Mga pang-eksperimentong modelo ng osteoarthritis

Ang kartilago ay isang mataas na dalubhasang tissue na naglalaman lamang ng isang uri ng mga selula (chondrocytes), na nailalarawan sa kawalan ng dugo at lymphatic vessels. Ang nutrisyon ng kartilago ay pangunahin sa pamamagitan ng pagsipsip mula sa synovial fluid. Ang metabolismo ng chondro-cytes ay kinokontrol ng isang bilang ng mga matutunaw na salik na ginawa sa pamamagitan ng mga chondrocyte at nakapaligid na mga tisyu. Ang pag-andar ng chondrocytes ay depende rin sa komposisyon ng medium ng extracellular (oxygen na pag-igting, konsentrasyon ng ion, pH, atbp.), Komposisyon ng VCM, pakikipag-ugnayan ng cell at matrix, mga pisikal na signal. Ang pangunahing gawain ng pang-eksperimentong pagmomolde ay ang pagbuo ng mga kultura sa ekstraselyular na kapaligiran nang hindi binabago ang phenotype ng mga mature cells. Ang ikalawang gawain ay upang lumikha ng mga kultura para sa pag-aaral ng mga hindi pa panahon, maantala, maikli o pangmatagalang tugon ng chondrocytes sa kemikal at / o pisikal na signal. Mga Pag-aaral sa vitro ay nagbibigay din ng pagkakataon upang pag-aralan ang pag-uugali ng Chondrocyte sa osteoarthritis. Ang ikatlong gawain ay ang pagpapaunlad ng mga kapwa nakakapagamot na sistema, na nagpapahintulot sa pag-aaral ng mga pakikipag-ugnayan ng iba't ibang mga tisyu sa magkasanib na bahagi. Ang ika-apat na gawain ay ang paghahanda ng cartilaginous implants para sa kasunod na transplantation. At, sa wakas, ang ikalimang gawain ay pag-aralan ang mga kadahilanan ng paglago, mga cytokine o therapeutic agent na may kakayahang magpasigla sa pag-aayos at / o inhibiting ang resorption nito ng kartilago.

Sa nakalipas na mga dekada, nalikha ang iba't ibang mga modelo ng articular na mga kultura ng selulang kartilago, kabilang ang mga monolayer culture, suspendido kultura, kultura ng chondron, explant, coculture, immortal na kultura ng cell. Ang bawat kultura ay may mga pakinabang at disadvantages at ang bawat isa ay angkop para sa pag-aaral ng isang partikular na aspeto ng metabolismo chondrocyte. Kaya, ang mga cartilaginous explant ay isang mahusay na modelo para sa pag-aaral ng paglilipat ng mga elemento ng matrix, na nangangailangan ng mga tunay na cell ibabaw receptors at normal na cell-matrix at matrix-cell na pakikipag-ugnayan. Kasabay nito, ang pag-aaral ng mga deposito sa matrix o mga mekanismo para sa regulasyon ng chondrocyte metabolismo ay inirerekomenda na isasagawa sa isang kultura ng ilang mga selula. Ang isang monolayer low-density na kultura ay kinakailangan para sa pag-aaral sa proseso ng pagkita ng selula ng cell. Ang mga kultura na sinuspinde sa natural o sintetiko na matrix ay isang modelo para sa pag-aaral ng adaptive na tugon ng chondrocytes sa mekanikal na stress.

[1], [2], [3], [4], [5], [6], [7]

Chondrocyte kultura

Kapag pumipili ng tissue sa kartilago para sa mga pag-aaral sa vitro, maraming mahalagang mga punto ang dapat isaalang-alang. Ang komposisyon ng matris at metabolic aktibidad ng mga chondrocyte ay magkakaiba sa iba't ibang mga joints, at ang huli ay depende rin sa lalim ng chondrocyte sa tissue. Ang mga datos na ito ay nakuha sa ilang mga eksperimento kung saan ang ilang mga subpopulasyon ng mga chondrocyte mula sa mga zone ng kartilago ng iba't ibang mga kalaliman ay pinag-aralan. Ang isang bilang ng mga morpolohiya at biochemical pagkakaiba ay matatagpuan sa pagitan ng nilinang chondrocytes na matatagpuan sa ibabaw at malalim na mga layer ng articular kartilago. Ang mga cell sa ibabaw ay nagsasama ng isang bihirang, maubos na proteoglycan fibrillar matrix, habang ang mas malalalim na mga cell ay gumagawa ng isang matrix na mayaman sa fibrils at proteoglycans. Dagdag pa, ang mga cell sa ibabaw ay gumagawa ng relatibong mas maliit na di-pinagsama-samang proteoglycans at hyaluronic acid at medyo mas mababa aggrecan at keratan sulfate kaysa sa mas malalim na mga chondrocytes. Ang isa pang mahalagang tangi na katangian ng metabolismo ng chondrocytes na nakahiwalay sa mga zone ng kartilago ng iba't ibang kalaliman ay ang tugon sa exogenous stimulus. Ayon sa M. Aydelotte at co-authors, ang bull chondrocytes mula sa surface zone ng kartilago ay mas sensitibo sa IL-1 kaysa sa mga cell ng deep zone.

Ang pag-uugali ng mga selula ay depende rin sa lokasyon ng tisyu. Chondrocytes cartilage at tainga gilid, na kinunan mula sa parehong hayop na tumauli naiiba sa paglago kadahilanan tulad ng fibroblast paglago kadahilanan (FGF), at TGF-beta. FGF nadagdagan thymidine pagsasama, proline at leucine sa kultura ng chondrocytes rib ngunit hindi ang tainga. TGF-P nadagdagan ang pagsasama ng thymidine sa cartilage chondrocytes rib at tainga, ngunit nagkaroon walang epekto sa thymidine pagsasama sa chondrocytes at proline tainga. Ang mga selulang kartilago na nakuha mula sa mga zone na may pinakamataas na load ay naiiba sa mga mula sa mga site na may mababang pagkarga sa kartilago. Halimbawa, mature chondrocytes ng kartilago ng kasukasuan ng tuhod mula sa gitnang rehiyon ng tupa articular tibial buto ibabaw hindi sakop ng ang meniskus, na kung saan ay nagdadala ang pinakamalaking load sa Vivo, mas maliit na-synthesize aggrecan, decorin ngunit mas malaki kaysa sa mga cell sa mga lugar na sakop ng meniskus. Ang mga may-akda ay din emphasize ang kahalagahan ng paggamit ng kartilago mula sa magkatulad na magkasanib na zone kapag sinusuri ang sintetikong function ng mga joints.

Chondrocyte metabolismo at bilang tugon sa regulasyon kadahilanan din ay depende malaki sa edad ng mga donor, ang pag-unlad ng kanyang kalansay at magkasanib na kalusugan, na kung saan tumagal ng mga cell. Sa tao chondrocytes, isang makabuluhang pagbawas sa edad ng proliferative tugon ay sinusunod. Ang pinakamalaking pagbawas ay sinusunod sa mga donor na may edad na 40-50 taon at mahigit sa 60 taon. Bukod dito, ang kalubhaan ng proliferative response sa mga kadahilanan ng paglago (hal., FGF at TGF-beta) ay bumababa sa panahon ng pagtanda. Bilang karagdagan sa mga nabagong pagbabago sa paglaganap ng mga chondrocyte, mayroon ding mga pagbabago sa husay. Batang donor cell (10-20 taon) ay mas tumutugon sa mga kadahilanan sa paglago, platelet-nagmula (PDGF) kaysa TGF-beta, samantalang ang kabaligtaran ay na-obserbahan sa mga cell ng mga adult donors. Upang ipaliwanag ang mga pagbabago na nakadepende sa edad sa gawaing gawa ng sintomas ng chondrocytes at ang kanilang pagtugon sa epekto ng mga kadahilanan ng paglago, maraming mekanismo ang ginagamit. Kabilang sa mga ito, pagbawas sa ang bilang at affinity cell ibabaw receptor, ang pagpapalit ng synthesis at bioactivity ng paglago kadahilanan at cytokines postreceptor pagbabago signal.

