity.

Ang ilang mga tagapagpahiwatig ng biochemical dahil sa kanilang hindi pagkakapantay ay tinutukoy lamang sa mga biological fluid, malapit sa focus ng sugat. Sukatin ang antas ng mga tagapagpahiwatig bilang tugon sa subcutaneous o intradermal na iniksyon ng tuberculin (karaniwang bago at 48 at 72 oras pagkatapos nito). Pagkatapos nito, ang antas ng pagdagdag ng antas ng marker (sa%) ay kinakalkula alinsunod sa unang antas.

Ang pinakamainam na pagpapasiya sa ihi ng aktibidad ng isang organ-tiyak na enzyme ng transamnidase, ang hitsura nito ay nakasaad sa pagkatalo ng mga bato ng iba't ibang kalikasan. Ang pag-aaral ng transamidinase ay makatwiran lamang sa ilalim ng mga kondisyon ng subcutaneous injection ng tuberculin upang palalain ang lokal na proseso ng pamamaga. Tukuyin ang aktibidad ng transamidine sa ihi sa una at 24-72 oras matapos ang pagpapakilala ng 50 TE tuberculin. Ang pagpapalaki ng fermentia sa loob ng 2 beses at higit pa ay nagbibigay-daan sa 82% ng mga kaso upang iibahin ang aktibong tuberkulosis ng mga bato mula sa paglala ng talamak na pyelonephritis.

Sa tuberkulosis ng mga babaeng genital organ, ang mga konsentrasyon ng haptoglobin at malonic dialdehyde sa dugo ay natutukoy sa mga kondisyon ng isang nakakapagod na test tuberculin. Subcutaneously injected tuberculin sa isang dosis ng 50 TE at 72 oras mamaya gumanap ng isang pangalawang biochemical pag-aaral. Sa kaso ng etiology ng tuberkulosis, ang antas ng pagtaas sa antas ng haptoglobin ay hindi mas mababa sa 28%, at ang antas ng malondialdehyde ay 39% o higit pa. Ang pagpapasiya ng aktibidad ng adenosine deaminase sa isang peritoneal fluid na nakuha mula sa puwang ng Douglas ay ginagamit din. Ang punctate ay muling sinusuri 72 oras pagkatapos ng intradermal injection ng tuberculin sa dosis ng 0.1 TE at 0.01 TE sa projection ng internal genital organs sa anterior tiyan wall. Sa pabor sa proseso ng tuberculosis, ang pagtaas sa aktibidad ng adenosine deaminase ay 10% o higit pa kumpara sa una.

Kapag ang mata ay apektado, ang focal reaksyon na nangyayari sa mata bilang tugon sa antigenic stimulation ay napagmasdan. Ito ay hindi kanais-nais upang bumuo ng isang malinaw na tugon, sinamahan ng isang pagbawas sa visual na mga function. Dahil ang pagtatasa ng minimal na focal reaksyon ay madalas na mahirap, para sa pagpapasya ng konklusyon na ito ay inirerekomenda upang mag-orient sa kahanay at sa antas ng paglago sa serum ng dugo ng haptoglobin o adenosine deaminase.

Ang lahat ng mga biochemical na pag-aaral ay kailangang isagawa kasabay ng iba pang mga pamamaraan.

[20], [21], [22], [23],

Pagsusuri ng sistema ng pamumuo ng dugo

Kaugnayan ng katayuan ng pananaliksik sa dugo clotting sistema ng TB ay sanhi sa pamamagitan ng pagkakaroon ng isang bilang ng mga pasyente na may baga tuberculosis haemoptysis o ng baga paglura ng dugo, pati na rin ang hemocoagulation komplikasyon sa kirurhiko paggamot ng tuberculosis. Sa karagdagan, natural na may kaugnayan TB latently dumadaloy intravascular hemocoagulation impluwensya ang kurso ng sakit at ang pagiging epektibo ng chemotherapy.

Sa mga pasyente na may baga TB pagkalat ng exudative pamamaga bahagi ng naobserbahang tanggihan sa dugo anticoagulation aktibidad. Sa mga pasyente na may isang mababang pagkalat ng isang tiyak na sugat sa baga na may isang pamamayani ng mga produktibong hemocoagulation intravascular namumula component ipinahayag nang bahagya. Sa mga pasyente na may baga tuberculosis na may hemoptysis at baga dugo ng estado dugo clotting sistema ay naiiba: sa mga pasyente na may mababang pagkawala ng dugo sa gemoptoe taas o kaagad pagkatapos nito pagwawakas doon ay isang matalim na pagtaas sa dugo pagkakulta kakayahan dahil sa matinding pag-igting ng trombinoobrazovaniya habang pinapanatili ang mas "structural" clotting. Sa mga pasyente na may napakalaking pagkawala ng dugo sinusunod pagbaba clotting potensyal na sa kapinsalaan ng ang pagbaba ng konsentrasyon ng fibrinogen. Aktibidad ng XIII, bilang ng platelet. Sa yugto ng kirurhiko paggamot sa mga pasyente na may limitadong paraan ng baga tuberculosis may makabuluhang mga paglabag ng sistema homeostasis nangyayari. Mga pasyente na may laganap na proseso sa pagpapatupad ng pnevmon- o plevropnevmonektomii madalas na bumuo ng DIC, na maaaring tumagal ang form ng "pangalawang sakit."

Upang masubaybayan ang estado ng pamumuo ng dugo sa mga pasyente na may dapat na natupad sa pulmonary tuberculosis pagpapasiya ng activate bahagyang oras thromboplastin (aPTT), fibrinogen, thrombin oras, prothrombin index at dumudugo oras at clotting oras.

[24], [25], [26], [27], [28]

Hormonal research

Ang mga modernong eksperimentong pang-eksperimentong at klinikal na obserbasyon ay nagpapahiwatig ng pagkakaroon ng mga pagbabago sa katayuan ng hormonal sa isang partikular na pamamaga ng tuberculous lung. Ito ay pinatunayan na ang pagwawasto ng dysfunction ng ang pitiyuwitari-adrenal, pitiyuwitari-teroydeo system at pancreatic function na kaugnay sa anti-TB therapy mag-ambag sa pag-activate ng fibrogenesis at repair sa isang locus tiyak na pamamaga.

Ang functional estado ng pitiyuwitari-teroydeo sistema ay hinuhusgahan ng nilalaman sa suwero ng dugo ng triiodothyronine (T ₃ ), thyroxine (T ₄ ), pitiyuwitari teroydeo stimulating hormon (TSH). Ito ay natagpuan na subclinical hypothyroidism ay nakita sa 38-45% ng mga pasyente na may baga tuberculosis, at pinaka-madalas na ito ay na-diagnosed na may disseminated at fibro-maraming lungga anyo proseso. Sa ilalim ng mga katulad na mga form pinaka-kapansin-pansing nabawasan ang mga antas ng parehong T ₃ at T ₄, at doon ay isang kawalan ng timbang ng mga hormones sa anyo ng pagtaas ng ratio ng T ₄ / T _s.

Adrenocortical function ay sinusuri sa pamamagitan ng mga antas ng cortisol sa suwero ng dugo, at Endocrine function ng pancreas - konsentrasyon ng immuno-reactive insulin. Sa talamak na bahagi ng nakahahawang sakit, ang pangangailangan para sa endogenous cortisol at insulin ay tumataas. Nagpapatunay din ang hyperinsulinemia sa paglaban ng insulin ng mga tisyu ng katawan, na tipikal para sa anumang aktibong proseso ng nagpapasiklab, sa partikular, tiyak. Pagpapasiya glyukokortiko idnoy-adrenal function na may aktibong tuberculosis ay ipinapakita ang pagkakaroon ng Cushing sa karamihan ng mga pasyente. Normal na antas ng cortisol konsentrasyon dugo sa mga pasyente na may nakahahawang pamamaga sa talamak na yugto ay dapat na itinuturing bilang kamag-anak kabiguan ng glucocorticoid-andar ng adrenal cortex na maaaring magsilbi bilang isang batayan para sa may hawak na dosis ng sapat na kapalit na therapy ng glucocorticoids.

Halos isang third ng mga pasyente na may baga tuberculosis ay maaaring itinatag na ang antas ng Ince-lin ay may lubos na mababa at malapit sa mas mababang limitasyon ng normal, habang ang 13-20% ay nakaranas ng isang makabuluhang hyperinsulinism. Ang parehong kamag-anak hypo- at hyperinsulinism ay mataas na panganib na kadahilanan para sa pag-unlad ng mga paglabag sa karbohidrat metabolismo ng iba't ibang degree. Ang mga pagbabagong ito sa functional activity ng B cells ng pancreas ay nangangailangan ng regular na pagmamanman ng glycemia sa mga pasyente na may tuberculosis at napapanahong pag-iwas sa diabetes mellitus. Bilang karagdagan. Ito ay nagsisilbing isang karagdagang pagbibigay-katwiran para sa kapaki-pakinabang na paggamit ng physiological doses ng insulin sa komplikadong therapy ng tuberculosis.

Sa pangkalahatan, mas mababang mga antas ng teroydeo hormones at ang kanilang kawalan ng timbang hypercortisolemia at hyperinsulinism pinakadakilang pag-abot sa mga pasyente na may malubhang kurso ng tisis proseso, na may malawak na pinsala sa baga at malubhang mga sintomas ng tuberculosis pagkalasing.

Microbiological diagnosis ng tuberculosis

Microbiological aaral ay kinakailangan sa pagkilala ng mga pasyente na may tuberculosis, pag-verify ng diagnosis, pagsubaybay at chemotherapy pagwawasto evaluate paggamot kinalabasan, sa ibang salita, dahil ang registration ng mga pasyente tuberculosis bago alisin ito mula sa Registry.

Ang lahat ng mga programa at proyekto ng epidemiological ay batay sa isang pagtatasa ng bilang ng mga bacterial excretors, na hindi maaaring gawin nang hindi gumagamit ng mga pamamaraan sa laboratoryo upang makita ang mycobacteria tuberculosis. Sa isang survey ng tinatawag na di-organisadong populasyon, ang porsyento ng mga bakteryang invaders ay umabot sa 70 o higit pa, na gumagawa ng mga pamamaraan ng laboratoryo ng sapat na epektibong paraan ng pagtukoy ng mga pasyente ng tuberkulosis sa grupong ito ng populasyon.

Ang mga tradisyonal na pamamaraan sa microbiological para sa diagnosis ng tuberculosis ay bacterioscopic at cultural studies. Ang mga modernong pamamaraan ay nagpapakita ng paglilinang ng mycobacterium tuberculosis sa mga automated system, ang setting ng PCR. Gayunpaman, ang lahat ng mga pamamaraan na ito ay kinakailangang pagsamahin sa klasikal na pamamaraan ng bacteriological.

Koleksyon ng diagnostic na materyal

Ang pagiging epektibo ng mga pag-aaral ng laboratoryo ay nakasalalay sa isang malaking lawak sa kalidad ng materyal na diagnostic. Ang pagsunod sa mga patakaran para sa pagkolekta, imbakan at transportasyon ng diagnostic na materyal at ang eksaktong pagpapatupad ng algorithm sa pagtatasa ng pasyente ay direktang nakakaapekto sa kinalabasan at nagsisiguro ng kaligtasan ng biological.

Para sa pagsubok sa tuberculosis, iba't ibang materyales ang ginagamit. Dahil sa ang katunayan na TB logkih- pinaka-karaniwang anyo tisis lesyon, ang pangunahing materyal para sa pananaliksik isaalang-alang ang plema at iba pang mga uri ng nababakas tracheobronchial: upper respiratory tract secretions nakuha pagkatapos ng erosol paglanghap: bronchial washings; bronchoalveolar rinses; materyal na nakuha sa pamamagitan ng bronchoscopy, at intrapulmonary transtracheal biopsies mula sa bronchial aspirates, laryngeal swabs, exudates mula sa mga sugat at smears al.

Ang pagiging epektibo ng pananaliksik ay nagdaragdag kung ang isang kinokontrol na koleksyon ng materyal mula sa isang pasyente ay isinasagawa. Para sa layuning ito, ang isang espesyal na gamit na kuwarto ay inilalaan o mga espesyal na taksi ay binili. Ang koleksyon ng materyal ay isang mapanganib na pamamaraan, samakatuwid ito ay kinakailangan upang mangolekta ng materyal para sa pananaliksik, pagmamasid sa mga patakaran ng nakahahawang kaligtasan.

Ang materyal para sa pagsusuri sa mycobacterium tuberculosis ay nakolekta sa sterile bote na may mahigpit na screwed caps upang maiwasan ang kontaminasyon ng kapaligiran at protektahan ang nakolektang materyal mula sa kontaminasyon.

Ang mga vial para sa pagkolekta ng diagnostic na materyal ay dapat matugunan ang mga sumusunod na kinakailangan:

• ay dapat gawin ng materyal na hindi nakakaapekto sa epekto;
• ay dapat madaling matunaw sa panahon ng autoclaving;
• maging sapat na dami (40-50 ML):
• magkaroon ng isang malawak na pambungad para sa koleksyon ng dura (diameter hindi mas mababa sa 30 mm);
• maging madali upang mahawakan, transparent o translucent, upang masuri mo ang dami at kalidad ng sample na nakolekta nang hindi binubuksan ang talukap ng mata.

Upang makuha ang pinakamainam na resulta ng pananaliksik, dapat na sundin ang mga sumusunod na kondisyon:

• Kolektahin ang materyal bago magsimula ang chemotherapy;
• Ang materyal para sa pag-aaral ay dapat na kolektahin bago umaga ang paggamit ng pagkain at gamot;
• para sa pananaliksik ito ay kanais-nais upang mangolekta ng hindi bababa sa 3 mga halimbawa ng umaga plema. Ipunin ang plema para sa 3 magkakasunod na araw;
• ang nakolekta na materyal ay dapat maihatid sa laboratoryo sa lalong madaling panahon:
• sa kaso kung saan ito ay imposible agad upang maihatid ang materyal sa laboratoryo, ito ay nakaimbak sa refrigerator sa temperatura ng hangin na 4 ° C para sa hindi hihigit sa 48 oras;
• Kapag transporting ang materyal, kinakailangan upang masubaybayan ang integridad ng mga vials.

Ang totoong nakolekta na plema ay mauhog o mucopurulent. Ang pinakamainam na dami ng sinubukan na plema ay 3-5 ml.

Ang kastanyas ay nakolekta sa ilalim ng pangangasiwa ng isang medikal na propesyonal. Ang mga taong responsable para sa koleksyon ng dura ay dapat sumunod sa pagpapatupad ng ilang mga panuntunan:

• ito ay kinakailangan upang ipaliwanag sa pasyente ang layunin ng pag-aaral at ang pangangailangan na umubo hindi laway o nasopharyngeal uhog, ngunit ang mga nilalaman ng malalim na respiratory tract. Ito ay maaaring makamit bilang isang resulta ng isang produktibong ubo na nangyayari pagkatapos ng ilang (2-3) malalim na paghinga. Dapat din itong bigyan ng babala ang mga pasyente na kailangan niya munang banlawan bibig na may pinakuluang tubig upang alisin ang karamihan sa vegetating oral microflora at pagkain mga labi, impeding plema;
• isang medikal na manggagawa na nakikilahok sa koleksyon ng dura, bilang karagdagan sa isang bathrobe at isang sumbrero, dapat magsuot ng maskara, guwantes na goma at isang apron ng goma;
• nakatayo sa likod ng mga pasyente, ito ay inirerekomenda upang panatilihin ang mga bote bilang malapit hangga't maaari sa kanyang mga labi at agad na pinaghiwalay kanya plema pagdura ng ito, kaya ito ay kinakailangan upang magbigay ng na ang daloy ng hangin ay nakadirekta ang layo mula sa provider ng pangangalaga ng kalusugan:
• Pagkatapos makumpleto ang koleksyon ng dura, dapat na maingat na isara ng manggagawa ang manggagamot sa tangke at masuri ang dami at kalidad ng plema na nakolekta. Pagkatapos ay bibigyan ng label at ilagay sa isang espesyal na bix para sa transportasyon sa laboratoryo.

