Mga eksperimentong modelo ng osteoarthritis

Ang cartilage ay isang napaka-espesyal na tisyu na naglalaman lamang ng isang uri ng mga selula (chondrocytes) at nailalarawan sa kawalan ng mga daluyan ng dugo at lymphatic. Ang cartilage ay pangunahing pinapakain sa pamamagitan ng pagsipsip mula sa synovial fluid. Ang metabolismo ng chondrocyte ay kinokontrol ng isang bilang ng mga natutunaw na salik na lokal na ginawa ng mga chondrocytes at mga nakapaligid na tisyu. Ang pag-andar ng Chondrocyte ay nakasalalay din sa komposisyon ng extracellular na kapaligiran (pag-igting ng oxygen, konsentrasyon ng ion, pH, atbp.), Ang komposisyon ng ECM, ang pakikipag-ugnayan ng mga cell at ang matrix, at mga pisikal na signal. Ang pangunahing layunin ng pang-eksperimentong pagmomodelo ay lumikha ng mga kultura sa extracellular na kapaligiran nang hindi binabago ang phenotype ng mga mature na cell. Ang pangalawang layunin ay lumikha ng mga kultura upang pag-aralan ang napaaga, naantala, panandalian, o matagal na pagtugon ng mga chondrocytes sa kemikal at/o pisikal na mga senyales. Ang mga pag-aaral sa vitro ay nagbibigay din ng pagkakataon na pag-aralan ang pag-uugali ng mga chondrocytes sa osteoarthrosis. Ang ikatlong layunin ay upang bumuo ng mga sistema ng coculture na nagpapahintulot sa pag-aaral ng mga pakikipag-ugnayan ng iba't ibang mga tisyu sa joint. Ang ikaapat na gawain ay ang paghahanda ng mga implant ng kartilago para sa kasunod na paglipat. At sa wakas, ang ikalimang gawain ay ang pag-aaral ng mga growth factor, cytokines o therapeutic agents na may kakayahang pasiglahin ang reparasyon at/o inhibiting ang cartilage resorption.

Sa nakalipas na mga dekada, nalikha ang iba't ibang modelo ng articular cartilage cell culture, kabilang ang mga monolayer culture, suspended culture, chondron culture, explants, cocultures, at immortal cell culture. Ang bawat kultura ay may sariling mga pakinabang at disadvantages, at ang bawat isa ay angkop para sa pag-aaral ng isang partikular na aspeto ng metabolismo ng chondrocyte. Kaya, ang mga cartilage explants ay isang mahusay na modelo para sa pag-aaral ng turnover ng mga elemento ng matrix, na nangangailangan ng tunay na mga cell surface receptor at normal na cell-matrix at matrix-cell na pakikipag-ugnayan. Kasabay nito, inirerekomenda na pag-aralan ang mga deposito ng matrix o mga mekanismo na kumokontrol sa metabolismo ng chondrocyte sa isang kultura ng mga nakahiwalay na selula. Ang isang low-density monolayer culture ay kinakailangan para sa pag-aaral ng proseso ng cell differentiation. Ang mga kulturang sinuspinde sa isang natural o sintetikong matrix ay isang modelo para sa pagsusuri ng adaptive na tugon ng mga chondrocytes sa mekanikal na stress.

[ 1 ], [ 2 ], [ 3 ], [ 4 ], [ 5 ], [ 6 ], [ 7 ]

Mga kultura ng Chondrocyte

Maraming mahahalagang punto ang dapat isaalang-alang kapag pumipili ng tissue ng cartilage para sa mga pag-aaral sa vitro. Ang komposisyon ng matrix at metabolic na aktibidad ng mga chondrocytes ay nag-iiba sa mga joints, at ang huli ay nakasalalay din sa lalim ng lokasyon ng chondrocyte sa tissue. Ang mga datos na ito ay nakuha sa ilang mga eksperimento kung saan pinag-aralan ang mga nakahiwalay na chondrocyte subpopulasyon mula sa mga cartilage zone na may iba't ibang lalim. Ang isang bilang ng mga pagkakaiba sa morphological at biochemical ay natagpuan sa pagitan ng mga kulturang chondrocytes na matatagpuan sa mababaw at malalim na mga layer ng articular cartilage. Ang mga mababaw na selula ay nagsi-synthesize ng kalat-kalat, proteoglycan-mahinang fibrillar matrix, samantalang ang mas malalim na mga cell ay gumagawa ng matrix na mayaman sa fibrils at proteoglycans. Bukod dito, ang mga mababaw na selula ay gumagawa ng medyo mas maliit na hindi pinagsama-samang mga proteoglycan at hyaluronic acid at medyo mas kaunting aggrecan at keratan sulfate kaysa sa mas malalim na mga chondrocytes. Ang isa pang mahalagang natatanging tampok ng metabolismo ng mga chondrocytes na nakahiwalay sa mga cartilage zone ng iba't ibang kalaliman ay ang tugon sa isang exogenous stimulus. Ayon kay M. Aydelotte et al., ang mga bovine chondrocytes mula sa superficial zone ng cartilage ay mas sensitibo sa IL-1 kaysa sa mga cell mula sa deep zone.