Ang pathological kondisyon ng joints din binabago ang morpolohiya at metabolic aktibidad ng chondrocytes. Kaya, kinilala ni J. Kouri at co-authors (1996) ang tatlong subpopulasyon ng chondrocytes sa kartilago na may osteoarthritis. Chondrocytes mula sa mababaw at itaas na gitna ng mga clusters form na kartilago at synthesize ng higit pang mga proteoglycans at collagen. TGF-beta, at insulin-tulad ng paglago kadahilanan (IGF) ay maaaring pasiglahin ang proteoglycan synthesis sa pamamagitan ng chondrocytes at bahagyang neutralisahin ang mga epekto ng IL-1 at TNF-a. Cartilage explants mga naghihirap sa osteoarthritis, at ang chondrocytes ihiwalay mula sa cartilage ng mga pasyente na may osteoarthritis, ay mas sensitibo sa pagbibigay-buhay ng TGF-beta kaysa sa malusog na kartilago chondrocytes. Ang mga pagkakaiba ay malamang na nauugnay sa mga pagbabago sa phenotypic sa chondrocytes sa itaas na layer ng articular cartilage.

Ang paghihiwalay ng mga indibidwal na chondrocytes ay nakamit sa pamamagitan ng sunud na paggamot na may proteolytic enzymes ng ECM. Pagkatapos ng kanilang paglaya mula sa ECM, ang mga nakahiwalay na mga selula ay angkop para sa pag-aaral sa pagbubuo ng de novo matrix components . Ang ilang mga may-akda ay gumagamit lamang ng clostridium collagenase, ang iba pang mga pre-incubate cartilage na may trypsin, pronase, DNase at / o hyaluronidase. Ang bilang ng mga nakahiwalay na mga cell ay depende sa mga enzym na ginagamit. Kaya, kapag nagpoproseso isa sa 1 g collagenase tissue ay maaaring makuha 1,4T0 ⁶ chondrocytes, samantalang kapag gumagamit pronase, hyaluronidase at collagenase - 4,3-10 ⁶. Kapag ang pagproseso sa collagenase, aggrecan, protina, IL-6, IL-8 ay nananatili sa kultura ng cell higit pa sa kaso ng sunud na paggamot na may iba't ibang mga enzymes. Mayroong ilang mga paliwanag para sa mga pagkakaiba sa pagitan ng dalawang kultura ng cell:

• Cellular receptor napinsala o nalulumbay sa pamamagitan ng pagkilos ng enzymes, TGF-beta inhibits DNA synthesis ng proteoglycans sa bagong ihiwalay chondrocytes (araw 1), habang ang DNA at proteoglycan synthesis ng chondrocytes pinag-aralan sa monolayer (7 araw) stimulated sa pamamagitan ng TGF-beta. Gayunpaman, upang muling maipakita ang mga bahagi ng lamad na ito, isang sapat na panahon ang kinakailangan bago magsimula ang eksperimento.
• Ang mga exogenous proteases ay maaaring masira ang pakikipag-ugnayan ng mga cell at ang matrix, na pinangasiwaan ng integrins. Itinataguyod ng pamilya integrin ang attachment ng chondrocytes sa mga molecule ng VKM (Shakibaei M. Et al., 1997). Maaaring makakaapekto ang pagpapahinga sa pagpapahayag ng mga genre ng matris.
• Ang mga residue ng mga sangkap ng matrix ay maaaring makontrol ang gawaing sintetiko ng chondrocytes. Nakikilala ng Integrins ang mga produkto ng degradasyon ng ECM, sa gayo'y naglalaro ng mahalagang papel sa pag-aayos ng tissue pagkatapos maipakita sa proteolytic enzymes. T. Larsson et al (1989) na iniulat na ang karagdagan ng buo o fragmented proteoglycans sa may pinag-aralan na mga cell stimulates ang synthesis ng protina at proteoglycans. Gayunman, ang mataas na antas ng hyaluronic acid nagiging sanhi ng isang makabuluhang pagbaba sa ang pagsasama ng sulfate proteoglycan synthesis sa pamamagitan ng chondrocytes chicken embryo chondrocytes mature parang baboy at daga chondrosarcoma cells. Dagdag pa rito, hyaluronic acid - inhibitor ng proteoglycan release mula sa mga selula kahit sa presensya ng IL-lb, TNF-a, FGF, na nagpapahiwatig na ang unang counteracting ang biological aktibidad ng paglago kadahilanan at cytokines. Ang eksaktong mekanismo na pinagbabatayan ng aksyon ng hyaluronic acid ay hindi pa malinaw; Ito ay kilala na chondrocytes naglalaman ng isang receptor para sa hyaluronic acid, na nauugnay sa filament ng actin ng cytosol. Ang umiiral na hyaluronic acid sa reseptor nito ay nagpapasigla sa phosphorylation ng mga protina. Sa gayon, ang mga datos na ito ay nagpapakita ng modulasyon ng metabolic function ng chondrocytes sa pamamagitan ng pira-piraso o katutubong mga molecule ng mga protina ng matrix sa pamamagitan ng pag-activate ng mga selulang lamad ng receptor.
• Ang mabilis na pagpapasigla ng enzymes ng synthesis ng mga protina ng matrix sa pamamagitan ng chondrocytes ay maaaring maging resulta ng isang pagbabago sa hugis ng chondrocytes at / o ang muling pagbubuo ng cytoskeleton.
• Ang ilang mga cytokine (hal., IL-8) at mga kadahilanan ng paglago (hal., IGF-1, TGF-P) ay nakatakda sa ECM. Ang pinakamahusay na kilalang halimbawa ay ang pagbubuklod ng TGF-beta na may decore, na humahantong sa isang pagbawas sa kakayahan ng dating na hikayatin ang paglago ng cellular sa ovarian cells sa Chinese hamsters. Ang data na ang nilalaman ng pagtaas ng kartilago ay nagdaragdag sa edad, nagpapahiwatig ng pagbawas sa bioavailability ng TGF-beta sa pag-iipon. Ang mga kadahilanan ng paglago at cytokines ay maaaring palabasin mula sa mga residu ng matris sa panahon ng kultura at pagkatapos ay pahinain ang chondrocyte function.

[8], [9], [10], [11],

Monolayer culture of chondrocytes

Differentiated phenotype ng chondrocytes lalo na nailalarawan sa pamamagitan ng ang synthesis ng uri II collagen at proteoglycans, tissue-tiyak at mababa mitotic aktibidad. Mayroong katibayan na pang-matagalang paglilinang ng mga cell sa isang monolayer, at pagkatapos ng ilang paulit-ulit na mga sipi ng mga cell, chondrocytes mawala ang kanilang mga spherical hugis, maging pahabang, fibroblast-tulad ng hugis. Na may tulad na fibroblast metaplasiya synthetic function ay din mabago cell, nailalarawan sa pamamagitan ng isang progresibong pagbaba sa synthesis ng collagens II, IX at mga uri XI at pinahusay na synthesis ng collagen ko, III at Utipov. Ang mga maliit na di-pinagsama-samang mga proteoglycans ay na-synthesize ng functional aggrecan. Ang Synthetzatepsin B at L ay lubhang mababa sa pagkakaiba-iba ng mga cell, ngunit sa proseso ng pagkawala ng pagkita ng kaibahan. Ang Collagenase-1 ay ipinahayag sa magkakaibang chondrocytes, na may matagal na paglilinang, ang expression nito ay bumababa, habang ang produksyon ng mga tissue inhibitors ng metalloproteases (TIMP) ay nagdaragdag.

Ang differentiated chondrocytes ay muling ipahayag ang collagen ng differentiated phenotype kapag sila ay inilipat mula sa isang monolayer culture sa isang nasuspinde. Ang proseso ng pagkita ng kaibahan ay maaaring may kaugnayan sa hugis ng mga selula. Ang ari-arian na ito ay regular na ginagamit ng mga mananaliksik na nag-aaral ng mga depektibong transplant na may autologous chondrocytes. Ang isang maliit na bilang ng mga selula na nakuha mula sa biopsy na materyal ay maaaring i-multiply sa isang kultura ng monolayer at pagkatapos ay ilagay muli sa isang tatlong-dimensional na matrix bago itanim. Muling pagpapahayag ng isang partikular na phenotype dedifferentiated chondrocytes migrate sa agarose kultura, maaaring stimulated sa pamamagitan TGF-p-ossein hydroxyapatite masalimuot at ascorbic acid.

Bilang tugon sa epekto ng mga salik na paglago at cytokines, ang chondrocytes ay binago sa panahon ng proseso ng pagkita ng kaibhan. Ang cellular na tugon sa mga cytokine at mga kadahilanan ng paglaki ay naiiba sa pagitan ng hindi natukoy na mga pagkakaiba at mga chondrocyte. Ang stimulus ng IL-1 ay ang paglaganap ng fibroblasts, habang ang paglago ng undifferentiated chondrocytes ay inhibited ng IL-1. Ang synthesis ng DNA ay stimulated sa pamamagitan ng IGF-1 sa haba, ngunit hindi pipi chondrocytes. Sa differentiated chondrocytes, ang stimulating effect ng IL-1β at TNF-α sa mga produkto ng procollagenase ay mas binibigkas kaysa sa mga hindi nalalaman.