Kung ang pasyente ay hindi makagawa ng plema, ang gabi bago at maaga sa umaga sa araw ng koleksyon ng mga materyal na kinakailangan upang bigyan siya ng isang expectorant :. Isang kunin ng mga ugat ng halaman ng masmelow (mukaltin), bromhexine, ambroxol, at iba pa - o mag-aplay ng isang nanggagalit inhalation gumagamit ng kagamitan na naka-install sa kuwarto upang mangolekta plema. Ang materyal na nakolekta sa ganitong paraan ay hindi napapailalim sa konserbasyon at dapat suriin sa araw ng koleksyon. Upang maiwasan ang "culling" sa laboratoryo sa direksyon ay dapat gumawa ng isang espesyal na marka.

Kung ang mga microbiological studies ay hindi isinasagawa sa pasilidad na ito, ang nakolektang diagnostic na materyal ay dapat na sentral na ihahatid sa laboratoryo, sa kondisyon na ang materyal ay napanatili sa mga agwat sa pagitan ng paghahatid sa refrigerator o sa paggamit ng mga preservatives. Maghatid ng materyal sa laboratoryo sa mga kahon ng transportasyon, na maaaring madaling pagdidisimpekta. Ang bawat sample ay dapat na ipagkaloob sa naaangkop na label, at ang buong lot ay dapat na puno ng isang kasamang form.

[29], [30], [31],

Mga mode at dalas ng pagsusuri ng mga pasyente

Sa paunang, tinatawag na diagnostic, pagsusuri ng pasyente para sa tuberculosis, kinakailangan upang suriin ang hindi bababa sa 3 bahagi ng plema para sa 2 o 3 araw. Na nakolekta sa ilalim ng pangangasiwa ng mga medikal na tauhan, na pinatataas ang pagiging epektibo ng mikroskopya.

Ang pangunahing screening para sa tuberculosis ay dapat na isagawa sa pamamagitan ng lahat ng mga medikal na diagnostic institusyon ng sistema ng pangangalagang pangkalusugan. Kamakailan lamang, ang mga tinatawag na sentro ng mikroskopyo, na nilagyan ng mga modernong mikroskopyo at kagamitan para sa kaligtasan ng epidemya, ay inorganisa batay sa mga clinical diagnostic laboratoryo upang mapabuti ang kahusayan ng paunang pagsusuri.

Sa mga pasilidad na anti-TB, ginamit ang isang screening test na kinabibilangan ng pagsusuri ng dura o ibang materyal na diagnostic para sa hindi bababa sa 3-tiklop sa loob ng 3 araw. Sa panahon ng paggamot, ang mga microbiological studies ay ginaganap regular nang hindi bababa sa isang beses sa isang buwan sa panahon ng intensive chemotherapy phase. Sa paglipat sa bahagi ng paggamot, ang mga pag-aaral ay mas madalas na isinasagawa - na may pagitan ng 2-3 na buwan, habang ang dalas ng pag-aaral ay nabawasan sa dalawa.

Mga tampok ng koleksyon ng diagnostic na materyal para sa extrapulmonary tuberculosis

Tampok pathological materyal na may extrapulmonary anyo ng TB - Mycobacterium tuberculosis mababang concentration sa loob nito, na kung saan ay nangangailangan ng isang mas sensitibo paraan ng microbiological pag-aaral, lalo na sa seeding pamamaraan medium.

Sa tuberculosis ng genitourinary system, ang ihi ay ang pinaka-madaling maabot na materyal sa pag-aaral. Ang koleksyon ng ihi ay dapat gawin ng isang espesyal na nars na nasanay.

Ang panlabas na genitalia ay hugasan ng tubig na may sabon o isang mahinang solusyon ng potassium permanganate. Ang panlabas na pagbubukas ng yuritra ay maingat na ginagamot. Sa isang sterile vial, ang isang average na bahagi ng ihi umaga ay nakolekta: sa mga lalaki, natural, sa mga kababaihan, gamit ang isang catheter. Ang ihi mula sa bato pelvis ay nakolekta sa sterile tubes na may catheterization ng isa o dalawang bato, sa huli kaso - kinakailangang hiwalay mula sa bawat bato. Ang isang maliit na halaga ng ihi ay centrifuged, ang sediment ay sinusuri.

Sa mga kalalakihan, tamud, pinalalabas na mga testigo, ang lihim ng prosteyt ay napapailalim sa centrifugation upang makakuha ng isang namuo. Sa anumang lokalisasyon ng isang partikular na proseso sa genital area sa mga lalaki, ang prostate massage ay maaaring magsulong ng pagtatago ng mga secretions na naglalaman ng mycobacterium tuberculosis.

Ang panregla ng dugo sa mga kababaihan ay nakolekta sa pamamagitan ng sanggol o paggamit ng cap ng Kafka. Ang nakuhang materyal ay napalaya mula sa mga pulang selula ng dugo, hinuhugasan ito ng dalisay na tubig na sinusundan ng centrifugation. Ang namuo ay napagmasdan.

Ang mga alokasyon mula sa cervical canal ng matris ay nakolekta sa ilang kapasidad o cap ng Kafka, ibig sabihin, ito ay kanais-nais na makaipon ng 1-2 ML ng pathological na materyal.

Materyal na nakuha mula sa operative interventions sa mga bato, maselang bahagi ng katawan. Na may mga biopsy, mga scrapings mula sa endometrium, homogenize. Upang gawin ito, ito ay inilagay sa isang payat na mortar at lubusan na pinuputol ng malinis na gunting. Upang slurry na ito ay naidagdag sterile ilog ng buhangin sa isang halaga na katumbas ng bigat nito, at pagkatapos ay topped up sa 0,5-1.0 ml isotonic solusyon sosa klorido, at lahat ng bagay ay triturated hanggang sa isang maputla masa na may ang karagdagan ng isotonic solusyon ng sosa klorido (4-5 ml). Pagkatapos ay pinapayagan ang mass upang manirahan ng 1-1.5 minuto, ang supernatant ay nasuri.

Tuberculosis ng mga buto at mga joints. Ang punctate (pus ng abscesses) na nakuha na may sterile syringe ay inilagay sa sterile dish at agad na inihatid sa laboratoryo. Ang sterile pipette, na dati ay moistened sa sterile isotonic sodium chloride solution, tumagal ng 2-5 ml ng nana, ilipat ito sa isang bote ng kuwintas at idagdag ang isa pang 2-3 ml ng isotonic sodium chloride solution. Ang bote ay sarado na may sork and shaken sa isang joker-apparatus sa loob ng 8-10 minuto. Sinuri ang homogenized suspension.

Sa malubhang mga uri ng osteoarticular tuberculosis, ang nana mula sa fistula ay kinuha. Ang napakaraming paglabas ay direktang nakolekta sa isang test tube. Sa mga kaso lean pyorrhea fistula hugasan na may payat isotonic solusyon ng sosa klorido, at ang washings ay nakolekta sa isang test tube, o ang piraso ng maliit na bilo pinapagbinhi na may nana na ipinadala para sa pagsusuri.

Ang kirurhiko materyal na nakuha sa panahon ng operasyon sa mga buto at joints ay maaaring binubuo ng purulent-necrotic masa, granulations, peklat tissue, buto tissue, synovial lamad tissue at iba pang mga substrates. Ginagawa ang paggamot nito, tulad ng sa tuberculosis ng mga bato.

Microbiological study ng synovial fluid sa 3% sodium citrate solution (1: 1 ratio) upang maiwasan ang pagkabuo ay gumanap agad pagkatapos ng mabutas.

Tuberculosis ng mga node ng lymph. Ang nana, na kinuha sa panahon ng pagbutas ng mga node ng lymph, ay sinuri din. Bilang pus ng mga abscesses. Ang mga tisyu ng mga lymph node na nakuha sa panahon ng operasyon ng kirurhiko, biopsy, ay napagmasdan, katulad ng ibang mga uri ng tuberculosis.

Ang pag-aaral ng masa ng masa sa mycobacterium tuberculosis ay napakabihirang, dahil sa halos kabuuang kakulangan ng mga positibong resulta.

[32], [33], [34], [35], [36],

Mycobacterium microscopy

Ang sputum microscopy ay isang medyo mabilis, simple at murang pamamaraan na dapat gamitin sa lahat ng mga kaso na may pinaghihinalaang tuberculosis. Bilang karagdagan, ang pag-aaral na ito ay isinasagawa upang suriin ang pagiging epektibo ng chemotherapy at upang alamin ang pagbawi o kabiguan ng paggamot kung walang pagsubok sa kultura.

Ang dalawang pamamaraan ng mikroskopikong pagsusuri ay ginagamit:

• paraan ng direktang mikroskopya, kapag ang isang pahid ay handa nang direkta mula sa diagnostic na materyal;
• pamamaraan ng mikroskopyo ng isang latak na inihanda mula sa materyal na de-kontaminadong materyal para sa kultura.

Ang unang paraan ay ginagamit sa mga laboratoryo kung saan ang mga mikroskopikong pag-aaral ay ginagawa (clinical at diagnostic laboratories ng pangkalahatang medikal na network).

Ang pinakamagandang resulta ng mikroskopikong pagsusuri ay nakuha sa pamamagitan ng pagtuon sa diagnostic na materyal (halimbawa, sa pamamagitan ng centrifugation).

Upang makita ang mycobacterium tuberculosis na may posibilidad na 50% kapag isinasagawa ang mikroskopya, 1 ml ng dura ay dapat maglaman ng higit sa 5000 mga microbial cell. Ang dura ng mga pasyente na may mga baga ng tuberculosis ay kadalasang naglalaman ng isang malaking halaga ng mga bakterya na acid-fast, na nagpapahintulot sa kanila na mapagkakatiwalaan na napansin ng bacterioscopy. Ang diagnostic sensitivity ng pamamaraang ito ay maaaring mapabuti sa pamamagitan ng pagsusuri ng ilang mga sample ng dura mula sa isang pasyente. Ang isang negatibong resulta ng isang pagsusuri sa bacterioscopic ay hindi nagbubukod sa pagsusuri ng tuberkulosis, dahil ang dura ng ilang pasyente ay naglalaman ng mas kaunting mycobacteria kaysa maaaring makitang may mikroskopya. Ang hindi magandang paghahanda ng tuhod ay maaaring maging sanhi ng negatibong resulta ng isang bacterioscopic examination.

Ang pinaka-karaniwang pamamaraan para sa pagtuklas ng acid-fast mycobacteria sa smear ay kulay ayon sa Tsiol-Nelsen. Ang pamamaraan ay batay sa pagpasok ng carbolic fuchsin sa isang microbial cell sa pamamagitan ng isang lamad na kasama ang isang layer ng waxy-lipid, habang sabay na pagpainit at malakas na pagkilos ng etching ng phenol. Ang kasunod na pagkawalan ng kulay ng pahid na may 25% na solusyon ng sulpuriko acid o 3% hydrochloric acid ay humantong sa isang pagkawalan ng kulay ng lahat ng di-acid-mabilis na istruktura. Ang kulay ng mga elemento ng smear ay marumi na may 0.3% na solusyon ng methylene blue. Mycobacteria ay hindi nagkakaroon ng ordinaryong aniline Mga tina, na nagreresulta sa acid-mabilis bacilli ay stained pulang-pula-kulay pula, at iba pang mikrobyo at cellular elemento - sa asul.

Para smears stained sa pamamagitan Ziehl-Nelsenu gamitin ang liwanag ng binokulo mikroskopyo may immersion oil lens (90- o 100-tiklop na pagtaas) at kasangkapan para sa mata sa 7- o 10-fold pag-magnify. Galugarin ang 100 mga patlang ng pangitain, na sapat upang kilalanin ang iisang mycobacteria sa pahid. Kung ang resulta ng naturang pag-aaral ay negatibo, para sa pagkumpirma na inirerekomenda na tingnan ang isa pang 200 na larangan ng pangitain. Itala ang mga resulta, na nagpapahiwatig ng bilang ng mga napansin na acid-fast bacilli (KUM).

Bilang karagdagan sa pamamaraan na ito, ang kulay fluorochromes ay ginagamit para sa luminescent microscopy, na nagbibigay-daan sa pagkamit ng mga pinakamahusay na resulta. Ang paggamit ng pamamaraang ito ay nagdaragdag ng kahusayan ng mikroskopya sa pamamagitan ng 10-15%. Kapag ang pagpapagamot ng mycobacteria sa mga luminescent dyes (auramine, rhodamine, atbp.), Ang mga sangkap na ito ay nakagapos sa mga katulad na istruktura ng waks ng microbial cell. Kapag nag-iilaw ang mga may-kulay na mga cell na may kapansin-pansing pinagmulan ng liwanag (isang tiyak na spectrum ng ultraviolet radiation), nagsisimula silang lumiwanag sa orange o maliwanag na pulang ilaw sa isang itim o madilim na berdeng background. Dahil sa mataas na liwanag at kaibahan ng nakikitang imahe, ang pangkalahatang pag-magnify ng mikroskopyo ay maaaring mabawasan ng 4-10 beses, ang larangan ng pagtingin ay lumalawak at ang oras ng pagtingin sa paghahanda ay bumababa. Kasama nito, dahil sa mas malaking depth ng field, maaari mong dagdagan ang ginhawa ng pag-aaral.

Kapag ang mikroskopya ng pag-ilaw ay ginagamit upang i-scan ang parehong lugar, ang smear expends makabuluhang mas kaunting oras kaysa sa liwanag mikroskopya ng Tsiol-Nelsen paglamlam. Kung para sa isang araw ng trabaho isang mikroskopyo ang sumusuri tungkol sa 20-25 tulad ng mga smears, pagkatapos ay sa tulong ng pag-ilaw mikroskopya, maaari niyang suriin ang higit sa 60-80 sample sa parehong oras. Alam ng mga nakaranasang mikroskopyo na ang kulay ng mga selula na may halo ng auramine at rhodamine ay sa ilang mga paraan na tiyak para sa acid-fast bacilli, na sa kasong ito ay mukhang golden sticks. Ang mga saprophyte ay ipininta sa isang maberde kulay.

Ang isa pang mahalagang kalamangan ng ang paraan ng fluorescent mikroskopya - ang kakayahan sa tiktikan binago Mycobacterium, nawala sa ilalim ng impluwensiya ng mga salungat na mga kadahilanan, kabilang ang intensive chemotherapy, kislotousotoychivosti ari-arian at ay hindi napansin na may kaugnayan sa ito paglamlam Ziehl-Nelsenu.

Ang disadvantages ng paraan ng pag-iilaw mikroskopya isama ang relatibong mataas na gastos ng mikroskopyo at ang operasyon nito. Gayunpaman, sa sentralisado o iba pang mga malalaking laboratoryo, kung saan ang load ay lumampas sa pamantayan ng 3 technician ng laboratoryo na nagtatrabaho sa tatlong maginoo microscopes, mas mura ang gumamit ng isang fluorescent microscope sa halip.