Ang pag-uugali ng cell ay nakasalalay din sa lokasyon ng tissue. Ang mga chondrocytes mula sa tadyang at kartilago ng tainga mula sa parehong hayop ay tumutugon nang iba sa mga kadahilanan ng paglago tulad ng fibroblast growth factor (FGF) at TGF-beta. Nadagdagan ng FGF ang pagsasama ng thymidine, proline, at leucine sa kulturang tadyang ngunit hindi sa mga chondrocyte ng tainga. Pinataas ng TGF-beta ang pagsasama ng thymidine sa rib at ear cartilage chondrocytes ngunit walang epekto sa thymidine at proline incorporation sa ear chondrocytes. Ang mga cell ng cartilage mula sa mga lugar na may mataas na stress ay naiiba sa mga mula sa mga lugar na mababa ang stress sa kartilago. Kaya, ang mga chondrocytes ng mature na tupa na tuhod joint cartilage mula sa gitnang rehiyon ng articular surface ng tibia na hindi sakop ng meniscus, na nagdadala ng pinakamalaking load sa vivo, ay nag-synthesize ng mas kaunting aggrecan, ngunit mas maraming decorin kaysa sa mga cell mula sa mga zone na sakop ng meniscus. Binibigyang-diin din ng mga may-akda ang kahalagahan ng paggamit ng kartilago mula sa magkaparehong magkasanib na mga zone kapag pinag-aaralan ang sintetikong pag-andar ng mga kasukasuan.

Ang metabolismo ng mga chondrocytes at ang kanilang pagtugon sa mga kadahilanan ng regulasyon ay makabuluhang nakasalalay din sa edad ng donor, ang kanilang pag-unlad ng kalansay, at ang kondisyon ng mga kasukasuan kung saan kinuha ang mga selula. Sa mga chondrocytes ng tao, ang isang makabuluhang pagbaba sa proliferative na tugon sa edad ay sinusunod. Ang pinakamalaking pagbaba ay makikita sa mga donor na may edad na 40-50 taon at higit sa 60 taon. Bukod dito, ang kalubhaan ng proliferative na tugon sa mga kadahilanan ng paglago (hal., FGF at TGF-beta) ay bumababa sa pagtanda. Bilang karagdagan sa dami ng mga pagbabago sa paglaganap ng chondrocyte, mayroon ding mga pagbabago sa husay. Ang mga cell mula sa mga batang donor (10-20 taon) ay mas mahusay na tumutugon sa platelet-derived growth factor (PDGF) kaysa sa TGF-beta, habang ang kabaligtaran ay sinusunod sa mga cell mula sa mga adult na donor. Maraming mga mekanismo ang ginagamit upang ipaliwanag ang mga pagbabago na nakasalalay sa edad sa sintetikong pag-andar ng mga chondrocytes at ang kanilang tugon sa mga kadahilanan ng paglago. Kabilang dito ang pagbaba sa bilang at pagkakaugnay ng mga surface cell receptor, mga pagbabago sa synthesis at bioactivity ng growth factor at cytokines, at pagbabago ng post-receptor signal.

Ang pathological na kondisyon ng mga joints ay nagbabago din sa morpolohiya at metabolic na aktibidad ng chondrocytes. Kaya, J. Kouri et al. (1996) kinilala ang tatlong subpopulasyon ng chondrocytes sa cartilage sa osteoarthrosis. Ang mga Chondrocytes mula sa mababaw at itaas na bahagi ng gitna ng cartilage ay bumubuo ng mga kumpol at nag-synthesize ng mas malaking halaga ng proteoglycans at collagen. Nagagawa ng TGF-beta at insulin-like growth factor (IGF) na pasiglahin ang synthesis ng proteoglycans ng mga chondrocytes at bahagyang neutralisahin ang mga epekto ng IL-1 at TNF-a. Ang mga explant ng cartilage na apektado ng osteoarthrosis at chondrocytes na nakahiwalay sa cartilage ng isang pasyente na may osteoarthrosis ay mas sensitibo sa stimulation ng TGF-beta kaysa sa chondrocytes ng malusog na cartilage. Ang mga pagkakaibang ito ay malamang na nauugnay sa mga phenotypic na pagbabago sa mga chondrocytes sa itaas na mga layer ng articular cartilage.