Paglilinang ng chondrocytes

Ang paglilinang ng chondrocytes sa suspensyon sa isang likidong daluyan o sa isang likas o sintetiko na may tatlong dimensyon na matrix ay nagpapatatag sa phenotype ng chondrocyte. Ang mga cell ay nagpapanatili ng kanilang pabilog na hugis, nagsasangkot ng mga protina na partikular sa tisyu. Ang isang weighted chondrocyte culture ay kadalasang inirerekomenda para sa pag-aaral ng pagbuo ng isang bagong pericellular matrix. Chondrocyte kultura sa gawa ng tao o likas na sumisipsip polymers ay ginagamit upang ipunla ang mga cell sa mga defective sa kartilago upang pasiglahin ang pagbabagong-buhay ng kartilago tissue ng magkasanib na. Ang sintetiko o likas na kapaligiran para sa mga implantable cells ay dapat bigyang-kasiyahan ang ilang mga kinakailangan:

• Ang mga implant ay dapat magkaroon ng porous na istraktura para sa adhesion at cell growth,
• alinman sa polimer mismo o ang mga produkto ng kanyang marawal na kalagayan ay dapat maging sanhi ng pamamaga o nakakalason reaksyon sa panahon sa vivo pagtatanim ,
• ang carrier ng transplant ay dapat na makagapos sa isang katabing kartilago o subkondalong buto,
• isang natural o sintetiko matrix ay dapat na may kakayahang pagsipsip, ang marawal na kalagayan ay dapat na balanse sa pamamagitan ng tissue regeneration,
• Upang mapadali ang pagkumpuni ng kartilago, ang kemikal na istraktura at matris na arkitektura ng matris ay dapat tumulong na mapanatili ang cell phenotype na naka-encode ng chondrocytes at synthesize ng mga protina na partikular sa tissue,
• sa panahon ng pagtatanim sa vivo, kinakailangan upang pag-aralan ang mga mekanikal na katangian ng sintetiko o likas na matris.

[12], [13], [14], [15], [16]

Suspensyon ng mga chondrocytes sa likidong yugto

Cell attachment sa plastic sasakyang-dagat, kung saan ang culturing ng chondrocytes ay maaaring pumigil sa kanilang mga pader ay pinahiran na may isang solusyon metil selulusa, agarose, hydrogel (poly-2-hydroxyethylmethacrylate) o isang halo ng collagen-agarose. Sa ilalim ng mga kondisyon, form kumpol at chondrocytes synthesize kalimitan tissue-tiyak aggrecan at collagen (II, IX, mga uri XI). Karaniwan, ang dalawang uri ng mga selula ay matatagpuan. Ang mga selula na matatagpuan sa gitna ay nagpapanatili ng isang pabilog na hugis na napapalibutan ng isang mahusay na binuo ECM, na kung saan ay nakumpirma ng histochemical at ultrastructural na pag-aaral. Sa paligid chondrocytes may mga discoid contours, ay napapalibutan ng isang bihirang ECM; Ang Little ay kilala tungkol sa pagganap na mga katangian ng naturang mga cell.

Ang paglilinang ng chondrocytes sa mga microcarrier na sinusuportahan sa suspensyon ay posible; pati microcarriers gamit dextran kuwintas (tsitodeks), collagen pinahiran dextran kuwintas (tsitodeks III), besporovye microspheres ay collagen uri ko (tsellagen). Sa ilalim ng mga kondisyon ng kultura, ang mga chondrocyte ay nakalakip sa ibabaw ng microcarrier, panatilihin ang kanilang spherical na hugis, at gumawa ng materyal na tulad ng matrix. Bukod dito, ang paggamit ng collagen ay nagtataguyod ng paglaganap ng chondrocytes at ang reexpression ng isang normal na phenotype. Samakatuwid, ang paglilinang ng chondrocytes sa microspheres ng collagen ay maaaring magamit upang ibalik ang cell phenotype bago itanim.

Ang isa pang paraan ng paglilinang ng isang suspensyon ng mga chondrocytes sa isang likidong daluyan ay ang kanilang paglilinang sa anyo ng siksik na kuwintas na binubuo ng mga selula (0.5-1 * 10 ^b ) na nakuha sa pamamagitan ng centrifugation. Ang ganitong mga chondrocytes ay kaya ng paggawa matrix na naglalaman ng malalaking halaga ng proteoglycans, II-type ang collagen, ngunit hindi nagta-type ako collagen, na kung saan ay nakumpirma na sa pamamagitan histological, immunohistochemical at nabibilang na mga pamamaraan.

Suspensyon ng chondrocytes sa natural na ECM

Chondrocytes ay maaaring may pinag-aralan sa suspensyon sa isang three-dimensional matrix (soft agar, agarose, tumawag gene gel o espongha, hyaluronic acid, fibrin kola, alginate kuwintas).

Ang mga cultured agarose chondrocyte ay nagpapanatili ng kanilang normal na phenotype at nag-synthesize ng collagen type II at mga pinagsama-samang mga aggregate na partikular sa tissue. Kapag pinag-aralan sa agarose, ang mga cell-synthesized proteoglycans ay inilabas sa daluyan para sa 50 araw. Para sa paghahambing - sa monolayer kultura ang cell phase ay overfilled sa glycosaminoglycans na sa unang 5-6 na araw ng paglilinang; kapag nilinang sa daluyan matapos ang paglakas at pagpapalabas ng glycosaminoglycans ay lumakas, ang pagbaba ng oras na umaasa sa glycosaminoglycans ay nangyayari sa unang 8-10 araw. Gayunpaman, ang pag-uugali ng chondrocytes sa panahon ng kanilang paglilinang sa agarose ay naiiba mula sa na sa mga kondisyon ng vivo. Sa agarose, ang isang malaking bilang ng mga synthesized Aggregan aggregates naglalaman ng mas maliit at mas maliit na mga molecule kaysa sa vivo. Ang TGF-P ay nagpapasigla sa pagbubuo ng mga proteoglycans sa nagpapaliwanag, ngunit binabawasan ang pagbubuo ng aggrecan sa agarose.

Alginate ay isang linear polysaccharide na nagmula sa kayumanggi damong-dagat. Sa pagkakaroon ng mga divalent cation, tulad ng Ca ^{2 + ions}, ang polimer na ito ay nagiging isang gel. Ang bawat Chondrocyte nahuli sa alginate, na pinalilibutan ng isang matrix ng mga negatibong sisingilin polysaccharides, ang pores nito ay maihahambing sa mga ng hyaline cartilage. Ang matrix na kung saan ay binuo chondrocytes sa alginate kuwintas, na binubuo ng dalawang mga segment ng - isang manipis na layer ng cell-nauugnay matrix naaayon sa pericellular at teritoryal na matrices ng articular kartilago at mas remote matrix interterritorial katumbas sa katutubong tissue. Sa ika-30 araw ng kultura, kamag-anak at ganap na dami inookupahan ng mga cell, at bawat isa sa mga dalawang mga kagawaran sa alginate bead ay halos ganap na kapareho ng mga katutubong cartilage. Sa loob ng halos 30 araw chondrocytes mapanatili ang kanilang spherical hugis at makabuo aggrecan, hydrodynamic mga ari-arian na kung saan ay katulad ng sa mga ng aggrecan molecule sa matrix ng articular kartilago at collagen Molekyul II, IX at XI uri. Kasabay nito, tulad ng iba pang mga kultura, pagsususpinde, alginate kuwintas sa ibabaw ng flat cells ay naroroon na bumuo ng isang maliit na halaga ng uri collagen ko molecule, inilabas direkta sa kapaligiran at hindi nakasama sa VCR. Sa alginate beads, ang katamtaman na paglaganap ng chondrocytes ay sinusunod. Pagkatapos ng 8 buwan ng paglilinang sa alginate gel mature chondrocytes huwag mawalan ng metabolic aktibidad at patuloy na synthesize tissue-tiyak na collagen uri II at aggrecan.

Sinimulan ni N. Tanaka at coauthors (1984) ang mga katangian ng pagsasabog ng iba't ibang natural na mga molecule sa alginate at natagpuan na ang mga molecule na mas malaki sa 70 kD ay hindi nagkakalat sa pamamagitan ng alginate. Kaya, ang paglilinang ng mga selula sa alginate ay angkop para sa pag-aaral ng regulasyon ng biosynthesis ng matris at ng organisasyon ng ECM. Ang pagkakaroon ng mga cell na nilinang sa alginate ay nagpapahintulot sa isa na imbestigahan ang epekto ng mga kadahilanan ng regulasyon ng peptide at mga pharmacological na ahente sa transcriptional, posttranscriptional at translational levels.