Ang mga pamamaraan ng bakterya ay may mataas na pagtitiyak (89-100%). Tungkol sa 97% ng mga positibong resulta na nakuha sa anumang pamamaraan ng mikroskopyo ay hindi nakumpirma na nakumpirma ng mga resulta ng paghahasik.

Dapat pansinin na kapag ang pagsusuri ng mikroskopiko sa pahid ng materyal na pathological, imposible upang matukoy ang mga species na kabilang sa nakilala acid-mabilis mycobacteria. Mikroskopya pamamaraan ay nagbibigay-daan upang magbigay ng opinyon lamang sa presensya o kawalan ng acid sa paghahanda ng microorganisms, na maaaring ipinaliwanag sa pamamagitan ng pag-iral sa likas na katangian ng isang malaking bilang ng morphologically katulad ng sakit na tuyo mycobacteria complex nontubercular acid lumalaban microorganisms.

Ang mga resulta ng mikroskopya ay sinusuri sa mga semiquantitative unit.

Upang maging magagawang upang ihambing ang mga resulta ng iba't ibang mga pamamaraan mikroskopya, empirical coefficients ay pinangangasiwaan. Halimbawa, upang ihambing ang mga resulta ng smears stained na may fluorescent dyes, ang data ng pananaliksik ilaw mikroskopyo (1000 beses parangal), ito ay kinakailangan upang hatiin ang bilang ng mga acid-mabilis bacilli nakita ng mga pag-ilaw mikroskopyo, ang kaukulang koepisyent sa 250-fold parangal - upang 10, 450-fold - hanggang 4, may 630-fold - hanggang 2.

Mga tampok ng mikroskopya para sa extrapulmonary tuberculosis

Ang direktang mikroskopya ay ginaganap, pati na rin ang microscopy ng smears na inihanda pagkatapos ng pagpayaman, na sinusundan ng Tsiol-Nelsen paglamlam o luminescent dyes. Ang direktang microscopy ng smears ay hindi epektibo dahil sa isang mababang konsentrasyon ng mycobacteria sa materyal, at samakatuwid ito ay mas makatwirang upang gamitin ang mga paraan ng pagpayaman. Ang pinaka-epektibong ay centrifugation. Kung ang biological materyal ay nanlalagkit, centrifugation ay inilapat na may sabay-sabay na pagkalusaw at homogenization ng materyal, na kung saan ay isinasagawa gamit ang high-speed centrifuges sa sentripugal lakas ng 3000 g at hypochlorite solusyon. Ang iba pang mga pamamaraan ng pagpayaman, tulad ng micro flotation, ay kasalukuyang hindi ginagamit dahil sa pagbuo ng mga biologically hazardous aerosols.

[37], [38],

Ang pamamaraan ng kultura ng diagnosis ng tuberculosis

Ang paraan ng paghahasik, o ang pamamaraan ng kultura, ay mas sensitibo kaysa sa microscopy ng smear, at may maraming pakinabang sa huli. Pinapayagan nito na tuklasin ang ilang dose-dosenang mga mabubuhay na mycobacteria sa materyal ng pagsubok at may mahusay na halaga ng diagnostic. Ito ay lalong mahalaga kapag sinusuri ang materyal mula sa mga bagong diagnosed o ginamot na mga pasyente na naglalabas ng isang maliit na halaga ng mycobacteria.

Kumpara sa mikroskopya, kultura ay maaaring taasan ang bilang ng nakitang mga kaso ng tuberculosis sa pamamagitan ng higit sa 15-25%, pati na rin ang pag-verify ng tuberculosis sa mga naunang yugto, kapag ang sakit ay pa rin tumutugon na rin sa paggamot. Ang isang napakahalagang bentahe ng pagsubok sa kultura ay ang posibilidad ng pagkuha ng isang kultura ng exciter na maaaring makilala at pinag-aralan na may paggalang sa pagiging sensitibo sa droga, pagkalupig at iba pang mga biological properties.

Ang mga disadvantages ng pamamaraan ng paglilinang ay kasama ang kanilang tagal (ang oras ng paghihintay ng mga materyales ay umabot ng 10 linggo). Mas mataas na gastos, pagiging kumplikado ng pagproseso ng diagnostic na materyal.

Prinsipyo ng presowing paggamot ng diagnostic materyal

Ang maginoo na pamamaraan sa microbiological ay hindi magagamit sa pagsasagawa ng mga pag-aaral sa tuberculosis. Ito ay dahil sa katotohanan. Na ang mycobacterium tuberculosis ay lumalaki nang napakabagal, at ang karamihan sa mga klinikal na sample ay naglalaman ng mabilis na lumalagong pyogenic at putrefactive microorganisms, fungi. Ang kanilang mabilis na pag-unlad sa mayaman na nutrient media ay nakakasagabal sa pagpapaunlad ng mycobacteria at hindi pinahihintulutan ang paghiwalay sa causative agent ng tuberculosis, kaya ang diagnostic na materyal ay dapat na pretreated bago ang seeding. Bilang karagdagan, ang mycobacteria na inilabas mula sa mga daanan ng pasyente ay karaniwang napapalibutan ng isang malaking halaga ng uhog, na nagpapahirap sa pag-isiping mabuti. Sa pagsasaalang-alang na ito, bago ang pagtatanim ng dura at iba pang katulad na mga materyales, ang kanilang likido, ang paglilinis ay kinakailangan.

Ang lahat ng detergents at decontamins ay may mas marami o mas maliwanag na nakakalason na epekto sa mycobacteria. Bilang resulta ng pagproseso, hanggang sa 90% ng mycobacteria ay maaaring mamatay. Upang panatilihin ang sapat na ng mycobacterial populasyon, matipid ang pangangailangan na gamitin ang processing pamamaraan na payagan, sa isang kamay, upang sugpuin ang mabilis na lumalagong pyogenic bakterya at bulok, at sa kabilang - upang mapanatili ang posibilidad na mabuhay ng mycobacteria naroroon sa ang materyal.

Depende sa materyal, nito na antas ng homogeneity at polusyon para sa pre-processing paggamit ng iba't ibang decontaminant: Dura - 4% sosa haydroksayd solusyon, solusyon trohzameschonnogo sosa pospeyt 10%, benzalkonium klorido, trisodium pospeyt, NALC-NaOH (N-acetyl-L-cysteine sosa haydroksayd) sa isang pangwakas na konsentrasyon ng 1% NaOH, sa ihi at iba pang mga likido materyales - sulpuriko acid solusyon 3%, para sa mga kontaminadong sample, taba-naglalaman ng mga materyales - solusyon ng okselik acid sa 5%. Higit pa rito, sa ilang mga kaso, gamitin enzymes, ibabaw aktibong compounds (surfactants). Application Tween detergents at ilang iba pang mycobacterial kamatayan ay sinamahan ng mas cells (40-50% mabuhay). Gayunpaman, maaari lamang itong magamit para sa likidong materyales. Ang pinakamalaking pamamahagi sa mundo ay NALC-NaOH. Na gawa sa mga hanay. Ang pamamaraang ito ay nagbibigay-daan upang maglaan ng higit sa 85% ng populasyon ng mycobacterial cells. Paglilinis sa gas tkanesoderzhaschih solids mas mahirap na hulaan dahil ang antas ng pagpapakalat ng materyal sa panahon homogenization mahirap. Halimbawa, paggamot biopsies ng lymph nodes ay madalas na sinamahan ng nadagdagan dalas ng karumihan na may labis na flora. Sa kasong ito, ang 1% ng etonium ay maaaring gamitin.

Ang non-homogeneous material ay homogenized na may salamin kuwintas sa presensya ng decontaminants. Ang mga likidong materyales ay pre-centrifuged at tanging isang namuo ay itinuturing.

Mga pamamaraan sa paghahasik at pagpapapisa ng itlog

Pagkatapos ng pretreatment, ang materyal ay naka-sentripugal, sa gayon ay pinipilit ang mycobacteria at pinatataas ang kanilang nilalaman sa sediment ("pagpayaman ng putik"). Ang nagresultang precipitate ay neutralized at inokulated (inoculated) na may siksik na nakapagpapalusog media o tubes na may likido (semiliquid) media. Mula sa natitirang bahagi ng sediment, ang mga smear ay inihanda para sa mikroskopikong pagsusuri. Ang pamamaraan ng pag-seeding ay dapat hadlangan ang kontaminasyon ng materyal na diagnostic.

Para sa isang maaasahang klinikal na interpretasyon ng mga resulta ng isang microbiological na pag-aaral, dapat sundin ang mga sumusunod na tuntunin: mikroskopiko at kultura pag-aaral ay dapat na gumanap magkapareho mula sa parehong sample ng diagnostic materyal.

Ang inoculated tubes ay inilalagay sa isang termostat sa 37 ^° C sa loob ng 2 araw sa isang pahalang na posisyon. Tinitiyak nito na kahit na ang pagsipsip ng materyal sa daluyan ng kultura. Pagkatapos ng 2 araw, ang mga tubo ay inililipat sa isang vertical na posisyon at hermetically selyadong sa goma o silicone plugs upang maiwasan ang pagpapatayo ng naitatang na media.

Pananim ay incubated sa 37 ^{tungkol sa} C para sa 10-12 na linggo sa regular na lingguhang pagtingin. Para sa bawat preview, ang mga sumusunod na parameter ay naitala:

• ang panahon na nakikita mula sa araw ng pagtatanim ng paglago;
• rate ng paglago (bilang ng mga CFU);
• kontaminasyon ng crop na may isang labis na microbial flora o fungi (ang mga tubo ay aalisin);
• kawalan ng nakikita paglago. Ang mga tubo ay naiwan sa termostat hanggang sa susunod na pagtingin.

Malusog na media

Iba't ibang nutrient media ang ginagamit para sa paglilinang ng mycobacteria; siksik, semi-likido, likido. Gayunpaman, wala sa mga kilalang nutrient media ang may mga katangian na tinitiyak ang paglago ng lahat ng mycobacterial cells. Kaugnay nito, ang 2-3 nutrient na media ng iba't ibang komposisyon ay inirerekomenda na magamit nang sabay-sabay upang madagdagan ang bisa.

Inirerekomenda ng WHO ang kapaligiran ng Levenstein-Jensen bilang pamantayang daluyan para sa pangunahing pag-iisa ng causative agent ng tuberculosis at para matukoy ang sensitivity ng gamot nito. Ito ay isang siksik na itlog na kapaligiran kung saan ang paglago ng mycobacteria ay nakuha sa ika-20 ng ika-25 araw pagkatapos ng seeding ng bacterioscopically positibong materyal. Ang mga pananim ng bacterioscopically negatibong materyal ay nangangailangan ng mas mahabang panahon ng pagpapaputi (hanggang 10-12 na linggo).

Sa ating bansa, ang iminungkahing E.R. Finn egg environment Finn-II. Ito ay naiiba sa na, sa halip na L-asparagine, gumagamit ito ng sodium glutamate, na nagpapalit ng iba pang mga paraan ng pagsasama ng mga amino acids ng mycobacteria. Lumilitaw ang paglago sa medyum na ito na mas maaga, at ang dalas ng paglalaan ng mycobacteria ay 6-8% na mas mataas kaysa sa medium ng Lowenstein-Jensen.

Upang mapabuti ang pagiging epektibo ng diagnosis ng bacteriological ng extrapulmonary tuberculosis, ipinapayong isama ang nabagong media ng Finn-II sa kumplikadong nutrient media. Upang mapabilis ang paglago, ang isang sodium thioglycolate 0.05%, na binabawasan ang konsentrasyon ng oxygen, ay dinagdag sa Finn-II nutrient medium. Upang protektahan ang enzyme mula sa Mycobacterium sistema nakakalason mga produkto ng lipid peroxidation sa nakapagpapalusog daluyan Finn-II pinangangasiwaan antioxidant α-tocopherol asetato sa isang kampo ng 0,001 mcg / ml. Ang seeding ng diagnostic material ay isinasagawa ayon sa isang karaniwang pamamaraan.

Sa mga laboratoryo ng anti-tuberkulosis ng Russia, ginagamit din ang iba pang mga pagbabago ng siksik na nutrient na media; ipinanukalang G.G. Mordovian nutrient medium "Bago", na binuo ni V.A. Anicic nutrient media A-6 at A-9, atbp.

Dahil sa ang katunayan na sa proseso ng chemotherapy ay pinsala sa iba't-ibang mga metabolic sistema ng microbial mga cell, ang ilang mga mycobacterial populasyon loses ng kakayahan upang bumuo ng normal sa maginoo pagkaing nakapagpalusog media at nangangailangan osmotically balanseng (o semi-likido) culture media.

Pagtatasa at pagtatala ng mga resulta ng pag-aani ng diagnostic na materyal

Ang ilang mga strain at species ng mycobacteria ay lumalaki nang dahan-dahan, ang paglago ay maaaring lumitaw kahit na sa ika-90 araw. Ang bilang ng mga pananim ay maliit, ngunit ito ay posible na mapaglabanan ang mga pananim sa isang termostat para sa 2.5-3 na buwan.

Ang mga nakakalason na kultura ng mycobacterium tuberculosis ay kadalasang lumalaki sa mga makakapal na kapaligiran sa itlog sa anyo ng mga kolonya ng R-form ng iba't ibang laki at species. Ang mga kolonya ay tuyo, kulubot, garing, bahagyang pigmented. Sa iba pang media, ang kolonya ng mycobacterium tuberculosis ay maaaring mas mahalumigmig. Pagkatapos ng kurso ng chemotherapy o sa panahon ng paggamot, ang mga makinis na kolonya na may basa-basa na paglago (S-form) ay maaaring ilaan.

Kapag pinagsasama ang mga pananim, isang hanay ng mga espesyal na pag-aaral ay ginagamit upang makilala ang mycobacterium tuberculosis mula sa di-tuberculosis mycobacteria at acid-resistant na saprophytes.

Ang positibong tugon ay ibinigay pagkatapos ng isang ipinag-uutos na pagsusuri ng mikroskopiko ng marumi na Tsiol-Nelsen smear mula sa mga lumaki na kolonya. Sa kaso ng paglago ng mycobacteria sa pahid detect maliwanag na pula patpat na namamalagi isa-isa o sa mga grupo, na bumubuo ng accumulations sa anyo ng nadama o tirintas. Sa mga batang kultura, lalo na ihiwalay mula sa pang-matagalang paggamot ng mga pasyente na may chemotherapy, mycobacteria-iba ang ipinahayag polymorphism, hanggang sa pagkanaririto ng baras-hugis, kasama ang maikling, halos coccoid o pinahabang bersyon na makahawig maisiliyum.

Ang rate ng paglaki ng mycobacteria ay ipinahiwatig sa pamamagitan ng sumusunod na pamamaraan: (+) - 1-20 cfu sa vitro (bahagyang bacterial excretion); (++) - 20-100 CFU sa vitro (katamtaman na bacterial excretion); (+++) -> 100 CFU sa vitro (masagana bacterial excretion). Sa diagnosis ng laboratoryo ng tuberculosis, hindi sapat ang sagot kung ang mycobacterium ay napansin ng isa o ibang pamamaraan. Magkaroon ng isang detalyadong pag-unawa sa lawak at likas na katangian ng populasyon ng mycobacterial, komposisyon at mga katangian nito. Ito ang mga datos na nagbibigay-daan sa amin upang maipaliwanag nang tama ang kalagayan ng proseso, planuhin ang mga taktika at napapanahong tama ang paggamot.