Ang paghihiwalay ng mga indibidwal na chondrocytes ay nakamit sa pamamagitan ng sunud-sunod na paggamot ng ECM na may mga proteolytic enzymes. Pagkatapos ng kanilang paglabas mula sa ECM, ang mga nakahiwalay na mga cell ay perpekto para sa pag-aaral ng de novo synthesis ng mga bahagi ng matrix. Ang ilang mga may-akda ay gumagamit lamang ng clostridial collagenase, habang ang iba ay paunang nag-incubate sa cartilage ng trypsin, pronase, DNase, at/o hyaluronidase. Ang bilang ng mga nakahiwalay na selula ay nakasalalay sa mga enzyme na ginamit. Kaya, kapag ginagamot sa collagenase lamang, 1.4-10 ⁶ chondrocytes ay maaaring makuha mula sa 1 g ng tissue, habang gumagamit ng pronase, hyaluronidase, at collagenase - 4.3-10 ⁶. Kapag ginagamot sa collagenase, ang aggrecan, mga protina, IL-6, at IL-8 ay nananatili sa kultura ng cell sa mas malaking dami kaysa sa sunud-sunod na paggamot na may iba't ibang mga enzyme. Mayroong ilang mga paliwanag para sa mga pagkakaibang ito sa pagitan ng dalawang kultura ng cell:

• Ang mga cell receptor ay nasira o pinipigilan ng mga enzyme, pinipigilan ng TGF-beta ang DNA at proteoglycan synthesis sa mga bagong hiwalay na chondrocytes (araw 1), samantalang ang DNA at proteoglycan synthesis sa mga chondrocytes na na-culture sa isang monolayer (7 araw) ay pinasigla ng TGF-beta. Gayunpaman, ang isang sapat na panahon ay kinakailangan para sa muling pagpapahayag ng mga bahagi ng lamad na ito bago magsimula ang eksperimento.
• Ang mga exogenous na protease ay maaaring makagambala sa interaksyon ng integrin-mediated cell-matrix. Ang pamilyang integrin ay nagtataguyod ng pagkakabit ng mga chondrocytes sa mga molekula ng ECM (Shakibaei M. et al., 1997). Ang pagkagambalang ito ay maaaring makaapekto sa pagpapahayag ng mga matrix genes.
• Ang mga labi ng mga bahagi ng matrix ay maaaring umayos sa synthetic function ng chondrocytes. Nakikilala ng mga Integrin ang mga produkto ng pagkasira ng ECM, kaya gumaganap ng isang mahalagang papel sa reparasyon ng tissue pagkatapos ng pagkilos ng mga proteolytic enzymes. T. Larsson et al. (1989) iniulat na ang pagdaragdag ng buo o pira-pirasong proteoglycans sa cell culture ay nagpapasigla sa synthesis ng mga protina at proteoglycans. Gayunpaman, ang isang mataas na antas ng hyaluronic acid ay nagdudulot ng makabuluhang pagbaba sa pagsasama ng mga sulfate sa synthesis ng proteoglycans ng mga chondrocytes ng embryo ng manok, mga mature na chondrocytes ng baboy at mga chondrosarcoma na selula ng daga. Bukod dito, ang hyaluronic acid ay isang inhibitor ng paglabas ng proteoglycan mula sa mga cell kahit na sa pagkakaroon ng IL-1b, TNF-a, FGF, na nagpapahiwatig ng pagkontra sa unang biological na aktibidad ng mga kadahilanan ng paglago at cytokine. Ang eksaktong mekanismo na pinagbabatayan ng pagkilos ng hyaluronic acid ay nananatiling hindi maliwanag; Ang mga Chondrocytes ay kilala na naglalaman ng isang receptor para sa hyaluronic acid na nauugnay sa mga actin filament ng cytosol. Ang pagbubuklod ng hyaluronic acid sa receptor nito ay nagpapasigla sa phosphorylation ng protina. Kaya, ang mga datos na ito ay nagpapakita ng modulasyon ng chondrocyte metabolic function sa pamamagitan ng mga pira-piraso o katutubong molekula ng mga protina ng matrix sa pamamagitan ng pag-activate ng mga receptor ng cell membrane.
• Ang mabilis na pagpapasigla ng matrix protein synthesis ng mga chondrocytes sa pamamagitan ng mga enzyme ay maaaring bunga ng mga pagbabago sa hugis ng chondrocyte at/o pagbabagong-tatag ng cytoskeletal.
• Ang ilang mga cytokine (hal., IL-8) at growth factor (hal., IGF-1, TGF-β) ay na-sequester sa ECM. Ang pinakakilalang halimbawa ay ang pagbubuklod ng TGF-β sa pamamagitan ng decorin, na nagreresulta sa pagbaba ng kakayahan ng dating na mag-udyok ng paglaki ng cell sa mga Chinese hamster ovarian cells. Ang paghahanap na ang nilalaman ng decorin sa cartilage ay tumataas sa edad ay nagmumungkahi ng pagbaba sa TGF-β bioavailability sa pagtanda. Ang mga kadahilanan ng paglago at mga cytokine ay maaaring mailabas mula sa mga labi ng matrix sa panahon ng kultura at pagkatapos ay baguhin ang pag-andar ng chondrocyte.