Ang mga chondrocytes ay pinag-aralan rin sa isang matrix ng mga uri ng collagen fibers na I at II. S. Nehrer et al (1997) kung ikukumpara sa pagpapatakbo sa aso Chondrocyte proteoglycan bukod Collagen-polimer matrix na naglalaman collagens ng mga iba't ibang mga uri. Natagpuan nila ang mahalagang mga pagkakaiba sa morpolohiya ng biosynthetic function ng chondrocytes na pinag-aralan sa collagen matrices na naglalaman ng mga uri ng collagen I at II. Ang mga selula sa matris ng collagen type II ay nagliliko ng kanilang spherical na hugis, habang sa uri ko collagen, mayroon silang fibroblast-like morfology. Dagdag pa rito, sa matrix ng uri II collagen, chondrocytes ay gumawa ng higit na glycosaminoglycans. Ang J. Van Susante et al (1995) kumpara sa mga katangian ng chondrocytes na pinag-aralan sa alginate at ang collagen (type I) gel. Ang mga may-akda natagpuan ang isang makabuluhang pagtaas sa ang bilang ng mga cell sa collagen gel, ngunit ang ika-6 na araw ng paglilinang, ang mga cell nawala ang kanilang katangi-phenotype, naging fibroblast-tulad ng mga cell. Sa alginate gel, isang pagbawas sa bilang ng mga selula ay sinusunod, ngunit pinanatili ng chondrocytes ang kanilang normal na phenotype. Ang halaga ng collagen proteoglycans gel bawat cell ay makabuluhang mas mataas kaysa sa alginate, ngunit ang pagbaba ay sinusunod sa mga elemento gel matrix synthesis simula sa ika-6 na araw ng paglilinang, samantalang sa alginate synthesis ay patuloy na lumalaki.

Ang solid three-dimensional fibrin matrix ay isang likas na sangkap na sumusuporta sa mga chondrocytes na tinimbang dito sa isang differentiated phenotype. Ang 3D fibrin matrix ay maaari ring magamit bilang isang carrier para sa transplantation ng chondrocyte. Ang mga kalamangan ng fibrin ay ang kawalan ng cytotoxicity, ang kakayahang punan ang espasyo, ang kakayahang malagkit. Sa pamamagitan ng histological at biochemical mga pag-aaral Autoren-diografii, elektron mikroskopya nagsiwalat na ang chondrocytes sa fibrin gels mapanatili ang kanilang morpolohiya, magparami at makabuo ng matrix kahit na pagkatapos ng 2 linggo ng paglilinang. Gayunman, G. Homminga et al (1993) na iniulat na pagkatapos ng 3 araw ng kultura, ay nagsisimula ang paghiwalay ng fibrin umuusad dedifferentiation ng chondrocytes.

Suspensyon ng chondrocytes sa isang artipisyal (gawa ng tao) ECM

Ang mga implanteng kartilago para sa mga reconstructive o ortopedik na operasyon ay maaaring makuha sa pamamagitan ng lumalagong mga chondrocyte sa vitro sa isang sintetiko na matrix na biocompatible.

Ang mga cultured polyglycolic acid chondrocytes ay lumaganap at nagpapanatili ng normal na morpolohiya at phenotype sa loob ng 8 na linggo. Complex chondrocytes-polyglycolic acid ay binubuo ng mga cell, glycosaminoglycans kollagnov ay may isang panlabas na collagen capsule. Gayunpaman, sa mga implant na ito ay may dalawang uri ng molecular collagen - ako at II. Implants ng dedifferentiated chondrocytes serye ng mga sipi ay may mas mataas na halaga ng glycosaminoglycans at collagen kaysa sa implants ng undifferentiated pangunahing chondrocytes.

L. Freed et al (1 993b) kung ikukumpara sa pag-uugali ng Chondrocyte kultura ng tao at ng baka sa isang mahibla polyglycolic acid (EQAP) at sa alitan polilaktilovoy acid (PPLC). Matapos ang 6-8 na linggo ng paglilinang ng mga chondrocyte ng toro sa HSVG o PPLC, napagmasdan ng mga may-akda ang paglaganap ng cell at pagbalik ng kartilago na matrix. Sa HSBC, ang mga chondrocyte ay spherical, na matatagpuan sa lacunae na napapalibutan ng isang cartilaginous matrix. Pagkatapos ng 8 linggo ng culturing sa vitro regenerated tissue maglaman ng hanggang sa 50% solids (4% ng mga cell mass, 15% at 31% ng glycosaminoglycans collagens). Sa PPLK cells ay ang hugis ng suliran, isang maliit na halaga ng glycosaminoglycans at collagen. Sa HSBC, ang cell growth ay 2 beses na mas matindi kaysa sa PTCA. Sa mga kalagayan sa vivo, ang mga chondrocyte na lumaki sa HPVC at PPLC sa loob ng 1 hanggang 6 na buwan ay gumawa ng isang tissue na histologically katulad ng kartilago. Ang mga implant ay naglalaman ng glycosaminoglycans, i-type ko at i-type ang II collagens.

Ang pangsanggol na toro chondrocytes ay pinag-aralan sa porous high-density na hydrophobic at hydrophilic polyethylene. Pagkatapos ng 7 araw ng pagpapapisa ng itlog sa parehong substrates, ang mga selula ay pinanatili ang isang pabilog na hugis, pangunahin na naglalaman ng uri II collagen. Pagkalipas ng 21 araw ng paglilinang, naka-out na ang hydrophilic matrix ay naglalaman ng higit pang uri II collagen kaysa sa hydrophobic matrix.

Ang tissue ng kartilago ay maaari ring makuha sa pamamagitan ng pag-kultura sa isang monolayer sa mga filter ng Millicell-CM. Ang pre-coating ng mga filter na may collagen ay kinakailangan para sa attachment ng chondroits. Ang histological examination ng kultura ay nagpapakita ng akumulasyon ng chondrocytes sa ECM na naglalaman ng proteoglycans at type II collagen. Ang uri ng Collagen ko sa ganitong kultura ay hindi napansin. Ang mga chondrocyte sa nagresultang kartilago na tisyu ay may isang pabilog na hugis, ngunit sa ibabaw ng tisyu ay medyo pipi ang mga ito. Ang kapal ng bagong nabuo tissue ay nadagdagan sa oras at depended sa ang unang density ng monolayer ng mga cell. Sa ilalim ng pinakamainam na kondisyon ng kultura, ang kapal ng cartilaginous tissue ay umabot sa 110 μm, ang samahan ng mga selula nito at collagen sa ibabaw at malalim na mga layer ay katulad ng articular cartilage. Ang VKM ay naglalaman ng humigit-kumulang na 3 beses na higit pang collagen at proteoglycans. Pagkatapos ng 2 linggo ng paglilinang, ang akumulasyon ng matrix-sa ay nabanggit, na naging posible na kunin ang tissue mula sa filter at gamitin ito para sa paglipat.

Pinag-aralan ng Sims et al. (1996) ang paglilinang ng chondrocytes sa polyethylene oxide-gel encapsulated polimer matrix na nagbibigay-daan sa isang malaking bilang ng mga cell na transported sa pamamagitan ng iniksyon. Anim na linggo pagkatapos mag-iniksyon sa subcutaneous tissue ng athymic mice, isang bagong kartilago ang nabuo, na kung saan ang morphologically ay nailalarawan sa pamamagitan ng white opalescence na katulad ng hyaline cartilage. Ang data ng histological at biochemical studies ay nagpapahiwatig ng pagkakaroon ng aktibong proliferating chondrocytes, na gumawa ng ECM.

Pagtuklas

Ang eksaminasyon ng cartilaginous tissue ay ginagamit upang pag-aralan ang mga proseso ng ana- at catabolism dito, homeostasis, resorption at pagkumpuni. Ang mga chondrocytes sa cartilaginous tissue explants ay sumusuporta sa normal na phenotype at komposisyon ng ECM, katulad ng sa mga articular cartilage sa vivo. Pagkatapos ng 5 araw ng paglilinang sa pagkakaroon ng suwero, ang isang pare-parehong antas ng pagbubuo at likas na pagkasira ay nakamit. Resorption maaaring mapabilis tissue kultura at sa pangunahing kultura sa pamamagitan ng pagdaragdag ng suwero ng paggamit ng isang bilang ng mga ahente, hal, IL-IB, TNF-a, bakterialnyhlipopolisaharidov, derivatives ng retinoic acid o aktibo oxygen radicals. Upang mag-aral nito pagkumpuni kartilago pinsala sapilitan sa pamamagitan ng natutunaw nagpapasiklab mediators (H ₂ O ₂, IL-1, TNF-a) o pisikal pagkakasira ng matris.