Sa mga nagdaang taon, upang mapabilis ang paglago ng mycobacteria, nutrient media sa isang agar na batayan na may iba't ibang mga additives sa paglago at ang paggamit ng isang espesyal na pinaghalong gas ay iminungkahi. Upang makuha ang paglago ng mycobacteria sa mga media na ito, ang isang kapaligiran na may mataas na nilalaman ng carbon dioxide (4-7%) ay nilikha sa paglilinang. Ang mga espesyal na CO- ₂ ay ginagamit para sa layuning ito . Gayunpaman, ang pinaka-binuo na awtomatikong sistema para sa paglilinang ng mycobacteria: MGIT-BACTEC-960 at MB / Bact.

Isa tulad system - MGIT system (mycobacteria paglago nagpapahiwatig tube), na kung saan ay tumutukoy sa pag-unlad ng mataas na teknolohiya at ay inilaan para sa mabilis na pag-bacteriological diyagnosis ng tuberculosis at Mycobacterium pagkamaramdamin sa unang-line na gamot, at ang ilang mga ikalawang-line na gamot. Ang MGIT ay nakatuon sa paggamit nito bilang bahagi ng aparato VASTES-960. Ang mga mikroorganismo ay nilinang sa mga espesyal na tubo na may likido na nutrient medium batay sa binagong medium ng Middlebrook-7H9. Upang pasiglahin ang paglago ng mycobacteria at sugpuin ang paglago ng sobrang microflora, ang MGIT Growth Supplement at ang isang halo ng mga antibacterial na gamot ng PANTA ay ginagamit.

Ang paglago ng mga microorganisms ay naitala sa optika. Ito ay batay sa pag-ilaw na nangyayari kapag ang oxygen consumption Mycobacterium mi panahon ng paglago. Oxygen-flyuorohromny dye na nakapaloob sa ilalim ng isang espesyal na test tubes at sakop na may isang layer ng silicone. Paggawa ng maraming kopya mycobacteria ay humahantong sa isang pagbawas sa dami ng oxygen sa tube at pagbabawas ng konsentrasyon na nagiging sanhi ng isang pagtaas sa mga pag-ilaw, na kung saan ay makikita sa ilalim ng pag-iilaw sa pamamagitan ng ultraviolet light tubes at awtomatikong nakarehistro potosensor built-in na appliance VASTES-960. Ang intensity ng luminescence ay naitala sa mga yunit ng paglago (GU-growth unit). Ang data ng paglago ay naitala sa computer, kung saan sila ay awtomatikong mai-save. Computer-aaral ng curves paglago ay maaaring magbigay ng impormasyon tungkol sa pagkakaroon ng isang iba't ibang mga Mycobacterium pool, kabilang nontubercular, at tumutulong din upang suriin ang pag-unlad mga katangian ng mycobacteria.

Bilang resulta ng ang oras ng paglitaw ng naturang mga sistema mycobacterial paglago ay makabuluhang nabawasan, average ng 11 araw VASTES-960 at 19 araw sa MB / Bact sa 33 araw sa karaniwang solid nakapagpapalusog daluyan. Dapat pansinin na ang mga sistemang ito ay nangangailangan ng mataas na kuwalipikadong tauhan. Seeding materyal para sa likidong media ay escorted sa pamamagitan ng paghahasik sa Lowenstein-Jensen medium, nagpe-play ang papel na ginagampanan ng mga taong maaaring ipalit sa mga kaso kapag ang ibang mga media ng Mycobacterium tuberculosis huwag payagan ang pag-unlad.

[39], [40], [41], [42], [43], [44],

Pagpapasiya ng sensitivity ng gamot ng mycobacteria

Ang pagpapasiya ng spectrum at ang antas ng sensitivity ng mycobacteria sa mga anti-tuberculosis na gamot ay napakahusay na klinikal na kahalagahan, pati na rin ang epidemiological na pagsusuri ng pagkalat ng tuberculosis sa paglaban ng gamot. Bilang karagdagan, ang pagsubaybay sa paglaban sa droga ay posible upang masuri ang pagiging epektibo ng programa ng tuberkulosis sa kabuuan, pagiging isang mahalagang tagapagpahiwatig ng pagganap ng lahat ng mga bahagi ng mga aktibidad na anti-tuberculosis.

Pagpaparami at timing ng sensitivity ng gamot:

• bago magsimula ng paggamot isang beses upang matukoy ang diskarte at taktika ng paggamot:
• kapag nahiwalay sa kanser mula sa iba't ibang mga materyales (plema, BAL fluid, ihi, exudates, alak, atbp.), ang lahat ng mga nakahiwalay na strain ay sinusuri:
• sa dulo ng intensive phase ng paggamot sa kawalan ng klinikal at radiological dinamika:
• kung kinakailangan upang baguhin ang paggamot sa paggamot sa mga sumusunod na kaso:
  • kawalan ng tuhod pahid;
  • muling pagsisiwalat ng kultura pagkatapos ng plema ng tsaa-negatibo;
  • isang marahas na pagtaas sa bilang ng CMB sa pamunas matapos ang unang pagtanggi. Alam na ang strains ng mycobacterium tuberculosis, na kung saan ay magkakaiba sa mga tuntunin ng sensitivity ng gamot, ay nakahiwalay mula sa materyal mula sa isang pasyente na may tuberculosis. Ang sensitivity ng strains sa mga anti-tuberculosis na gamot ay maaaring mag-iba sa hanay ng mga gamot, antas, kadalasan at antas ng paglitaw ng paglaban.

Ang antas ng bawal na gamot panlaban sa Mycobacterium tuberculosis ay tinutukoy alinsunod sa mga itinatag na pamantayan, na kung saan ay nakatuon sa klinikal kabuluhan at katatagan depende sa aktibidad ng anti-TB na gamot, pharmacokinetics nito, ang konsentrasyon sa sugat. Ang maximum therapeutic dosis at iba pa.

Ang pagpapasiya ng pagiging sensitibo sa droga ng mycobacteria ay kasalukuyang ginagawa ng mga microbiological method:

• Ganap na konsentrasyon (paraan ng pagbabanto sa siksik o likido na nutrient media),
• mga sukat,
• coefficient of resistance.

Karaniwan, ang paglaban ay nakikita sa anyo ng nakikita na paglago ng mga colonies ng mycobacterium tuberculosis, ngunit may mga pamamaraan na humimok ng paglago sa mga unang yugto ng cell division ng mycobacteria sa anyo ng mga reaksyon ng kulay. Ang mga pamamaraan na ito ay paikliin ang oras ng pagsubok mula 3-4 hanggang 2 linggo.

Tulad ng pinag-isa sa Russia ay nadagdagan, inirerekomenda ng WHO Committee chemotherapy paraan ng ganap na konsentrasyon, na kung saan ay mula sa isang methodological punto ng view, ay ang pinaka-simple, ngunit ito ay nangangailangan ng mataas na katumpakan at standardisasyon ng mga pamamaraan laboratoryo. DST ay binubuo ng isang hanay ng mga tubes na may isang nakapagpapalusog daluyan, ang modified anti-TB na gamot. Set ay binubuo ng 2-3 tubes na may iba't ibang concentrations ng bawat isa sa mga gamot na ginagamit, ang isa control tubes na walang gamot sa kapaligiran at isang tube na naglalaman ng 1000 mcg / ml ng sodium Sali tsilovokislogo o 500 ug / ml paranitrobenzoynoy acid nontubercular sa tiktikan paglago ng mycobacteria.

Upang maghanda ng isang hanay ng mga media na may mga paghahanda, isang binagong Levenstein-Jensen medium (walang starch) ay ginagamit, na kung saan ay poured sa flasks. Sa bawat isa sa mga flasks, ang isang tiyak na dami ng naaangkop na pagbabanto ng antituberculous paghahanda ay idinagdag. Ang mga nilalaman ng mga flasks ay lubusang halo-halong, ibinuhos sa mga tubo at nakatiklop sa isang hilig na posisyon para sa 40 minuto sa isang temperatura ng 85 ° C. Inirerekomenda na likawin ang daluyan sa isang electric rewinder na may awtomatikong kontrol sa temperatura. Miyerkules na may mga gamot na anti-TB

Ang serye ng 1-st ay maaaring itabi sa refrigerator sa 2-4 ° C para sa 1 buwan, na may mga paghahanda ng ikalawang hanay - hindi hihigit sa 2 linggo. Ang imbakan ng media na may mga paghahanda sa temperatura ng kuwarto ay hindi katanggap-tanggap. Kapag naghahanda ng mga solusyon ng mga anti-tuberculosis na gamot, ang kanilang aktibidad ay isinasaalang-alang, kinakalkula ang konsentrasyon, naitama para sa molekular na timbang ng di-tiyak na bahagi ng paghahanda, kadalisayan, atbp. Upang matukoy ang pagiging sensitibo ng gamot, ginagamit lamang ang mga kemikal na dalisay na sangkap.

Ang prinsipyo ng pamamaraan ay upang matukoy ang konsentrasyon ng isang antituberculous na gamot na nagpipigil sa paglago ng isang makabuluhang bahagi ng populasyon ng mycobacterial. Kung tama ang ginagawa, ang paraan na ito ay may mahusay na kahusayan.

Bago ang pagsusulit, kinakailangan upang matiyak na ang nakahiwalay na kultura ng mycobacterium tuberculosis ay walang panlabas na microflora. Mula sa kultura ng mycobacteria sa 0.9% sosa chloride solution, isang homogenous suspension na naglalaman ng 500 milyong microbial na katawan sa bawat ml ay inihanda (optical turbidity standard na 5 units). Ang resultang slurry ay diluted na may 0.9% sosa klorido solusyon (1:10) at 0.2 ML ng slurry ay idinagdag sa bawat tubo ng hanay ng media kultura. Ang inoculated tubes ay inilagay sa isang incubator sa 37 ° C at gaganapin sa isang pahalang na posisyon para sa 2-3 araw sa sloped ibabaw ng medium ay pantay-pantay inoculated na may isang suspensyon ng Mycobacterium tuberculosis. Pagkatapos ay ililipat ang mga tubo sa isang vertical na posisyon at incubated para sa 3-4 na linggo. Ang mga resulta ay naitala pagkatapos ng 3-4 na linggo.

Dahil ang tiyempo ng excretory excretion mula sa clinical material sa nutrient media ay hindi bababa sa 1-1.5 na buwan, ang mga resulta ng pagtukoy ng sensitivity ng gamot sa pamamagitan ng pamamaraang ito ay maaaring makuha nang wala pang 2-2.5 buwan matapos ang paghahasik ng materyal. Ito ay isa sa mga pangunahing kakulangan ng pamamaraan.

I-translate ang mga resulta ng pagtukoy ng sensitivity ng gamot ng mycobacteria batay sa ilang pamantayan. Sa solid culture media ay itinuturing na sensitibo sa ang konsentrasyon ng mga bawal na gamot na siyang nakapaloob sa mga medium, kung ang bilang ng mga colonies ng mycobacteria lumago sa vitro may gamot na ito ay hindi higit sa 20 na may masaganang paglago sa control tube na walang gamot. Tanging sa pagkakaroon ng higit sa 20 kolonya ay kultura na itinuturing na lumalaban sa konsentrasyon na ito. Sa pagsasagawa, kapag ang pagkuha ng paglago ay nagreresulta sa mga tubes ng pagsubok na malapit sa 20 cfu. Ito ay kinakailangan upang ipaalam ang klinikal na yunit na ang sensitivity o paglaban sa kasong ito ay borderline, dahil kung minsan ay maaaring ipaliwanag ang malabo dinamika ng mga clinical indicator.

Para sa iba't ibang mga gamot, ang isang tiyak na konsentrasyon ay itinatag, kung saan ang pagpaparami ng kritikal na proporsiyon ng populasyon ng mycobacterial ay sinusunod. Ang mga konsentrasyon na ito ay tinatawag na "kritikal". Bilang isang criterion ng katatagan, ang paglago ng populasyon ng mycobacteria sa isang nutrient medium na may paghahanda sa isang kritikal na konsentrasyon ay ginagamit.

Sa domestic TB practice, sa pagtukoy sa paglaban ng gamot, hindi sila limitado sa pagtukoy lamang ng mga kritikal na konsentrasyon. Ito ay dahil sa katotohanan. Na ang pinalawig na kahulugan na antas ng bawal na gamot panlaban ay nagbibigay-daan sa clinician upang mas tumpak na iposisyon ang mga taktika chemotherapy gamit kaalaman ng potentiating ang pagkilos ng mga kumbinasyon gamot, crisscross inaasahan paglaban o upang mag-aplay ng isang mas epektibong mga gamot na grupo na ginagamit na gamot na anti-TB.

Ang absolute na paraan ng konsentrasyon ay ang pinakasimpleng, ngunit ito rin ang pinaka sensitibo sa mga error na ginawa kapag ito ay ginaganap. Mas maaasahan, lalo na sa pagtukoy ng sensitivity sa mga second-line na gamot, at karaniwan sa labas ng Russia ay ang pamamaraan ng mga sukat. Kinakailangan nito ang mga pagkukulang ng paraan ng ganap na konsentrasyon, ngunit sa pagpapatupad ito ay mas matrabaho.

Ang pamamaraan ay katulad ng lubos na paraan ng konsentrasyon. Ang paghahanda ng mga test tubes na may mga gamot ay isinasagawa sa parehong paraan. Tulad ng sa absolute na paraan ng konsentrasyon. Gayunpaman, ang binhi dosis ng suspensyon ng mycobacterium tuberculosis ay nabawasan sa pamamagitan ng isang kadahilanan ng 10. Na nagtatanggal sa dalas ng kusang paglaban ng ilang strains ng mycobacterium tuberculosis sa mga gamot tulad ng Etambutol, protionamide, capreomycin. Bilang kontrol, 2 o 3 na tubo na may isang dosis ng buto na katumbas sa mga tubes sa pagsubok, sunud-sunod na sinulid 10 at 100 beses, ay ginagamit. Ang criterion of stability ay ang proporsyon ng visually observed growth of mycobacterium tuberculosis. Para sa mga gamot ng ika-1 serye, ang katatagan ng criterion ay ang sobrang paglago ng 1% ng unang populasyon, para sa mga gamot ng pangalawang hilera - isang pagtaas ng 1 o higit sa 10% ng paunang, depende sa piniling kritikal na konsentrasyon.

Noong 1997, isang gumaganang pangkat ng WHO at ng International Union para sa pagkilala ng mahusay na tuberculosis TB drug pagtutol ay gumawa ng mga pagsasaayos sa mga criteria na ito, nag-aalok itinuturing na lumalaban mycobacteria, na lumago sa solid egg media Lowenstein-Jensen sa sumusunod na konsentrasyon:

• dihydrostreptomycin - 4 μg / ml;
• isoniazid 0.2 μg / ml:
• rifampicin 40 μg / ml:
• Ethambutol - 2 μg / ml.

Noong 2001, ang mga kritikal na konsentrasyon ay iminungkahi para sa mga sumusunod na second-line drugs (para sa isang kritikal na proporsyon ng 1%):

• capreomycin - 40 mcg / ml;
• protionamide - 40 mcg / ml;
• kanamycin - 30 μg / ml;
• viomycin - 30 mcg / ml;
• cycloserine 40 μg / ml;
• aminosalicylic acid - 0.5 μg / ml;
• ofloxacin - 2 μg / ml.

Ang mga resulta ng paglago ay sinusuri pagkatapos ng 4 na linggo bilang isang paunang at pagkatapos ng 6 na linggo ng paglilinang - bilang ang pangwakas na isa.