Ang pamamaraan ng organotypic kultura ay isang modelo para sa pag-aaral ng in vitro effect ng nakahiwalay panlabas na mga kadahilanan sa chondrocytes at ang nakapalibot na matris. Sa vivo, ang chondrocytes ay bihira na matatagpuan sa ECM at huwag makipag-ugnay sa bawat isa. Ang kultura ng explant articular cartilage ay pinanatili ang estruktural organisasyon, pati na ang mga partikular na pakikipag-ugnayan sa pagitan ng mga chondrocyte at ang kanilang nakapalibot na ekstraselyular na kapaligiran. Ginagamit din ang model na ito upang pag-aralan ang epekto ng makina ng stress, mga pharmacological agent, mga kadahilanan ng paglago, cytokine, mga hormone sa metabolismo ng kartilago.

Ang isa pang bentahe ng cartilaginous tissue explantation ay ang kawalan ng chondrocyte pinsala sa pamamagitan ng proteolytic enzymes o isang mekanikal na kadahilanan, na kung saan ay hindi maiiwasan kapag ang mga cell ay ihiwalay. Ang mga reseptor at iba pang mga protina ng lamad at glycoprotein ay protektado mula sa mga nakakapinsalang bagay.

[17], [18], [19], [20], [21]

Kultura ng mga chondrons

Hondron - istruktura, functional at metabolic articular kartilago unit na binubuo ng Chondrocyte pericellular matrix at ang kanyang compact filament capsule at responsable para sa ang homeostasis ng matrix. Ang mga chondrons ay wala sa loob na nakuha mula sa kartilago at nakolekta ng maraming sunud-sunod na mga homogenization na mababa ang bilis. Ihiwalay mula sa zone ng iba't ibang mga kailaliman hondrony cartilage ay maaaring nahahati sa apat na mga kategorya: solong hondron, twin hondrony, maramihang (tatlo o higit pa) linearly isagawa hondrony (hanay hondronov) hondronov kasikipan.

Single hondrony karaniwang matatagpuan sa gitna layer ng buo cartilage, twin - sa hangganan ng gitna at malalim na layer linearly isagawa ang maramihang hondrony tipikal ng malalim na layer ng buo cartilage. Panghuli, ang mga kumpol ng mga chondrons ay binubuo ng mga organisadong random na grupo ng mga single at ipinares chondrons na panatilihin ang pinagsama-samang estado pagkatapos homogenization. Ang pagkakaroon ng chondrons ay malaking piraso ng kartilago, kadalasang naglalaman ng ilang mga chondrons at radially na matatagpuan collagen fibrils, ibig sabihin, isang tipikal na katangian ng samahan ng malalim na mga layer ng matris. Ang mga chondron ay nakabase sa isang transparent na agarose, na nagpapahintulot sa pag-aaral ng kanilang istraktura, molecular composition at metabolic activity. Hondron system - agarose itinuturing bilang micro modelo ng kartilago, na kung saan ay naiiba mula sa mga tradisyunal na sistema ng Chondrocyte - agarose na pinapanatili ang natural na microenvironment, hindi na kailangan upang isagawa ang kanyang synthesis at ng kapulungan. Ang kultura ng chondrons ay isang modelo para sa pag-aaral ng mga pakikipag-ugnayan ng mga cell at matrix sa articular cartilage sa normal at pathological kondisyon.

[22], [23], [24], [25], [26], [27]

Kultura ng walang kamatayang chondrocytes

Upang lumikha ng mga permanenteng linya ng cell, ang recombinant DNA o oncogen na naglalaman ng mga virus ay ginagamit na maaaring gawing "immortal" ang cell. Ang immortal chondrocytes ay may kakayahang walang katapusang paglaganap, pagpapanatili ng matatag na phenotype. F. Mallein-Gerin et al (1995) ay nagpakita na ang mga oncogene ay SV40T-sapilitan paglaganap ng chondrocytes mouse na sa gayon ay patuloy na stably ipahayag ang collagens II, IX at XI uri, pati na rin ang joint at aggrecan nagbubuklod na protina. Gayunpaman, ito cell linya ay kumukuha ng kakayahan upang synthesize collagen uri ko sa pamamagitan ng culturing ito sa monolayer kultura o sa isang agarose gel.

Inilarawan ni W. Horton at co-authors (1988) ang isang linya ng immortal cells na may mababang antas ng expression ng collagen type II mRNA. Ang mga selula na ito ay nakuha sa pamamagitan ng pagbabago sa mga ito ng isang retrovirus ng mouse na naglalaman ng I-myc- at y-ra-oncogenes. Ang ganitong uri ng mga cell ay isang natatanging modelo para sa pag-aaral ng mga pakikipag-ugnayan ng articular matrix sa kawalan ng uri ng II collagen, pati na rin ang regulasyon ng synthesis ng type II collagen.

Hondropitov kultura na may mutated o tinanggal gene - isang maginhawa modelo para sa pag-aaral ng kanilang mga physiological function. Modelo na ito ay partikular na angkop para sa pag-aaral ang papel na ginagampanan ng mga tiyak na mga molecule sa kartilago matrix organisasyon o nag-aaral ang mga epekto ng iba't-ibang mga regulasyon kadahilanan sa cartilage metabolismo. Chondrocytes remote gene synthesize collagen uri IX collagen fibrils mas malawak na kaysa sa normal, na nagpapahiwatig na collagen uri IX regulates ang lapad ng fibrils. Tulad ng nabanggit ko sa Chapter 1, ang mga bagong natagpuan gene pagbago COLAI encoding uri II collagen sa mga pamilyang may mga pangunahing generalised osteoarthritis. Upang mag-aral ang epekto ng mutant collagen uri II sa articular matrix R. Dharmrvaram et al (1997) ginanap transfection ( "contamination" isang banyagang nucleic acid) depektibong COL ₂ AI (arginine sa posisyon na 519 ay napalitan ng cysteine) sa pantao pangsanggol chondrocytes sa vitro.

Sistema ng mga cocoy. Sa kasukasuan, ang kartilago ay nakikipag-ugnayan sa mga cell ng iba pang mga uri na nakapaloob sa synovial membrane, synovial fluid, ligaments, subchondral bone. Ang metabolismo ng chondrocytes ay maaaring maimpluwensyahan ng iba't ibang mga salik na natutunaw ng mga selulang ito. Kaya, ang arthritis articular cartilage ay nawasak ng proteolytic enzymes at free radicals, na ginawa ng synovial cells. Samakatuwid, ang mga modelo ay binuo upang pag-aralan ang mga kumplikadong mga pakikipag-ugnayan sa pagitan ng kartilago at mga nakapaligid na tisyu, na tinatawag na tabako.

S. Lacombe-Gleise et al (1995) pinag-aralan kuneho chondrocytes at osteoblasts sa coculture system (costar), kung saan ang mga cell ay pinaghiwalay microporous membrane (0.4 micron) ay nagpapahintulot sa mga palitan sa pagitan ng dalawang uri ng cell nang walang anumang direktang contact. Ipinakita ng pag-aaral na ito ang kakayahan ng mga osteoblast upang pasiglahin ang paglago ng mga chondrocytes sa pamamagitan ng mga nabubulok na mediators.

A.M. Ang Malfait at co-authors (1994) ay nagsisiyasat ng kaugnayan sa pagitan ng monocytes ng paligid dugo at chondrocytes. Modelo na ito ay kapaki-pakinabang para sa pag-aaral ng proseso mediated sa pamamagitan ng cytokines sa namumula arthropathies (rheumatoid sakit sa buto, seronegative spondylitis et al.). Ang mga may-akda ng modelo ay naghiwalay ng mga selula ng isang lamad na may protina na may mga pores na 0.4 μm ang lapad. Ang pag-aaral natagpuan na lipopolysaccharide-stimulated monocytes nagtrabaho out iFNO IL-1-a, na inhibits ang synthesis ng chondrocytes aggrecan at nag-ambag sa ang marawal na kalagayan nai-synthesize aggrecan Pinagsasama-sama.

K. Tada et al (1994) na nilikha ng isang coculture modelo kung saan endothelial cell sa collagen (I-type) gel ay ilagay sa silid sa loob mula sa mga panlabas silid nakahiwalay mula sa ito sa pamamagitan ng chondrocytes inilagay sa isang filter na may isang napakaliit na butas laki ng 0.4 microns. Sa isang estado ng kumpletong paghihiwalay mula sa panlabas na silid, ang mga tao na endothelial cells ay bumubuo ng tubes sa isang collagen gel sa pagkakaroon ng EGF o TGF-a. Gamit ang sabay-sabay na paglilinang ng parehong uri ng mga selula ng TGF, ang nakasalalay na bituin ng mga tubo sa pamamagitan ng mga selula ng endothelial ay inhibited. Ang chondrocyte na pagsugpo ng prosesong ito ay bahagyang naalis sa pamamagitan ng anti-TGF-beta antibodies. Maaaring ipagpalagay na ang TGF-beta na ginawa ng chondrocytes ay pinipigilan ang vascularization ng kartilago mismo.

C. Groot et al (1994) sabay-sabay na may pinag-aralan chondrocytes ng hypertrophic at proliferative zones buto 16-araw na pangsanggol mouse hiwa utak tissue. Pagkatapos ng 4 na araw ng kultura, ang transdifferentiation ng chondrocytes sa osteoblasts at ang simula ng osteoid formation ay sinusunod. Pagkatapos ng 11 araw ng paglilinang, ang isang bahagi ng kartilago ay pinalitan ng tisyu ng buto at ang butiki na matrix ay bahagyang kalmado. Ang ilang neuropeptides at neurotransmitters na ginawa ng tisyu ng utak, ay nakakaapekto sa metabolismo ng mga osteoblast o may mga receptor sa kanila. Kabilang sa mga ito, norepinephrine, vasoactive intestinal peptide, peptide na nauugnay sa calcitonin gene, sangkap P at somatostatin ay maaaring ihiwalay . Nakapagpapagaling sa chondrocytes, ang mga piraso ng tisyu ng utak ay maaaring gumawa ng ilan sa mga salik na ito, na maaaring magbuod ng proseso ng chondrocyte transdifferentiation sa osteoblasts.

[28], [29], [30], [31], [32], [33]

Ang impluwensiya ng panlabas na mga kadahilanan sa kultura ng chondrocytes

Ang epekto ng pag-igting ng oxygen sa metabolismo ng chondrocytes

Sa karamihan ng mga kaso, ang kultura ng chondrocyte ay bumubuo sa ilalim ng mga kondisyon ng pag-igting ng oxygen sa atmospera. Gayunpaman, mahusay na kilala na sa vivo chondrocytes umiiral sa ilalim ng hypoxic kondisyon at ang pag-igting oxygen ay nag-iiba sa iba't ibang mga pathological kondisyon. Sa panahon ng proseso ng pagkahinog, ang mga makabuluhang pagbabago sa suplay ng dugo ng epiphyses ay sinusunod. Dahil ang vascularization ay nag-iiba sa iba't ibang mga lugar ng paglago plato, ang oxygen pag-igting sa mga ito ay nag-iiba din. C. Brighton at R. Heppenstall (1971) ay nagpakita na sa plato ng tibia sa rabbits, ang oxygen na pag-igting sa hypertrophic zone ay mas mababa kaysa sa nakapalibot na kartilago. Ang mga sukat ng ilang metabolic parameter ay nagpakita na ang chondrocytes ay mabilis na umagos sa mga lokal na pagbabago sa konsentrasyon ng oxygen. Una sa lahat, na may mababang pag-igting ng oxygen, ang pagkonsumo nito ng mga chondrocyte ay bumababa. Sa pamamagitan ng pagbaba sa tensyon ng oxygen mula 21 hanggang 0.04%, ang paggamit ng glucose ay nadagdagan, ang aktibidad ng glycolysis enzyme at synthesis ng lactic acid ay nadagdagan. Kahit na may mababang pag-igting ng oxygen, ang ganap na dami ng ATP, ADP, at AMP ay nananatiling matatag. Ang mga datos na ito ay nagpapahiwatig ng directionality ng chondrocyte metabolism upang i-maximize ang konserbasyon ng enerhiya. Gayunpaman, ang gawaing gawa ng tao, at samakatuwid ay ang proseso ng pagbawi, pagbabago sa ilalim ng mga kondisyon ng hypoxia.

Ang mataas na pag-igting ng oxygen ay nakakaapekto rin sa metabolismo ng chondrocytes, na nagiging sanhi ng pagbawas sa synthesis ng proteoglycans at DNA, pagkasira ng matrix ng kartilago. Ang mga epekto, bilang isang panuntunan, ay sinamahan ng produksyon ng mga libreng radicals ng oxygen.

Impluwensiya ng ion concentration at osmotic presyon ng kapaligiran sa function ng chondrocytes

Sa katutubong cartilage ion concentration ay makabuluhang naiiba mula sa na ng iba pang mga tisiyu: ang sosa nilalaman sa ekstraselyular daluyan ay 250-350 mmoles, at ang mga osmolarity - 350-450 mOsm. Kapag isolating chondrocytes mula sa isang VCR at incubating ang mga ito sa isang standard na media (DMEM (Minimal Essential Katamtaman ni Dulbecco - Minimum Essential medium ni Dulbecco) osmolarity - 250-280,7 mOsm) nagbabago nang husto nakapaligid na kapaligiran ng mga cell. Bilang karagdagan, ang konsentrasyon ng kaltsyum at potasa sa karaniwang media ay mas mababa kaysa sa katutubong tissue, at ang konsentrasyon ng mga anion ay mas mataas.

Pagdaragdag ng sucrose daluyan ay humahantong sa dagdagan ang osmolarity at induces isang panandaliang pagtaas sa ang konsentrasyon ng intracellular H ⁺ at anions ng kaltsyum sa cytosol. Ang ganitong mga intracellular pagbabago ay maaaring maka-impluwensya sa proseso ng chondrocyte pagkita ng kaibhan at ang kanilang metabolic activity. J. Urban et al (1993) natagpuan na ang pagsasama ng ³⁵ 8-sulpate at ³ H-proline nakahiwalay chondrocytes incubated sa DMEM karaniwang daluyan para sa 2-4 na oras, ay lamang ng 10% ng na sa mga katutubong tissue. Synthesis intensity masakitin kapag ang osmolarity ng ekstraselyular daluyan ng 350-400 mOsm sa mga bagong na ihiwalay chondrocytes at kartilago explants in. Bukod dito, ang dami ng chondrocyte ay nadagdagan ng 30-40% pagkatapos ng paglalagay ng ilang mga selula sa isang karaniwang daluyan ng DMEM ng sinabi osmolarity. Gayunman, kapag may pinag-aralan chondrocytes sa ilalim ng di-physiological osmolarity para sa 12-16 oras, ang mga cell na inangkop sa bagong kapaligiran sa pamamagitan ng pagbabawas ang intensity ng gupitan ay proporsyonal biosynthesis osmolarity ng ekstraselyular daluyan.

P. Borgetti et al (1995) investigated ang epekto ng osmolarity ng ekstraselyular daluyan sa paglago, morpolohiya, at ang biosynthesis ng parang baboy chondrocytes. Ang mga may-akda nagpakita katulad na biochemical at morphological katangian ng chondrocytes pinag-aralan sa media na may isang osmolarity mOsm 0.28 at 0.38. Kapag 0.48 mOsm osmolarity ng daluyan sa panahon ng unang 4-6 na oras ng kultura na-obserbahan pagbawas sa cell paglaganap at protina synthesis, ngunit pagkatapos ay naganap ibalik ang mga parameter na ito na kalaunan naabot ang halaga ng control. Kapag culturing chondrocytes sa isang daluyan na may 0.58 mOsm osmolarity cell mawalan ng kanilang kakayahan upang suportahan ang physiological intensity proliferative mga proseso at pagkatapos ng 6 na araw ang bilang ng mga chondrocytes ay makabuluhang nabawasan. Sa osmolarity ng medium, 0.58 mosmol, isang malalim na pagsugpo ng protina synthesis ay sinusunod. Bilang karagdagan, kapag pinag-aralan sa media na may isang osmolarity mOsm 0,28-0,38 chondrocytes mapanatili ang physiological phenotype sa isang mas mataas osmolarity (mOsm 0,48-0,58) makabuluhang pagbabago sa cell morpolohiya, tulad ng ipinahayag ng timbang katangi-phenotype chondrocytes conversion sa mga selula ng fibroblast, pati na rin ang pagkawala ng cell, ang kakayahang mag-ipon ng mga proteoglycano ng matris. Ang mga resulta ng pag-aaral na ito ay nagpapahiwatig Chondrocyte kakayahang tumugon sa mga pagbabago sa mga limitadong osmolality ng ekstraselyular na kapaligiran.