Upang matukoy ang sensitivity ng gamot sa pyrazinamide, na malawakang ginagamit sa modernong chemotherapy para sa tuberculosis, ang inirekumendang kritikal na konsentrasyon ay 200 μg / ml. Subalit, may ay pa rin walang pangkalahatang tinatanggap na paraan para sa pagtukoy ng paglaban sa bawal na gamot sa solid nutrient media dahil sa kanyang antibacterial aktibidad ay exhibited lamang sa isang acidic medium (PH <6), na kung saan ay technically mahirap upang mapanatili. Bilang karagdagan, maraming klinikal na kultura ng mycobacteria tuberculosis ay laging lumalaki sa mga itlog na kapaligiran na may acidic na kapaligiran.

Upang suriin ang kalidad ng mga resulta ng drug pagkamaramdamin pagsubok ng Mycobacterium, inirerekomenda na ang bawat bagong batch ng daluyan LJ kontrolin ang parallel pagpapasiya ng pagiging sensitibo ng ang standard na museo strain H37Rv. Bilang karagdagan, may mga tiyak na pamantayan ng microbiological na dapat mapanatili upang ang mga diskarte ay magbibigay ng mahusay na reproducible at tamang interpreted resulta. Kabilang dito ang posibilidad na mabuhay ng kultura ng Mycobacterium tuberculosis, ang mga panuntunan para sa pagkuha ng isang homogenous suspensyon at suspensyon kultura ng mga panuntunan ng Mycobacterium tuberculosis, ang representativeness ng napiling bacterial mass pagpili. Ang pagiging maaasahan ng pagpapasiya ng paglaban sa droga ay bumababa sa isang napakabigat na paglabas ng bacterial.

Kamakailan lamang, isang paraan para sa pagtukoy ng sensitivity ng gamot gamit ang mga awtomatikong sistema ay itinuturing na promising. Ang pinaka perpekto sa lugar na ito ay mga pagpapaunlad batay sa VASTES MGIT-960. Sa kasong ito, ang sensitivity ng gamot ng mycobacterium tuberculosis ay tinutukoy batay sa isang binagong pamamaraan ng mga sukat. Sa proseso ng pagpapasiya, ang rate ng paglaki ng mycobacterium tuberculosis sa isang control tube at sa test tubes na may mga gamot ay inihambing. Upang matukoy ang pagiging sensitibo sa streptomycin, isoniazid, rifamp-picin at ethambutol, mga supplement supplement at mga antibiotiko na kasama sa SIRE kit ay ginagamit. Upang matukoy ang sensitivity sa pyrazinamide, gamitin ang PZA kit. Sa kurso ng suspensyon test Mycobacterium tuberculosis inoculated tubes pagsubok sa mga bawal na gamot, pati na rin ang control tubes na may reconstituted suspensyon 100 beses para sa lahat ng mga bawal na gamot maliban pyrazinamide, kung saan ang pagsuspinde ay pagbabanto ng 10 beses. Ang criterion of stability ay ang tagapagpahiwatig ng paglago ng mycobacteria ng 100 GU kapag ang paglago ay nakakamit sa control tube 400 GU (tingnan ang "Mga pamamaraan ng kultura para sa paghihiwalay ng mycobacteria"). Ang accounting at interpretasyon ng mga resulta ay awtomatikong isinasagawa at itinakda ng input o ng napiling programa.

Bilang mga kritikal na konsentrasyon, ang pangwakas na konsentrasyon ay ginagamit sa isang test tube na may likido na nutrient medium. Sa kasalukuyan, ang mga kritikal na konsentrasyon ay binuo para sa parehong mga gamot sa ikalawang linya at pangalawang linya. Dapat pansinin na ang pagiging sensitibo ng mycobacteria tuberculosis sa cycloserine at aminosalicylic acid ay tinutukoy lamang sa mga itlog ng nutrient na itlog.

Dagdagan ng mga paliwanag sa trabaho protocol inilarawan sistema ay nagbibigay-daan sa pag-aaral ng gamot sensitivity pati na nakatuon kultura (siksik nakapagpapalusog daluyan), at paggamit ng pangunahing Mycobacterium MGIT-paglago sa vitro. Ang nakaraang pagpipilian makabuluhang binabawasan ang oras para sa kultura, na nagpapahintulot sa iyo upang makuha ang buong resulta ng kultura ng Mycobacterium tuberculosis (kabilang ang impormasyon sa drug sensitivity) pagkatapos ng 3 linggo mula sa petsa ng koleksyon ng mga materyales, habang ang tradisyunal na paraan ito ay posible upang makakuha lamang sa ika-3 buwan. Nang maglaon, ang mga resulta na nakuha, kapag ang pasyente ay nasa masinsinang yugto ng paggamot, ay maaaring magbayad para sa relatibong mataas na halaga ng pananaliksik.

[45], [46], [47], [48], [49], [50], [51],

Pagkakilanlan ng mycobacteria

Sa pagsasaalang-alang na ang ginamit na nutrient media ay hindi mahigpit na pumipili. Ang kasunod na pagkita ng kaibahan ng nakahiwalay na mycobacteria ay kinikilala bilang sapilitan. Ang pangangailangan para sa pagkita ng kaibhan ng mycobacteria ay dahil sa isang bilang ng mga tampok ng pathological proseso na dulot ng genus: iba't ibang mga kurso at kinalabasan ng tuberculosis at mycobacteriosis, ang pagkakaroon ng mga natural na gamot panlaban sa ilang mga bawal na gamot na anti-TB.

Ito ay kinikilala na ang pangunahing pagkakakilanlan ng Mycobacterium tuberculosis complex M. Nontubercular mula mycobacteria ay ginanap sa pamamagitan ng mga sumusunod na katangian: ang paglago rate sa solid nutrient media, pigmentation, kolonya morpolohiya, ang presensya ng acid pagtutol at temperatura sa pinakamainam na paglago.

Sa kasamaang palad, walang nag-iisang paraan ng laboratoryo upang mapagkakatiwlaan iibahin M. Tuberculosis complex mycobacteria mula sa iba pang acid-mabilis bacilli, gayon pa man ang kumbinasyon ng mga tampok na inilarawan sa itaas sa mga resulta na ibinigay sa ibaba ng isang bilang ng mga biochemical mga pagsubok ay nagbibigay-daan sa pagkilala ng Mycobacterium tuberculosis complex na may M. Malamang na 95%.

Para sa pagkita ng kaibhan ng Mycobacterium complex M. Tuberculosis (M. Tuberculosis, M. Bovis, M. BovisBCG, M. Africanum, M. Microti, M. Canettii at iba pa) mula sa mabagal na lumalagong mycobacteria ginagamit nontubercular pangunahing biochemical mga pagsubok na matuklasan ang pagkakaroon ng mga sumusunod na sintomas:

• ang kakayahang gumawa ng nikotinic acid (niacin test):
• aktibidad ng nitrate reductase;
• thermostable catalase;
• paglago sa medium na may sodium salicylate (1 mg / ml).

Bilang karagdagang mga pagsubok, ang paglago sa isang daluyan na naglalaman ng 500 μg / ml ng paranitrobenzoic acid o 5% sodium chloride ay maaari ding gamitin.

Maraming mga bacteriological laboratories ang tumutukoy sa mga mikroorganismo na ito sa antas ng kumplikadong, na dahil sa limitadong mga kakayahan ng mga laboratoryo at mga kakayahan ng pamamaraan ng mga espesyalista.

Sa karamihan ng mga kaso, gayunpaman, sa practice para sa differentiating M. Tuberculosis at M. Bovis ay sapat na ang mga sumusunod na mga pagsubok: niacin, para sa pagkakaroon ng nitrayd, ang pagkakaroon ng pagpaparehistro at pirazinamidazy paglago sa daluyan na naglalaman ng 2 ug / ml hydrazide ng thiophene-2-carboxylic acid. Ito ay isinasaalang-alang na ang mycobacteria ng M. Tuberculosis complex ay nailalarawan sa sumusunod na hanay ng mga character:

• mabagal na paglago (higit sa 3 linggo);
• paglago temperatura sa hanay ng 35-37 ^o C;
• kawalan ng pigmentation (garing);
• minarkahan ang acid-mabilis na kulay;
• isang positibong test niacin;
• isang positibong pagsusuri ng nitrate reductase;
• kawalan ng thermostable catalase (68 ^° C).
• Ang kawalan ng pag-unlad sa isang daluyan ng Levenstein-Jensen na naglalaman ng:
  • 1000 μg / ml sodium salicylate,
  • 500 μg / ml ng paranitrobenzoic acid,
  • 5% sodium chloride:
• paglago sa pagkakaroon ng 1-5 μg / ml thiophene-2-carboxylic acid.

Ang kaugnayan ng pagkakaiba ng nakahiwalay na mycobacteria ay mapapalaki sa pagtaas sa dalas ng pagtatala ng mga kaso ng HIV / AIDS na nauugnay sa tuberculosis o mycobacteriosis. Sa kasalukuyan, walang ganap na katiyakan ng pagiging handa ng mga praktikal na laboratoryo sa rehiyon upang maisagawa ang wastong gawaing ito.

[52], [53], [54], [55], [56], [57], [58], [59]

Immunological diagnosis ng tuberculosis

Mayroong isang bilang ng mga unibersal na phenomena, mga gamot at mga pagsubok sa immunological na orihinal na natagpuan tiyak sa tuberkulosis o sa modelo ng immune tugon sa mycobacteria. Kasama sa mga ito BCG Tuberculin, tulad ng isang palatandaan bilang cutaneous DTH (tuberculin - Pirquet at Mantoux reaksyon), ang reaksyon sa ilalim ng balat tuberculin sensitized hayop (Koch phenomenon). Ang isa sa mga unang antibodies sa nakahahawang sakit ay napansin din sa tuberculosis. Of course, ang mga mas malalalim ang pang-unawa ng mahusay na mekanismo tuberculosis kaligtasan sa sakit at ang kanilang genetic control, mas malaki ay maaaring ang paggamit ng immunological pamamaraan at mga gamot na nakakaapekto sa immune system, upang malutas ang mga praktikal na mga problema ng TB.

Ang pinakamahalaga at mahirap na praktikal na problema ay kasalukuyang itinuturing na ang detection ng tuberculosis sa proseso ng mass screening ng populasyon. Gayunpaman, sa kabila ng maraming mga ulat ng "mga tagumpay" (sa limitadong materyal), walang angkop na paraan ng imunidad (maaaring isalin sa "anumang armas") at isang gamot na angkop para sa layuning ito.

Ang mga pamamaraan ng imunolohikal, sa partikular na mga pag-aaral ng serological (pagpapasiya ng antigens, antibodies) at mga pagsubok sa tuberculin-provoking ay malawakang ginagamit sa clinical practice.

Sa unang lugar kabilang ang mga pag-aaral ng immunological na ginamit sa differential diagnosis, may mga serological na pamamaraan - ang pagpapasiya ng antigens at antibodies sa iba't ibang mga kapaligiran ng katawan.

Ang pagtitiyak ng mga antibodies sa mycobacteria tuberculosis ay depende sa antigens na ginagamit sa immunoassay. Ang isang makabuluhang halaga ng mga antigens ay iminungkahi, ang pinaka una ay Tuberculin PPD:

• PAP at iba pang kumplikadong mga paghahanda mula sa likido ng kultura;
• ultrasonic disintegration;
• Triton extract at iba pang kumplikadong paghahanda ng mga pader ng cell;
• 5-antigen (Daniel);
• 60-antigen (Coccito);
• lipoarabinomannan;
• cord-factor (trehalose-6,6-di-mycollate);
• phenolic at iba pang mga glycolipid;
• lipopolysaccharides;
• fibronectin-binding antigen;
• protina (kadalasang recombinant); 81.65,38,34,30,19,18,16,15.12 CDA, atbp.

Bilang isang resulta ng mga taon ng pananaliksik sa pamamagitan ng Russian at dayuhang siyentipiko nagsiwalat ng mga pangunahing batas at pagiging epektibo ng mga antibody serological diagnosis ng tuberculosis: ang mas kumplikadong antigen, ang mas mataas na sensitivity at mas mababang pagtitiyak ng pagsubok. Pagtitiyak sa iba't ibang bansa ay nag-iiba depende sa populasyon ng M. Tuberculosis impeksiyon at nontubercular mycobacteria mula sa pagdala ng pagbabakuna ng BCG at iba pa. Sa mga bata, ang impormasyon na nilalaman ng serodiagnosis ay mas mababa kaysa sa mga matatanda. Sa pangunahing tuberculosis (mas madalas na mga bata), ang kahulugan ng IgM ay mas nakapagtuturo. Na may pangalawang IgG. Sa mga pasyenteng na-impeksyon ng HIV, ang kaalaman ng halaga ng serodiagnosis sa pagtukoy ng mga antibodies ay nabawasan. Kahusayan pagpapasiya ng mga antibodies ay depende sa bilang ng "clinical aspeto": proseso aktibidad (ang presensya o kawalan ng "paghihiwalay" mycobacteria presence pagkabulok ng cavities, ang antas ng infiltration), ang pagkalat ng ang proseso, ang tagal ng daloy nito.

Ang sensitivity ng paraan ng enzyme immunoassay (ELISA) ay tungkol sa 70%. Hindi sapat ang pagiging epektibo ng pag-aaral dahil sa mababang pagtiyak nito. Noong nakaraan, ang posibilidad ng paggamit ng serological screening sa mga grupong may mataas na panganib, lalo na sa mga taong may mga pagbabago sa post-tuberculosis sa mga baga, ay isinasaalang-alang.

Upang madagdagan ang pagtitiyak ng ELISA, ang mga paghahanap para sa mas tiyak na mga antigens, kabilang ang mga nakuha sa pamamagitan ng genetic engineering: ESAT-6, atbp. (Tingnan sa itaas) magpatuloy. Ang paggamit ng mga partikular na partikular na antigens (38 kDa, ESAT) ay nagpapataas ng pagtitiyak. Ngunit makabuluhang binabawasan ang sensitivity ng pagtatasa. Kasama ng IFA (pang-eksperimento laboratoryo test systems. Hal Pathozyme ELISA kit) ay nagbibigay din ng kit na may lateral immunochromatographic pagsasala (Mycodot), pati na rin ang iba pang mga katulad na pagsusulit (dot-analysis sa membrane) na may isang visual na pagtatasa ng mga resulta ng pagsubok. Sa mga pagsusuring ito, ang pagtatasa ay isinasagawa para sa 10-30 minuto; hindi sila nangangailangan ng espesyal na kagamitan, nangangailangan sila ng isang visual na pagsusuri ng mga resulta, na nauugnay sa isang tiyak na pagiging paksa. Ang mga pamamaraan na ito ay may humigit-kumulang sa parehong sensitivity at mga katangiang katangian (70% at 90-93%, ayon sa pagkakabanggit) bilang tradisyonal na ELISA.

Ang paggamit ng mga pamamaraan ng pagtatasa ng immune ay may tiyak na halaga bilang karagdagan, isinasaalang-alang sa komplikadong mga pamamaraan na ginagamit, sa kaugalian na diagnosis ng tuberculosis, lalo na sa pagsusuri ng mga extrapulmonary form nito. Ang pinaka-epektibong paraan ng ELISA ay ang diagnosis ng tuberculosis meningitis sa pag-aaral ng cerebrospinal fluid. Sa kasong ito, ang sensitivity ng pagtatasa ay 80-85%, at ang pagtitiyak ay 97-98%. Mayroong data sa pagiging epektibo ng pagtuklas ng mga antibodies sa mycobacteria tuberculosis sa luha fluid sa diagnosis ng tuberculous uveitis.

Pagtatalaga ng gamma interferon synthesis sa vitro

Ang Gamma interferon (IFN-γ) ay isang partikular na factor sa immune defense na natanto sa pamamagitan ng pag-activate ng macrophage enzyme systems. Ang pagtatalaga ng IFN-γ synthesis sa pamamagitan ng sensitized T-lymphocytes ay nagiging sanhi ng kanilang pakikipag-ugnayan sa mga antigens ng mycobacteria.

Tulad ng mga antigens na ginamit bilang tuberculin PPD. At ang tukoy na antigen, na nakuha ng genetic engineering, sa mga partikular na antigen ESAT-6 (unang bahagi secreted antigen pagkakaroon ng isang molecular timbang 6 kDa) at CFP-10 (kultura pinagsalaan protina 10 kDa). Ang genetic engineering o recombinant antigens ay wala sa mga selula ng BCG na bakuna at iba pang mycobacteria. Kapag gumagamit ng tuberculin, ang mga resulta ng induction test IFN-γ ay maihahambing sa mga resulta ng test sa balat ng tuberculin (direct correlation). Kapag gumagamit ng genetically engineered antigens, ang mga resulta ng pagsubok ay mas tiyak at hindi nakadepende sa nakaraang pagbabakuna ng BCG. Kapag sinubok ang mga taong nabakunahan na walang kontak sa impeksyong tuberculosis, ang pagtitiyak ng pagsubok ay 99%. Ang sensitivity ng pagsubok sa mga pasyente na may tuberkulosis ay nag-iiba mula 81 hanggang 89%.

Mga pagsusuri at diagnostic tool ay binuo batay sa mga short-term paglilinang ng mga cell o purong dugo mononuclear mga cell na ihiwalay mula sa dugo na may antigens ng Mycobacterium tuberculosis sa vitro may kasunod na pagpapasiya ng IFN-γ konsentrasyon o sa pamamagitan ng pagbibilang ang bilang ng T-lymphocytes na synthesize IFN-γ. Ang konsentrasyon ng interferon na-synthesize sa vitro ay natukoy sa pamamagitan ng Elisa gamit monoclonal antibodies na nagbubuklod ng IFN-γ. Pagkatapos, gamit ang isang pag-calibrate pamantayan ng IFN-γ tinutukoy sa pamamagitan ng kanyang concentration sa test tube o Wells ng plato.

Kapag isinagawa ang Elispot test, ang bilang ng mga T-limocytes na nagta-synthesize ng IFN-γ. Ay binibilang sa ibabaw ng isang plato na pinahiran ng antibodies sa IFN-γ.

Developer Diagnosticum sa IFN-γ sa vitro sa pamamagitan ng pagtatalaga sa tungkulin, na kung saan ay inaprubahan ng Agency para sa gamot at mga produkto US, i-claim na ang isang test ay imposible kilalanin ang pagkakaiba ng tago impeksiyon ng TB mula sa mga aktibong tuberculosis. Samakatuwid, sa mga rehiyon na may mataas na antas ng impeksiyon, ang pagsubok ay hindi direktang diagnostic. Gayunpaman, sa ating bansa maaari itong magamit upang makilala ang impeksiyon ng tuberkulosis sa mga bata mula sa allergy ng post-bakuna, at upang masuri ang antas ng tiyak na kaligtasan sa sakit sa proseso ng paggamot.

Sa kasalukuyan, ang domestic test system para sa pagtukoy ng pagtatalaga ng IFN-γ synthesis sa pamamagitan ng partikular na mga antigens sa tuberculosis sa vitro ay pinag-aralan.

Ang immune status at kurso ng tuberculosis, immunocorrection

Sa proseso ng paggamot ng tuberkulosis sa mga tao, may mga pagbabago sa antigenemia at estado ng immune system.

Ang data sa mga pagbabago sa exudates at tisyu ay higit sa lahat kontradiksyon. Ang tanging bagay na maaaring nabanggit nang may kadahilanan ay na sa tubercular granulomas, bilang panuntunan, ang isang makabuluhang bilang ng mga aktibong T-lymphocytes ay napansin.

Makatutuya na magkakaroon ng dalawang karagdagang probisyon na kinakailangan upang maunawaan ang papel ng mga immunological na mekanismo sa paggamot ng tuberculosis sa mga tao:

• Ang mga pasyenteng may AIDS ay may partikular na mataas na saklaw ng maraming paglaban sa droga;
• na may maraming mga paglaban sa droga (at sa kawalan ng impeksiyong HIV), ang mga sakit sa kaligtasan (lalo na ang T-cell na link) ay partikular na makabuluhan.

Kapag tuberculosis malawak na ilapat ang iba't ibang mga pamamaraan ng immunomodulation: ito ay una ng droga kumikilos lalo na sa T-cell kaligtasan sa sakit at isang sistema ng mononuclear phagocytes (thymic hormone, isophorone, likopid, polioksidony et al.). Pati na rin ang buong (attenuated) mycobacteria at ang kanilang mga bahagi.

Molecular-biological diagnosis ng tuberculosis

Para sa molekular pamamaraan biology sa diagnosis ng mga nakakahawang sakit ay kinabibilangan ng, higit sa lahat, mga paraan batay sa pagmamanipula sa genomic materyal bacterial at viral pathogens upang makilala ang mga tiyak na genetic na materyal - segment DNA pagkakaroon ng isang nucleotide pagkakasunod-sunod partikular na para sa isang partikular na uri o pathogen strains upang pag-aralan tiyak na DNA sequence ng mga gene na tumutukoy sa pagiging sensitibo ng pathogen sa mga partikular na nakapagpapagaling sangkap, ngunit din upang pag-aralan ang functional aktibidad ng ilang mga genes ng pathogen. Molecular biological pamamaraan ay malawak sa siyentipikong pananaliksik at praktikal na application sa diyagnosis at pagsubaybay ng iba't-ibang mga bacterial at viral impeksiyon pagkatapos ng pagbubukas noong 1985, Carrie Myullisom (nagwagi ng Nobel Prize. 1989) polymerase chain reaction.

Mga prinsipyo at posibilidad ng polymerase chain reaction method

Pinahihintulutan ng PCR na palakasin (multiply) sa vitro ang sequence ng nucleotide (fragment ng DNA ng pathogen) sa loob ng ilang oras sa milyun-milyong beses. Ang reaksyon sa presensya ng nag-iisang mga kadena ng DNA ay tumutukoy sa napakataas na sensitivity ng assay.

Ang nucleotide sequence ng ilang mga rehiyon sa kadena ng DNA ay tumutukoy sa genetic identity ng microorganism, na nagpapaliwanag ng mataas na pagtitiyak ng PCR.

Ang halaga ng diskarteng ito para sa pagmamanman at pagsisiyasat sa mga katangian na sanhi ng Mycobacterium tuberculosis biological na mga katangian ng isang mikroorganismo pagkakaroon ng napaka-mabagal na paglago: pagdodoble oras ng Mycobacterium tuberculosis DNA kapag culturing ay 12-24 na oras.

Ang prinsipyo ng pamamaraan ng PCR ay binubuo sa paglaki - maramihang, milyun-milyong beses. Pagpaparami ng mga seksyon ng isang partikular na pagkakasunud-sunod ng DNA sa isang microvolume ng tubo sa panahon ng isang pag-ulit ng pag-ulit ng mga sumusunod na tatlong yugto ng reaksyon, na ang bawat isa ay nagpapasa sa ibang reaksyon ng temperatura:

• Stage I - denaturasyon ng double-stranded DNA sa pagpainit na may pagkakaiba ng mga kadena nito;
• II yugto - komplementaryong nagbubuklod (hybridization) ng primers (priming oligonucleotides) na may mga terminal na seksyon ng mga chain na mahigpit na tiyak, pinili para sa pagpaparami ng fragment ng DNA;
• Stage III - pagkumpleto ng kadena ng fragment ng DNA gamit ang thermostable DNA polymerase.

Para sa paglaki sa vitro, dapat mayroong mga molecule ng matrix DNA. Apat na uri ng deoxynucleoside triphosphates (nucleotides) na naglalaman ng naaangkop na nitrohenus base: adenine (A), thymine (T), guanine (G), cytosine (C); artipisyal na synthesized priming oligonucleotides (primers) na binubuo ng 18-20 base pares; matatag sa init DNA polymerase enzyme pagkakaroon ng temperatura sa pinakamainam ng 68-72 ^sa C, at magnesiyo ions.

Ang pagtitiyak ng PCR ay depende sa pagpili ng fragment ng DNA. Alinsunod sa mga ito, ang mga unggoy na oligonucleotides ay sinasadya. Ang katumpakan ng paghahalo at pagkumpleto ng kadena ng DNA ay dahil sa prinsipyo ng mga complementarity ng mga sumusunod na mga pares ng nitrogenous base: adenine-thymine, guanine-cytosine.

Upang matukoy ang genomic sakit na tuyo mycobacteria kumplikadong pinaka-mahusay na target ng paglaki sa karamihan ng mga sistema ng pagsubok pinili DNA fragment ng IS6110, na sa karamihan ng mga strains ng Mycobacterium tuberculosis genome ay may isang makabuluhang bilang (10-20) ng mga repetitions, na nagbibigay ng, kasama ng pagtitiyak, mataas na sensitivity ng esse. Kasabay nito, Mycobacterium tuberculosis strains inilarawan sa isang maliit na bilang ng mga repetitions o walang IS6110 fragment.

Paghihiwalay ng mga molecule ng DNA mula sa isang biological sample

Para sa PCR DNA Molekyul ng pathogen ay dapat na ihiwalay mula sa biological materyal sa isang minimum na dami, na may isang minimum na halaga nespepificheskoy DNA at iba't-ibang enzyme inhibitors - DNA polymerase.

Ang paghahanda ng mga sample ay dapat isagawa sa ilalim ng mga kondisyon na maiiwasan ang kontaminasyon ng mga sample sa pamamagitan ng nakahiwalay na mga molecule ng DNA. Upang gawin ito, ang pre-treatment ng silid na may ultraviolet, sahig at nagtatrabaho na ibabaw ng mga mesa at mga kasangkapan ay kinakailangan sa mga solusyon na naglalaman ng murang luntian. Kinakailangan din ang paggamit ng malinis na guwantes, mga tubes na hindi kinakailangan sa pagsubok at mga tip sa mga awtomatikong pipettes.

Upang ihiwalay ang DNA ng Mycobacterium tuberculosis mula sa clinical specimens (cerebrospinal fluid, bronchial wash) ay hindi naglalaman ng isang malaking bilang ng mga cell, cellular mga labi, o asing-gamot doon, sapat upang centrifuge sample sa 3-4 thousand. Rpm, idagdag sa ang putik 20-30 ul ng 2% solusyon triton X-100 at warmed sa 90 ^{tungkol sa} C para sa 30 min.

Para sa paghahanda ng plema sample ay dapat na mabisa pagkatunaw, na kung saan ay karaniwang ginagamit para sa isang 4% solusyon ng sosa haydroksayd at N-acetyl-L-cysteine (NALC) sa isang halaga ng 50-80 mg per sample - depende sa sample lagkit. Ang solusyon ng NALC ay dapat na ihanda ex tempore o NALC pulbos ay maaaring idagdag dry sa sample nang direkta. Pagkatapos ng likido, ang mga sample ay dapat na centrifuged para sa 15 minuto sa 3.5-4,000 rpm (3000 g) sa 50 ML vials na may tornilyo takip, ako E. Sa ilalim ng parehong mga kondisyon na inirerekomenda para sa presowing paghahanda ng plema.

Para sa pagkuha ng DNA mula sa mga pamamaraan sa bulitas ay ginagamit pinaka-madalas na batay sa ang paggamit ng isang 5-6 molar solusyon ng guanidine isothiocyanate lysis reagent bilang ang microporous particle at silikon oksido ( "diatomaceous lupa") sorbing DNA Molekyul. Nonspecific sangkap, kabilang inhibitors maaari, pagkatapos ay hugasan sa isang 2.5 molar solusyon ng guanidinium isothiocyanate at ethanol solusyon, kung saan pagkatapos, ang DNA Molekyul ay desorbed sa tubig, at ang mga halimbawa ay ginagamit upang maisagawa ang PCR. Upang gawing simple ang teknolohiya ng pagkuha ng DNA, ang "diatomaceous earth" ay kadalasang pinalitan ng magnetic microparticles na pinahiran ng silikon oksido. Sa kasong ito, ang isang espesyal na magnetic stand para sa microtubes ay ginagamit sa halip na centrifugation upang itulak ang mga particle.

Sa Russia, isang orihinal na pamamaraan para sa immunomagnetic paghihiwalay ng mycobacteria ay binuo, na sinusundan ng pagkuha ng DNA ng pathogen. Para sa Mycobacterium tuberculosis immunomagnetic paghihiwalay gamit ferroparticles laki ng 3-5 microns, pinahiran na may silica, na kung saan ay naka-attach sa pamamagitan ng chemical bonding polyclonal (kuneho) antibodies sa Mycobacterium tuberculosis. Ang mga halimbawa ng dura pagkatapos ng alkaline lysis ay neutralized na may isang acidic tris-HCl solusyon at inkubated sa isang immunomagnetic sorbent. Pagkatapos, ang mga immunoferroparticles ay nakolekta na may isang magnetic rod na may isang palitan na tip, inilipat sa isang microtube, at precipitated. 20-30 paggawa .mu.l ng isang 2% solusyon ng Triton X-100 at pinainitan para sa 30 minuto sa 90 ^o C. Supernatant ay ginagamit bilang DNA template para sa PCR pagtatasa.

Ang isang mahirap na problema ay ang paghihiwalay ng mycobacterium tuberculosis DNA mula sa mga biopsy specimens. Para sa enzyme biopsy, ang enzyme proteinase K ay ginagamit sa isang pangwakas na konsentrasyon ng 200-500 mg / l sa isang temperatura ng 56 ^° C magdamag. Dagdag dito, ang isa sa mga kilalang pamamaraan ay ginagamit. Ang sobrang nonspecific DNA sa pag-aaral ng PCR ng mga biopsy ay madalas na nagiging sanhi ng pagsugpo ng reaksyon, na nangangailangan ng paulit-ulit na pagkuha ng DNA.

Mga pamamaraan para makita ang mga resulta

Matapos makumpleto ang reaksyon, ang nakuha na mga fragment ng DNA ng pathogen ay kinilala ng iba't ibang mga pamamaraan.

Ang paraan ng gel electrophoresis ay kilala. Kaya nakuha DNA fragment ay kinilala sa pamamagitan ng positibong control na binubuo ng ang nais na partikular na fragment ng DNA o kilala muna ang sukat (bilang ng mga base na pares) fragment na kung saan ay natukoy sa pamamagitan ng standard molecular marker.

Sa pagkakaroon ng isang tiyak na pangulay, ang ethidium bromide ay kasama sa double-stranded DNA. Ang na-synthesized DNA fragment ay nakita bilang isang band na nagliliwanag sa ilalim ng pagkilos ng ultraviolet.

Ang sukat ng fragment ng DNA, na tinutukoy ng electrophoresis mula sa distansya mula sa pagsisimula, ay dapat tumutugma sa isang kilalang molecular weight marker o positibong kontrol.

Iba pang mga paraan ng pagtukoy ng mga resulta PCR batay sa paghahalo ng lahi ng isang solong-chain PCR produkto sa isang oligonucleotide komplimentaryong dito - DNA probe may label na may biotin, na sinusundan ng pagtuklas sa pamamagitan ng enzymatic reaksyon, halimbawa sa pamamagitan ng umiiral na streptavidin-biotin alkalina phosphatase.

Batay sa ganitong uri ng pagtuklas, ang PCR analyzers ay nalikha kung saan ang pagkakita ng mga resulta ng PCR ay awtomatikong isinasagawa bilang isang resulta ng pagbabasa ng optical density sa mga sample pagkatapos ng paghahayag ng enzymatic reaction.