Ang pagbabago sa konsentrasyon ng iba pang mga ions ay maaari ring makaapekto sa proseso ng biosynthesis sa chondrocytes. Kaya, ang mga antas ng pagsasama ng ³⁵ S (sulpit) ay nadagdagan ng kalahati ng pagtaas potassium ion concentration sa 5 mM (ang concentration sa standard na kapaligiran ng DM EM) sa 10 mM (ang concentration sa ECM sa Vivo). Ang kaltsyum na konsentrasyon sa ibaba 0.5 mmol ay nag-ambag sa produksyon ng collagen sa pamamagitan ng mature bull chondrocytes, habang ang isang konsentrasyon ng 1-2 mmol (na tumutugma sa konsentrasyon sa pamantayang DM DM) ay naging sanhi ng isang makabuluhang pagbawas sa collagen synthesis. Ang isang katamtamang pagtaas sa biosynthesis ay naobserbahan sa mataas na antas ng kaltsyum (2-10 mmol). Ang iba't ibang mga cation ay nakikilahok sa mga attachment ng chondrocytes sa mga protina ng VKM. Kaya, ang magnesium and manganese ions ay nagbibigay ng attachment sa fibronectin at collagen type II, samantalang ang mga ions ng calcium ay hindi nakikilahok sa mga attachment ng chondrocytes sa mga protina. Sa gayon, ang mga resulta ng pag-aaral ng inilarawan sa ipakita ang epekto ng pagbabago ng ekstraselyular potasa ions, sosa, kaltsyum, at ang osmolarity ng daluyan sa Chondrocyte function na biosynthetic incubated sa karaniwang media.

Ang impluwensiya ng makina ng stress sa metabolismo ng chondrocytes

Joint immobilization ay nababaligtad pagkasayang ng kartilago, na kung saan nagpapakita ng pangangailangan ng mechanical stimuli para sa mga normal na kurso ng metabolic proseso sa VCR. Sa karamihan ng kaso, ang mga modelo ng kultura ng cell na ginamit ay umiiral sa ilalim ng normal na kondisyon ng presyur sa atmospera. Ipinakita ng M. Wright at co-authors (1996) na ang mekanikal na kapaligiran ay nakakaapekto sa metabolismo ng chondrocytes, ang tugon ng mga cell ay depende sa intensity at dalas ng load ng compression. Eksperimento na may load sa buo explants ng articular kartilago sa vitro nagpakita ng isang pagbaba ng synthesis ng protina at proteoglycans ilalim static load, dynamic load habang pasiglahin ang mga prosesong ito. Ang tumpak na mekanismo para sa pagpapatupad ng mechanical effects load sa cartilage mahirap unawain, at marahil na may kaugnayan sa pinagmanahan cells, ang hydrostatic presyon, osmotik presyon, electric potensyal na at cell ibabaw receptors para sa matrix molecules. Upang pag-aralan ang epekto ng bawat isa sa mga parameter na ito, kinakailangan upang lumikha ng isang sistema kung saan ang isang parameter ay maaaring magkakaiba-iba. Halimbawa, explant kultura ay hindi angkop para sa pag-aaral ng pagpapapangit ng mga cell, ngunit maaari itong magamit upang pag-aralan ang pangkalahatang epekto ng presyon sa ang metabolic aktibidad ng chondrocytes. Compression ng cartilage ay humahantong sa cell pagpapapangit, at din sinamahan ng ang pangyayari ng hydrostatic presyon gradient, electrical potensyal, at tuluy-tuloy na daloy ng pagbabago Pisikal at kemikal na mga kadahilanan tulad ng ang mga nilalaman ng tubig sa matrix, ang density ng electric singil, ang antas ng osmotik presyon. Maaaring pag-aralan ang cell deformation gamit ang mga nakahiwalay na chondrocytes sa ilalim ng tubig sa isang agarose o collagen gel.

Maraming mga sistema ang na-binuo upang pag-aralan ang epekto ng mekanikal pagbibigay-sigla sa kultura ng chondrocytes. Ang ilang mga mananaliksik ay gumagamit ng mga sistema para sa layuning ito kung saan ang presyon ay inilapat sa kultura ng cell sa pamamagitan ng yugto ng gas. Halimbawa, JP Veldhuijzen et al (1979) gamit ang isang presyon ng itaas atmospheric ng 13 kPa sa isang mababang dalas (0.3 Hz) sa panahon ng 15 minuto, na-obserbahan ang isang pagtaas sa kampo synthesis at proteoglycans at pagbaba ng DNA synthesis. R. Smith et al (1996) ay nagpakita na ang mga pasulput-sulpot na pagkakalantad ng pangunahing kultura ng chondrocytes bull hydrostatic presyon (10 MPa) sa 1 Hz para sa 4 na oras sanhi ng pagtaas ng synthesis ng aggrecan at collagen uri II, samantalang ang pare-pareho ang presyon ay walang epekto sa mga prosesong ito. Ang paggamit ng isang katulad na sistema M. Wright et al (1996) iniulat na ang cyclical presyon sa cell kultura ay kaugnay sa hyperpolarization ng cell lamad ng chondrocytes at pag-activate ng Ca ²⁺ -dependent potassium channel. Kaya, ang mga epekto ng presyur ng cyclic ay pinagsama sa pamamagitan ng mga channel ng ion, na aktibo sa pamamagitan ng pag-uunat, sa chondrocyte membrane. Ang tugon ng chondrocytes sa hydrostatic pressure ay depende sa mga kundisyon ng kultura ng cell at ang dalas ng inilapat na pagkarga. Kaya, cyclic hydrostatic presyon (5 MPa) binabawasan ang pagsasama ng sulfate sa Chondrocyte monolayer sa dalas ng 0.05, 0.25 at 0.5 Hz, habang para sa mga frequency sa itaas 0.5 Hz pagsasama sulpate sa cartilage explant nagtataas.

Sinabi ni M. Bushmann et al (1992) na ang chondrocytes sa isang agarose gel ay nagbabago ang biosynthesis bilang tugon sa static at dynamic na mekanikal na stress sa parehong paraan tulad ng pinag-aralang utak na organ. Natagpuan ng mga may-akda na ang mekanikal na pag-load ay bumubuo ng isang hyperosmotic stimulus na sinusundan ng isang pagbaba sa PH sa chondrocytes.

Ang epekto ng mekanikal na pag-uunat ay maaaring pag-aralan sa isang kultura ng mga selula na nahuhulog sa isang gel. Ang lumalawak na pwersa ay maaaring malikha gamit ang vacuum na kontrolado ng computer. Kapag ang sistema ay sa isang tiyak na antas ng vacuum, sa ibaba ng isang Petri ulam na may isang kultura ng mga cell ay pinalawak sa pamamagitan ng isang kilalang halaga, isang maximum pagpapapangit sa gilid ng tasa ibaba at minimum sa gitna. Ang pagpapalawak ay ipinakalat at pinag-aralan sa isang petri dish ng chondrocytes. Gamit ang pamamaraan na ito, Holm-vall K. Et al (1995) ay nagpakita na pinag-aralan sa collagen (II uri) gel chondrosarcoma cell nadagdagan ang expression ng mRNA at ₂ -integrina. At ₂ p _g integrin ay maaaring magbigkis upang i-type ang II collagen. Ito ay itinuturing na mechanoreceptors na ito nakikipag-ugnayan sa aktinsvyazyvayuschimi protina, kaya pagkonekta sa VCR at ang cytoskeleton.

Epekto ng PH sa Chondrocyte Metabolism

Ang PH ng interstitial fluid ng ECM ng cartilaginous tissue ay mas acidic kaysa sa iba pang mga tisyu. A. Maroudas (1980) tinutukoy ang pH ng articular cartilage sa 6.9. W. Diamant at co-authors (1966) ay nakakita ng isang pH ng 5.5 sa mga kondisyon ng pathological. Ito ay kilala na ang mga chondrocytes ay nabubuhay sa mababang PO2, na nagpapahiwatig ng mahalagang papel ng glycolysis (95% ng kabuuang metabolismo sa glucose) sa metabolismo ng mga selulang ito; Ang glycolysis ay sinamahan ng produksyon ng isang malaking halaga ng lactic acid.