Ang mga disadvantages ng mga pamamaraan na ito ay ang mga posibilidad ng kontaminasyon sa intralaboratory sa halip ng mga maikling piraso ng mga molecule ng DNA. Kapag ang mga molecule ay pumasok sa mga bagong sample, sila ay naging isang matrix para sa PCR at humantong sa mga maling positibong resulta.

Sa pagsasaalang-alang na ito, upang maiwasan ang mga huwad na positibong resulta, ang mga mahigpit na alituntunin para sa paghihiwalay at paghihiwalay ng mga lugar ay ipinakilala: upang kunin ang DNA mula sa mga biological na sample; lugar para sa pagtuklas ng mga resulta (electrophoresis) mula sa malinis na zone. Ang mga lugar na ito ay isang zone ng malamang kontaminasyon. Ang isa pang nakahiwalay na lugar ay isang malinis na silid para sa pagpapasok ng mga sample ng DNA upang masuri sa mga tubo na may isang reaksyon para sa PCR. Sa wakas, ito ay ipinapalagay na ang pangunahing aparato - ang DNA-amplifier - ay dapat ilagay sa isang hiwalay, posibleng opisina, silid.

Upang maiwasan ang contamination ng mga produkto ng mga naunang reaksyon - ang ilang mga sistema ng pagsubok Likon-amp PCR halip dezoksinukleozidtimidina naglalaman dezoksinukleoziduridin na, kapag in vitro synthesis circuit nakasama sa halip sa tamang posisyon, ibig sabihin, Ang nitrogenous base ng thymine kasalukuyan sa katutubong DNA ay pinalitan ng uracil. Uracil DNA glycosylase ay idinagdag sa ang reaksyon pinaghalong sa analyte, destroys lamang contaminating fragment deoxyuridine, ngunit hindi DNA katutubong nasuri. Lt; / RTI & gt; Ang kasunod na pagpainit sa 94 ^° C ay nagpapawalang-bisa sa enzyme na ito at hindi nakakaapekto sa paglaki sa PCR.

May isang test system na batay sa isothermal amplification ng rRNA, kung saan ang reverse transcription at synthesis ng molecules ng DNA ay unang isinagawa. Na, sa turn, ay isang matris para sa kasunod na pagbubuo ng mga molecule ng RNA. Nakikita ang mga RNA amplicon gamit ang isang proyektong DNA ng acridine-stained kapag hybridized sa isang solusyon sa reaksyong tubo. Ang pamamaraang ito, bilang karagdagan sa mataas na sensitivity, ay may bentahe ng pagsusuri sa isang tubo, na pumipigil sa kontaminasyon. Ayon sa mga may-akda, ang sensitivity ng pamamaraang ito sa mga sample ng paghinga ay umaabot sa 90% na may tiyakin na 99-100%.

Ang mga bagong pamamaraan ng pagtuklas ay ipinatupad sa real-time na PCR. Ang mga pamamaraan na ito ay naiiba lalo na sa PCR at ang pagtuklas ng mga resulta nito ay isinagawa nang sabay-sabay sa isang closed tube. Ito ay hindi lamang pinasimple ng teknolohiya sa pamamaraan ng pag-aaral, kundi pinipigilan din ang kontaminasyon ng mga silid ng laboratoryo at mga sample ng pagsubok sa mga produkto ng nakaraang PCR.

Sa real-time na mga resulta PCR detection ay dahil sa pag-ilaw na nagaganap sa panahon ng isang fluorogenic hybridization probe DNA na may amplifitsi Rui-PCR sa panahon ng isang tiyak na DNA fragment. Istraktura fluorogenic DNA probes constructed upang ang mga fluorescent marker ay inilabas bilang isang resulta ng enzymatic reaksyon o distanced mula sa inumin Molekyul na pag-ilaw lamang sa ilalim ng mga tiyak na paghahalo ng lahi sa ang nais na DNA Molekyul na amplified sa panahon ng PCR. Bilang ang bilang ng probe molecule hybridized na may pagtaas sa pag-ilaw ay proporsyonal sa ang napansin antas ng bilang ng mga molecule ng amplified produkto. Dahil sa bawat numero na cycle ng PCR fragment DNA Molekyul ay multiplied sa pamamagitan ng kalahati, ang bilang cycle kung saan-ilaw ay natutukoy at pinatataas inversely proporsyonal sa bilang ng DNA molecule sa unang sample. Kung ang reaksyon ay upang ipakilala bilang ang calibrator ilang iba't-ibang mga kilalang mga concentrations ng mga molecule kaukulang DNA fragment ng Mycobacterium tuberculosis, gamit ang computer program maaaring kalkulahin at ang halaga ng genomic DNA sa materyal na pagsubok.

Ang bawat standard na sample ay na-duplicate. Ang quantitative criterion ay ang pinakamaliit na bilang ng mga pag-ikot ng PCR na kinakailangan para sa simula at paglago ng tinutukoy na pag-ilaw. Sa abscissa - ang bilang ng mga siklo; Ang ordinate ay ang halaga ng pag-ilaw. Ang mga konsentrasyon ng DNA ay inversely proporsyonal sa bilang ng mga cycle na kinakailangan para sa paglitaw ng pag-ilaw. Sa kanang haligi (21-32), ang mga numero ng cycle para sa mga katumbas na konsentrasyon ay minarkahan. Mga pagkakaiba sa pagitan ng 10-fold concentrations ng mga fragment ng DNA 10 ² -10 ⁶ ml - 3.2-3.4 na cycle. Para sa dalawang pasyente, ang mga konsentrasyon ng mga fragment ng IS6110 ay mga 10 ³ / ml at 10 ⁴ / ml. Sa pagsasaalang-alang ang bilang ng mga repetitions (6-20) ng mga fragment na nasuri sa genome ng Mycobacterium tuberculosis, ang bilang ng myco-bacteria sa clinical sample ay halos 100 at 1000 na mga cell, ayon sa pagkakabanggit.

Ang paggamit ng PCR sa diagnosis ng tuberculosis

Ang pamamaraan ng PCR ay pinaka ginagamit para sa pinabilis na diagnosis ng tuberculosis - pagtuklas ng mycobacterium tuberculosis sa clinical specimens: dura. Bronchial lavage, pleural exudate, ihi, cerebrospinal fluid, punctates osteolysis, female genital tract aspirates at biopsies naiiba. Sa pag-aaral sa Netherlands 500 plema at bronchial lavage samples mula sa 340 mga pasyente na may nakumpirma diyagnosis ng tuberculosis ay pinag-aralan na ihambing ang pagiging sensitibo ng PCR pamamaraan, mikroskopya at kultura mga pag-aaral smears. Ang sensitivity ng pagtatasa ay 92.6.88.9 at 52.4%, ayon sa pagkakabanggit. Ang pagtitiyak ng lahat ng mga pamamaraan ay tungkol sa 99%.

Ang pagiging epektibo ng detection ng mycobacterium tuberculosis sa pamamagitan ng smear microscopy, seeding sa Levenstein-Jensen medium, VASTES test system at PCR analysis ay inihambing. Ang PCR ay nagpakita ng sensitivity ng 74.4%, mikroskopyo - 33.8%, pagsanib sa isang makakapal na medium - 48.9% at VASTES - 55.8%. Ang average na oras ng pagtuklas para sa seeding sa isang Levenstein-Jensen medium ay 24 na araw. MGA BITUIN - 13 araw, PCR - 1 araw.

Ang mga posibilidad ng paggamit ng PCR bilang isang sensitibo at mabilis na pamamaraan para sa pagsubaybay sa pagiging epektibo ng paggamot sa tuberculosis ay tinalakay din.

Detection ng Mycobacterium tuberculosis DNA sa pamamagitan ng PCR ng mabisang chemotherapy tinutukoy sa loob ng isang mas matagal na oras - sa average na 1.7 na buwan kumpara sa pahid na tinukoy sa ilalim ng fluorescent mikroskopya, at sa pamamagitan ng 2.5 na buwan kumpara sa bacteriological pagsusuri.

Pagsusuri ng extrapulmonary forms ng tuberculosis

Halaga ng isang sensitibong PCR pamamaraan ay partikular na malaki para extrapulmonary mga form, tulad ng ito ay bumubuo sa ilalim ng mga klinikal at radiographic pamamaraan maginoo bakteryolohiko pamamaraan para sa pagpapasiya ng Mycobacterium tuberculosis sa diagnostic materyales epektibo.

Sa imbestigasyon ng ihi sample PCR resulta ay positibo sa 16 ng 17 pasyente na may aktibong TB at negatibong ihi 4 pasyente inactive bato tuberculosis at 39 pasyente na may ihi sistema sakit nontubercular.

Ang pagiging epektibo ng pag-aaral ng PCR sa pag-aaral ng mga aspirasyong buto ng buto sa mga pasyente na may lagnat ng hindi kilalang pinagmulan ay ipinakita sa mga kaso ng pinaghihinalaang tuberculosis. Upang ma-diagnose ang tuberculous lymphadenitis, ang 102 mabutas aspirate at isang biopsy specimen ng 67 na bata na pinaghihinalaang tuberculous lymphadenitis ay pinag-aralan sa mga bata. Ang mga positibong resulta ay nakuha: 71.6% real-time na PCR. Pag-ilaw mikroskopya - 46.3%. Kultura pananaliksik - 41,8%. Sa pag-aaral ng 50 lymph node biopsies sa mga pasyente na may "cat scratch" na sakit, ang lahat ng mga resulta ay negatibo. Kaya, ipinakita ang 100% na pagtiyak ng PCR analysis. Sa parehong trabaho, sa pagbutas ng biopsy ng mga lymph node, ang posibilidad ng pagtuklas ng M. Avium ay ipinakita.

Ang diagnosis ng tuberculosis ng kawalan ng katabaan ng babae na genital area, tulad ng nakilala, ay isa sa mga pinakamahirap na problema sa diagnosis. Kapag sinusuri ng PCR biopsies ng endometrium, endometrial aspirates liquid samples mula sa Douglas space 14 (56%) ng 25 pasyente napagmasdan laparoscopically pinaghihinalaang tuberculosis, positibong resulta ay natamo. Paggamit ng smear microscopy at kultura, 1 at 2 mga resulta ay nakuha, ayon sa pagkakabanggit. Ang mga kasong ito ay positibo din sa PCR. Karamihan sa mga resulta ng PCR-positibo ay may kaugnayan sa mga kaso na may mga katangian na palatandaan ng tuberculosis ayon sa histological na pag-aaral; isang mas maliit na bilang - na may hinala ng tuberculosis ayon sa laparoscopy data. Isang positibong resulta lamang ng pagtatasa ng PCR ang natamo sa kawalan ng laparoscopic data para sa tuberculosis.

Sa pag-diagnose ng extrapulmonary forms ng tuberculosis, kadalasang may mga katanungan ang mga clinician tungkol sa posibilidad ng pag-detect ng isang pathogen kapag sinusubok ang mga sample ng dugo gamit ang pamamaraan ng PCR. Ipinapahiwatig ng literary data na ang pagtuklas ng DNA mula sa mycobacterium tuberculosis mula sa mga sample ng dugo ay posible na may malawak na anyo ng impeksyon sa HIV. Ang DNA ng mycobacterium tuberculosis ay nakita lamang sa pangkalahatan na tuberculosis ng iba't ibang organo sa mga pasyenteng may transplanted kidney at immunosuppression.

[60], [61], [62], [63], [64], [65]

Mga identipikasyon ng mga species ng mycobacteria

Ang PCR pamamaraan ay maaaring maging lubos na mabisa para sa mabilis na pagkilala ng mycobacteria ng tuberculosis complex at ang ilang mga species ng mycobacteria nontubercular pagkatapos matanggap ang kanilang unang pag-unlad. Sa kasong ito, ang paggamit ng PCR ay maaaring i-save ng 7-10 araw na kinakailangan para sa kasunod na kultura positibong pagkakakilanlan. Ang pagsusulit ng PCR ay napaka-simple, dahil hindi ito nangangailangan ng kumplikadong paghahanda ng sample ng klinikal na materyal upang makamit ang mataas na sensitivity. Sa pag-aaral 80 positibo sa system na ito test (MB Vasto. Organon kumpanya) ang lahat ng positibong kultura ng PCR ay mahigpit na tiyak at gaganapin para sa 1 araw. Upang makilala ang iba pang mga species ng mycobacteria sa paghahanda ng DNA ng pathogen kultura hybridized may mga tiyak na probes DNA may label na may acridine at strains nakita ng ang hitsura ng chemiluminescence pamamagitan chemiluminometer o nitrocellulose piraso na may isang visual na pagtatasa pagkatapos ng paghahalo ng lahi. Sa tulong ng gayong set, isang limitadong bilang ng mga species ang natukoy: ang mycobacterium tuberculosis complex. M. Avium, M. Avium complex, M. Kansasii at M. Gordonae.

A.Telenti et al. Binuo rin ang isang relatibong simple at murang paraan ng species pagkakakilanlan ng clinically mahalagang species ng mycobacteria pamamagitan ng PCR at kasunod na paggamot na may dalawang mga paghihigpit enzymes (enzymes pagkakaroon ng mga ari-arian-cut ng isang DNA Molekyul sa mga tiyak na mga puntos). Ang fragment ng DNA ay pinalaki. Pag-encode ng init shock protina (65 kDa), at pagkatapos ay ginagamot sa mga nagresultang PCR DNA fragment ng 439 nucleotide pares ng hiwa-hiwalay ng dalawang enzymes - Bste II at Hae III. Pagkatapos ay pinag-aralan ng gamit agarose gel electrophoresis nakuha ng dalawang mga produkto, pagtukoy ng kanilang laki (bilang ng mga base na pares) gamit ang isang standard na hanay ng DNA fragment (molecular DNA-marker) ang haba 100-1000 base na pares. Sa bawat isa sa mga tiyak na mga uri (M. Tuberculosis, M. Avium, M. Intracellulare, M. Kansasii, M.fortuitum) matagpuan dalawa o tatlong DNA fragment ng iba't ibang mga laki para sa bawat paghihigpit enzyme. Ang kumbinasyon ng iba't ibang laki ng DNA na nakuha ay nagpapahintulot na makakaiba ang mga species na ito sa kanilang mga sarili.

Ang teknolohiya ng biological DNA microarrays ay binuo. Na makakatulong sa makilala ang higit sa 100 species ng mycobacteria sa isang pag-aaral.

Ang species pagkakakilanlan ay maaari ring ginanap sa pamamagitan ng PCR paglaki ng 16S rRNA variable na rehiyon na sinusundan ng sequencing ng amplicons kapag inihambing na may kaukulang pangunahing istraktura na nagbibigay-daan sa ang pagkakakilanlan ng higit sa 40 species ng mycobacteria.

Sa tulong ng PCR, ang isang pagkakakilanlan ng species sa loob ng mycobacterium tuberculosis complex ay maaari ring isagawa, kabilang ang pagkita ng kaibahan ng M. Bovis at M. Bovis BCG. Upang gawin ito, ang pagkakaroon o pagkawala ng ilang mga gene sa genomic na rehiyon ng RD1 ay sinuri. RD9 at RD10. Ang RD1 ay wala sa M. Bovis BCG, ngunit naroroon sa virulent species, kabilang ang M. Bovis.