Bilang karagdagan sa pag-aasido ng kapaligiran sa pamamagitan ng mga produkto ng glycolysis, ang mga bahagi ng matrix ay napakahalaga. Ang isang malaking bilang ng mga nakapirming mga negatibong singil sa ekstraselyular proteoglycans Binabago ang ionic komposisyon: may isang mataas na konsentrasyon ng libreng cations (hal H ⁺, Na ⁺, K ⁺ ) at mababang konsentrasyon ng anions (hal, O2, NPHS). Higit pa rito, sa ilalim ng pagkilos ng mechanical load nangyayari pagpapaalis ng tubig mula sa ECM, na hahantong sa mas mataas na concentrations ng fixed negatibong singil at makaakit ng mas maraming mga cations sa matrix. Ito ay sinusundan ng pagbabawas ng ph ng ekstraselyular daluyan, na kung saan ay nakakaapekto sa intracellular pH, at dahil doon pagbabago ng metabolismo ng chondrocytes. R. Wilkin at A. Hall (1995) pinag-aralan ang epekto ng ph ng ekstraselyular at intracellular kapaligiran matrix biosynthesis ihiwalay baka chondrocytes. Napagmasdan nila ang isang dual modification ng matrix synthesis na may pagbaba sa pH. Ang isang bahagyang pagbaba sa ph (7.4 35 S0 ₄ at ³ H-proline sa chondrocytes, samantalang ang mas malalim na pag-aasido (PH <7.1) inhibits ang synthesis sa pamamagitan ng 75% kumpara sa kontrolin. Ang paglikha ng parehong mababang pH (6.65) na may ammonium ions ay nagbunga ng pagbawas ng matris sa pamamagitan lamang ng 20%. Ang mga nakuha na resulta ay nagpapahiwatig na ang pagbabago ng pH ng extracellular matrix synthesis medium ay hindi maaaring ipaliwanag lamang sa pamamagitan ng mga pagbabago sa PH ng intracellular medium. Higit pa rito, chondrocytes nagtataglay ng kakayahan upang umayos intracellular PH sa pamamagitan ng Na ⁺, H ⁺ Exchanger, Ca ⁺ -dependent C1 ^_ -NSOZ -CONVEYORS at H ⁺ / ATPase.

[34], [35], [36], [37], [38], [39], [40]

Epekto ng komposisyon ng daluyan para sa paglilinang sa metabolismo ng chondrocytes

Ang daluyan para sa kultura ng mga chondrocytes ay dapat na tumutugma sa mga kondisyong pang-eksperimentong. Sa nakalipas na mga taon, ginamit ng calf serum upang ma-optimize ang kundisyon ng kultura. Gayunpaman, kapag gumagamit ng suwero, maraming mahalagang punto ang dapat isaalang-alang:

• panlabas na paglago ng mga selula mula sa paligid ng tisyu sa mga kultura ng organ,
• ang pagbabagu-bago ng komposisyon ng sera ng iba't ibang serye,
• pagkakaroon ng hindi kilalang mga bahagi sa kanila,
• nadagdagan ang panganib ng pagkagambala, artifacts sa pag-aaral ng impluwensya ng iba't ibang mga biological na kadahilanan sa metabolic aktibidad ng mga cell.

Ang isang halimbawa ng huli ay ang pag-aaral ng epekto ng EGF sa kartilago chondrocytes sa mga daga. Pinasigla ng EGF ang pagsasama ng ³ H-thymidine at isang pagtaas sa nilalaman ng DNA sa kultura. Ang epektong ito ay mas malinaw sa mababang concentrations ng serum (<1%), ngunit sa mataas na konsentrasyon (> 7.5%) nawala ang epekto.

Ito ay mahusay na kilala na ang mga antas ng synthesis at marawal na kalagayan sa DMEM enriched na may guya suwero ay makabuluhang nadagdagan kumpara sa vivo kondisyon. Ang mga pagkakaiba sa pagitan ng vivo at in vitro metabolism ay maaaring sanhi ng mga pagkakaiba sa pagitan ng likidong synovial at sa kapaligiran kung saan ang mga selula ay pinag-aralan. D. Lee et al (1997) pinag-aralan chondrocytes batang toro agarose paggamit ng isang nakapagpapalusog daluyan na naglalaman ng DMEM, enriched na may 20% guya suwero at isang malaking bilang ng allogeneic normal na synovial fluid. Ang pagkakaroon ng synovial fluid sa daluyan na sapilitan ng isang pagtaas sa bilang ng mga proteoglycans, hanggang sa 80% ng kabuuang halaga ng synovial fluid. Ang mga resultang ito ay nagpapahiwatig na synovial fluid sa kultura induces metabolic rate, na katulad na sa Vivo, na may mataas na antas ng synthesis ng glycosaminoglycans at mababang antas ng cell division.

G. Verbruggen et al (1995) ay nagpakita na ang synthesis ng ³⁵ S-arrpeKaHa ng tao chondrocytes pinag-aralan sa agarose sa DMEM nang walang suwero ay 20-30% ng mga antas ng synthesis obserbahan sa DMEM, pupunan na may 10% guya suwero. Ang mga may-akda matukoy ang lawak na kung saan IGF-1, IGF-2, TGF-P o nabawasan insulin produksyon aggrecan sa daluyan nang walang suwero. Ang mga may-akda concluded na ang 100 ng / ml insulin, IGF-1 o IGF-2 bahagyang pinababang synthesis ng aggrecan sa 39-53% ng mga antas ng control. Sa isang kumbinasyon ng mga salik na ito, walang sinergistic o cumulative phenomena ang natukoy. Kasabay nito, 10 ng / ml ng TGF-P sa presensya ng 100 ng / ml insulin stimulated synthesis ng aggrecan sa 90% o higit pa sa mga antas ng reference. Sa wakas, suwero transferrin, nag-iisa o sa kumbinasyon ng insulin, ay hindi nakakaapekto sa synthesis ng aggrecan. Kapag ang calf serum ay pinalitan ng bovine serum albumin, ang aggregate content ng aggrecan ay makabuluhang nabawasan. Pagpayaman kultura medium na may insulin, IGF, o TGF-P ay bahagyang naibalik ang kakayahan ng mga cell upang makabuo ng aggrecan Pinagsasama-sama. Sa kasong ito, ang IGF-1 at insulin ay maaaring mapanatili ang homeostasis sa mga kultura ng selula. Pagkatapos ng 40 araw ng kultura sa medium pupunan na may 10-20 ng / ml IGF-1, proteoglycan synthesis ay pinananatili sa parehong antas o kahit na mas mataas sa paghahambing sa medium na naglalaman ng 20% guya suwero. Catabolic proseso nagpatuloy mabagal sa medium pupunan na may IGF-1 kaysa sa medium pupunan na may 0.1% albumin solusyon, ngunit medyo mas mabilis sa medium pupunan na may 20% suwero. Sa mahabang pamumuhay kultura, 20 ng / ml IGF-1 ay nagpapanatili ng isang matatag na estado ng mga cell.

D. Lee et al (1993) kung ikukumpara ang epekto ng komposisyon ng kultura medium (DMEM, DMEM + 20% guya suwero, DMEM + 20 ng / ml IGF-1) sa DNA synthesis sa isang kultura ng explant cartilage, monolayer kultura at sa suspensyon sa agarose . Kapag pinag-aralan sa agarose sa presensya ng suwero mga may-akda sinusunod ng isang ugali upang pagpapangkat ng chondrocytes sa malaking concentrations. Mga cell may pinag-aralan na walang suwero at may IGF1, panatilihin ang isang pabilog na hugis sa agarose, ay nakolekta sa mga maliliit na grupo, ngunit hindi bumuo ng malaking Pinagsasama-sama. Sa monolayer DNA synthesis ay makabuluhang mas mataas sa suwero-naglalaman ng medium kaysa sa medium pupunan na may IGF-1; Ang pagbubuo ng DNA sa huli ay mas mataas kaysa sa unenriched na kapaligiran. Kapag culturing chondrocytes sa suspensyon sa agarose sa unconcentrated daluyan at sa isang daluyan na may IGF-1, walang pagkakaiba sa DNA synthesis. Kasabay nito ang slurry culturing chondrocytes sa agarose sa medium pupunan na may suwero, ay sinamahan ng isang mas mataas na pagsasama ng radionucleotide ³ H-thymidine kung ikukumpara sa ibang environment.

Ang bitamina C ay kinakailangan para sa pag-activate ng mga enzymes na kasangkot sa pagbubuo ng isang matatag na spiral na istraktura ng collagen fibrils. Ang mga chondrocytes, kulang na may kaugnayan sa ascorbic acid, ay nagsasama sa ilalim ng hydroxylated non-helical precursors ng collagen, na dahan-dahan na ipinaglihim. Ang pagpapakilala ng ascorbic acid (50 μg / ml) ay nagiging sanhi ng hydroxylation ng mga uri ng collagen II at IX at ang kanilang pagtatago sa normal na halaga. Ang pagdaragdag ng bitamina C ay hindi nakakaapekto sa antas ng synthesis ng proteoglycans. Dahil dito, ang pagtatago ng collagen ay nakasalalay nang nakapag-iisa sa pagtatago ng mga proteoglycans.

[41], [42], [43], [44], [45], [46], [47]