Pagpapasiya ng sensitivity ng gamot ng Mycobacterium tuberculosis sa pamamagitan ng PCR

Layunin ng molekular genetic pamamaraan para sa drug pagkamaramdamin o paglaban ng Mycobacterium tuberculosis mabawasan upang makilala ang mga mutasyon sa partikular na pagkakasunud-sunod nucleotide ng mga kilalang mga gene. Basic pamamaraan ay batay sa alinman sa direktang prochityvanii (sequencing) ng mga pagkakasunud-sunod pagkatapos ng paglaki o paghahalo ng lahi ng biotin-label DNA fragment amplified sa panahon ng probes PCR DNA. Ang parehong mga alternatibo sangkot sa pagkikilala ng mga nucleotide pamalit sa pagkakasunud-sunod na ang paggamit ng DNA probes humantong sa kawalan o hindi kumpleto paghahalo ng lahi sa isang nitrocellulose lamad gamit enzyme conjugate (streptavidin-alkalina phosphatase) - Pamamaraan LIPA-Rif-TB.

Pamamaraan para sa pagsukat ng pag-ilaw sa isang lokal na fixed on microsections DNA probes komplimentaryong sa kilala mutations sa PCR amplified gene rehiyon responsable para sa paglaban o mga drug sensitivity, na tinatawag na mikrobiochipov paraan. Ang pangunahing algorithm para sa pagdala ng pananaliksik na ito ay ang mga sumusunod. Pagkatapos ng paghihiwalay ng DNA mula sa isang clinical sample o kultura ng mycobacteria ay kinakailangan upang magsagawa ng PCR paglaki ng mga kaugnay na mga fragment ng rpoB gene na responsable para sa bawal na gamot sensitivity sa rifampicin o katG at Inha gene pag-encode protina ng Mycobacterium ay responsable para sa pagiging sensitibo sa Isoniazid. PCR resulta ay nasuri ng agarose gel electrophoresis, kung saan kumpirmahin ang pagtanggap ng mga naaangkop na mga fragment DNA ng mga ninanais na haba. Pagkatapos, ang ikalawang ikot ng PCR ay ginaganap upang ipakilala ang isang label ng fluorescent sa DNA. Ang mga resulta ng PCR ay muling nakumpirma ng gel electrophoresis. Pagkatapos noon, paghahalo ng lahi ay natupad (magdamag incubation), na sinusundan ng paghuhugas ang mga nagresultang materyal sa biochip, na kung saan ay isang malaking bilang ng mga nakapirming sa isang maliit na glass plate maikling DNA strands (probes) na nagtataguyod sa nucleotide sequence ng drug-sensitive type Mycobacterium tuberculosis sa mga punto ng mga posibleng mutations. Pati na rin sa mga pagkakasunud-sunod ng mutant na responsable para sa paglaban sa droga. Lokasyon ng DNA probes sa plate - mahigpit na tinukoy, at ang antas ng pag-ilaw-obserbahan sa paghahalo ng lahi upang matukoy ang mga resulta gamit ang isang espesyal na aparato pagbabasa ay naka-install. Sa pagsasaalang-alang na ito, natutukoy ang mga resulta ng pagtatasa sa pamamagitan ng isang espesyal na programa sa computer.

Sa mga nagdaang taon, ang mga alternatibong pamamaraan para sa pagtukoy sa pagiging sensitibo sa droga ng mycobacteria tuberculosis batay sa real-time na teknolohiya ng PCR ay na-develop, na nagpapahintulot sa pag-uugali ng mga pag-aaral sa isang closed-tube test.

Sa Fig. 13-13 ay nagpapakita ng mga resulta ng pagsusuri ng clinical isolates ng Mycobacterium tuberculosis sa pagtukoy paglaban sa rifampicin pamamagitan ng PCR sa real time: 218 - control sample (sensitibo sa rifampicin); 93 - positibong kontrol para sa mutation ng Ser-Trp TCG-TGG; 4482 - positibong kontrol para sa mutation ng Ser-Leu TCG-TTG; 162-322 - mga eksperimentong sample. Resulta ng pagkalkula ng kinetic curves ng paglaki sa 4 na channel: channel 1: 393 - positibong kontrol para sa mutation ng Ser-Trp TCG-TGG; channel 2: 4482 - positibong kontrol para sa mutation ng Ser-Leu TCG-TTG; 162, 163, 172, 295 - mga eksperimentong sampol; channel 4: kinetic curves ng paglaki ng lahat ng mga sampol na lumalahok sa eksperimento. Positibong kontrol sa reaksyon ng paglaki. Konklusyon: Ang mga resulta ng pag-aaral nagsiwalat ng mga sumusunod na mga mutations na matukoy paglaban sa rifampicin: sa mga halimbawa 162,163,172,295 - Ser-Leu TCG-TTG. Ang parehong prinsipyo ay ginamit upang matukoy ang paglaban ng gamot sa isoniazid para sa mga gen na katG at inhA, na tumutukoy sa mga madalas na mutasyon.

[66], [67], [68], [69], [70], [71],

Pinagmulan ng pagkakakilanlan ng mycobacterium tuberculosis

Ang pinaka-lubusan-aral paraan ng pagkakakilanlan ng mga strains ng Mycobacterium tuberculosis ay isang diskarte na tinatawag na paghihigpit fragment haba polymorphism (RFLP RFLP,. O sa Ingles na bersyon) at kung saan ay batay sa fragmentirovanin (pagbabawal) ng Mycobacterium tuberculosis DNA enzyme Pvu II at ang mga fragment nakuha kasunod na paghahalo ng lahi sa ilang mga partikular na pagkakasunud-sunod sa DNA ang paulit-ulit na elementong ito ay IS6110. Intraspecific na pabagu-bago natanto sa pamamagitan ng iba't-ibang mga numero ng mga repetitions IS6110 at ang kanilang mga lokasyon sa DNA. Pati na rin ng iba't-ibang mga distansya sa pagitan ng ilang mga punto ng pag-atake paghihigpit enzyme (paghihigpit site) at ang elemento IS6110. Ang teknolohiyang ito ay sobrang kumplikado at uminom ng oras. Pagkatapos ng paggamot na may DNA nahango mula sa isang kultura ng Mycobacterium tuberculosis, gel electrophoresis ay ginanap sa isang paghihigpit enzyme, at pagkatapos ay inilipat DNA fragment ng iba't ibang mga haba sa isang nitrocellulose lamad, paghahalo ng lahi ay natupad na may fragment ng IS6110-element at napansin sa pamamagitan ng mga enzymatic reaksyon. Ang resultang pattern tiyak na DNA banda characterizes ang partikular na strain ng Mycobacterium tuberculosis. Sa tulong ng pagtatasa ng computer, ang pagkakakilanlan o kaugnayan ng mga strain ay ipinahayag. Sa kabila ng katotohanan na ang pamamaraan ng RFLP ay ang pinaka-diskriminasyon, ibig sabihin. Kinikilala ang pinakamalaking bilang ng mga pagkakaiba sa mga strains aralan, ito ay hindi epektibo para sa isang maliit na bilang (mas mababa sa 5) IS6110-umuulit sinusunod sa ilang mga strains. Sa Fig. 13-14 ay nagpapakita ng mga resulta ng RFLP-type ng strains.

Ang isang alternatibo ay maaaring ang paraan ng spoligotyping - pagtatasa ng polymorphism ng spacer sequences ng DNA - intermediate sa pagitan ng direktang pag-uulit ng rehiyon ng DR. Kapag nagsasagawa spoligotyping strains ginanap PCR may primers DR-takda sa bahaging ito, pagkatapos niyon fragment ng iba't ibang mga haba ay nabuo kung saan upang lumikha ng hybrid na may variable intermediate bahagi ng DNA. Ang pagsusuri ng mga spacer sequence ng rehiyon ng DR ay iniharap. Ayon sa mga mananaliksik, mas simple, produktibo at angkop para sa pangunahing screening ng mga strains at paunang epidemiological analysis, pati na rin ang pananaliksik direkta klinikal na materyal.

Malinaw, mas epektibo at technologically magagamit na paraan ay isang VNTR (isang pagpapaikli ng mga salitang Ingles), o ang pamamaraan para sa pagtukoy ng mga variable na bilang ng mga magkasabay umuulit sa eksaktong DNA ng Mycobacterium tuberculosis. Ang pamamaraan na ito ay batay lamang sa paggamit ng PCR at hindi nangangailangan ng karagdagang pagmamanipula. Dahil ang bilang ng mga tandem ay naulit sa magkakaibang mga strain at sa iba't ibang lugar ay iba, ang mga fragment ng iba't ibang laki ay tinutukoy at pinag-aralan sa nagresultang electrophoregram ng mga produkto ng PCR. Ayon sa mga mananaliksik, ang paggamit ng VNTR ay nakakamit ng isang mas mataas na antas ng diskriminasyon ng mga strain kaysa sa pamamaraan ng RFLP.

Karamihan sa pansin ay binabayaran sa mga nakaraang taon sa pamamahagi ng mga strains ng Mycobacterium tuberculosis ng pamilyang W-Beijing (paminsan-minsan na tinatawag na Beijing strain), na kung saan ay higit sa lahat ng mga gamot na lumalaban.

Mga pangunahing pangangailangan sa kalidad ng molecular biological research

[72], [73], [74], [75],

Mga pangunahing regulasyon para sa PCR

Mga order Russian Ministry of Health: №45 mula sa 2000/02/07 g .. Number 109 mula sa 2003/03/21 g .. Number 64 mula sa 2000/02/21, ang Guidelines: 1.3.1888-04 "Samahan ng trabaho sa pag-aaral gamit PCR materyal na nahawaan ng pathogenic biological mga ahente ng mga grupo III-IV ng pathogenicity "; 1.3.1794-03 "Pag-organisa ng trabaho sa pag-aaral ng materyal na PCR, na nahawaan ng mga mikroorganismo ng mga grupong pathogenicity ng I-II". 2003; 3.5.5.1034-01 "Paglilinis sa gas ng materyal, impeksyon bacteria I-IV pathogenicity grupo kapag gumagamit ng PCR," 2001 Ang appendix 11 sa pinag-isang mga tagubilin para sa microbiological pamamaraan na pagsusuri sa pagkilala, diagnosis at paggamot ng tuberculosis.

[76], [77], [78]

Ang kawani

Pagpapatupad ng mga molecular biological pananaliksik ay maaaring i-hold ang mga doktor ng clinical laboratoryo diagnostic, mga doktor bacteriologists, virologists, mga doktor, biologist, clinical diagnostic laboratoryo, pati na rin mga espesyalista sa pangalawang medikal na edukasyon, ang pumasa sa pagdadalubhasa at advanced na pagsasanay sa inireseta paraan.

Pag-aayos ng mga lugar ng laboratoryo

Kinakailangan ang mga sumusunod na silid ng laboratoryo:

• Ang lugar ng paghawak ng sample ay isang laboratoryo na inangkop upang gumana sa mga nakakahawang mga ahente ng mga grupong pathogenicity III-IV, ayon sa Methodical Instructions 13.1888-04.
• Zone para sa paghahanda ng mga mixtures ng reaksyon PCR - laboratory room, na nagbibigay ng proteksyon mula sa panloob na kontaminasyon ng laboratoryo - "malinis" na zone.
• • Kung ang electrophoresis o hybridization ay ginagamit upang pag-aralan ang mga produkto ng PCR. Laboratory room kung saan ang pinaraming DNA fragment ay nahango mula sa mga tubes at paglaki, ayon sa pagkakabanggit, ay maaaring makakuha ng sa kapaligiran, alinsunod sa mga kinakailangan para sa PCR laboratoryo (1.3.1794-03 Guidelines, Guidance 1.3.1888-04) ay dapat na ganap na ay nakahiwalay mula sa mga lugar na nakalagay sa mga naunang talata. Dapat itong ibinukod mula sa kilusan zone sa zone electrophoresis para sa sample handling at isang "malinis" na lugar ng anumang mga tauhan, kagamitan, ang anumang mga materyales at mga bagay, pati na rin ang paglipat ng hangin sa pamamagitan ng mga sistema ng bentilasyon, o bilang resulta ng mga draft. Ang zone na ito ay hindi kinakailangan para sa fluorimetric detection ng mga produkto ng PCR.
• Ang silid para sa dokumentasyon at pagproseso ng mga resulta ay may mga computer at mga kinakailangang kagamitan sa opisina. Ang kuwartong ito ay maaaring maglaman ng kagamitan na nagbibigay ng pagtuklas ng mga produkto ng PCR nang hindi binubuksan ang tubo. - Mga fluorescent PCR detectors at thermal cyclers para sa real-time na PCR.

Ang mga kinakailangan sa kalusugan at epidemiological para sa pangunahing paggamot ng plema ay katulad ng standard na microbiological requirements para sa pagtatrabaho sa mycobacteria tuberculosis.

[79], [80], [81], [82],

Pagkumpleto ng mga kagamitan sa laboratoryo para sa mga diagnostic ng PCR

Kasama sa laboratoryo ang mga kagamitan para sa mga sumusunod na kuwarto.

• kuwarto para sa paghahanda ng sample, ay naglalaman ng mga sumusunod na kagamitan: laminar ng II klase ng proteksyon "SP-1.2": solid-estado termostat na may isang pinainit na takip para sa test tubes ng "Eppendorf" uri; microcentrifuge sa 13,000 rpm; isang centrifuge (puyo ng tubig); refrigerator na may temperatura mula sa -20 ^о С hanggang 10 ^° C; mga pipette ng dami ng variable ng "Rroline" na serye; isang pump na may OM-1 na bitag na bitag; isang tripod para sa pipettes; tripod workstation 200x0.5 ml; tripod workstation 50x1.5 ml; Nakatayo para sa pag-iimbak ng tubes sa pagsubok ng 80x1.5 ml;
• Silid ng paghahanda ng pinaghalong reaksyon: proteksiyon kamara PCR-box ("Laminar-C. 110 cm); centrifuge - Vortex; Variable volume pipettes ng serye ng Proline; isang tripod para sa pipettes; tripod workstation 200x0.2 ml; Nakatayo para sa pag-iimbak ng tubes sa pagsubok ng 80x1.5 ml; refrigerator na may temperatura mula sa -20 ^о С hanggang 10 ^° C;
• silid para sa electrophoresis: camera para sa pahalang na electrophoresis; supply ng kuryente; transilluminator;
• DNA amplifiers o nucleic acid analyzer (PCR sa real time) na may isang computer at software; maaaring ilagay sa anumang ekstrang kuwarto. Kung ginagamit ang real-time na teknolohiya ng PCR. Hindi kinakailangan ang kuwarto para sa electrophoresis.

[83], [84], [85], [86]

Panlabas na kalidad na kontrol

Upang maging tiwala sa pagkuha ng mga maaasahang maaasahang resulta, ang mga laboratoryo ay dapat lumahok sa sistema ng panlabas na pagsusuri ng kalidad ng pananaliksik sa laboratoryo.

Ang mga kalahok sa sistema ng kontrol sa kalidad ay tumatanggap; 12 vials ng freeze-tuyo bacterial cell pagsususpinde, dalawang ng kung saan ay naglalaman ng E. Coli E. Bunot, 3 vials na may Mycobacterium tuberculosis (avirulent strain) sa 10 ² / ml; 3 ampoules na may mga cell ng isang katulad na strain sa isang konsentrasyon ng 10 ⁴ / ml; 2 ampoules sa non-tuberculosis mycobacteria M. Avium-intracellulare at M. Kansasii sa isang konsentrasyon ng 10 ⁵ / ml.

Ang mga ibinahagi na pagsusuri para sa panlabas na pagtatasa ng kalidad ay sinuri sa dalawang malayang laboratoryo na may malawak na karanasan sa larangan na ito.

[87], [88]