[ 8 ], [ 9 ], [ 10 ], [ 11 ]

Monolayer na kultura ng chondrocytes

Ang pagkakaiba-iba ng phenotype ng chondrocytes ay pangunahing nailalarawan sa pamamagitan ng synthesis ng type II collagen at tissue-specific proteoglycans, pati na rin ang isang mababang antas ng mitotic na aktibidad. Mayroong katibayan na sa matagal na paglilinang ng cell sa isang monolayer, gayundin pagkatapos ng ilang paulit-ulit na mga sipi ng cell, ang mga chondrocyte ay nawawala ang kanilang mga spherical na balangkas at nakakakuha ng isang pinahabang, tulad ng fibroblast na hugis. Sa ganitong fibroblastic metaplasia, ang synthetic function ng mga cell ay binago din, na nailalarawan sa pamamagitan ng isang progresibong pagbaba sa synthesis ng collagens type II, IX at XI at isang pagtaas sa synthesis ng collagens type I, III at Y. Maliit na non-aggregated proteoglycans ay synthesize dahil sa functional aggrecan. Ang synthesis ng cathepsin B at L ay napakababa sa magkakaibang mga selula, ngunit tumataas sa proseso ng pagkawala ng pagkita ng kaibhan. Collagenase-1 ay ipinahayag sa differentiated chondrocytes; na may matagal na paglilinang, ang pagpapahayag nito ay bumababa, habang ang produksyon ng mga tissue inhibitors ng metalloproteases (TIMPs) ay tumataas.

Ang magkakaibang mga chondrocytes ay muling nagpapahayag ng collagen ng magkakaibang phenotype kapag inilipat mula sa monolayer patungo sa nasuspinde na kultura. Ang proseso ng pagkita ng kaibhan ay malamang na nauugnay sa hugis ng cell. Ang ari-arian na ito ay regular na ginagamit ng mga mananaliksik na nag-aaral ng mga defective grafts na may mga autologous chondrocytes. Ang isang maliit na bilang ng mga cell na nakuha mula sa biopsy na materyal ay maaaring mapalawak sa monolayer na kultura at pagkatapos ay muling ipakilala sa isang three-dimensional na matrix bago ang paglipat. Ang muling pagpapahayag ng isang tiyak na phenotype ng mga dedifferentiated chondrocytes na inilipat sa kultura ng agarose ay maaaring pasiglahin ng TGF-β, ossein-hydroxyapatite complex, at ascorbic acid.

Bilang tugon sa mga kadahilanan ng paglago at cytokine, ang mga chondrocytes ay binago sa panahon ng proseso ng pagkita ng kaibhan. Ang tugon ng cellular sa mga cytokine at mga kadahilanan ng paglago ay naiiba sa pagitan ng mga hindi nakikilala at magkakaibang mga chondrocytes. Pinasisigla ng IL-1 ang paglaganap ng fibroblast, samantalang ang paglaki ng mga hindi nakikilalang chondrocytes ay pinipigilan ng IL-1. Ang synthesis ng DNA ay pinasigla ng IGF-1 sa mga pinahabang ngunit hindi napipintong chondrocytes. Sa magkakaibang mga chondrocytes, ang stimulatory effect ng IL-1beta at TNF-a sa procollagenase production ay mas malinaw kaysa sa undifferentiated chondrocytes.

Paglilinang ng Chondrocyte

Ang paglilinang ng mga chondrocytes sa suspensyon sa isang likidong daluyan o sa isang natural o sintetikong three-dimensional na matrix ay nagpapatatag sa chondrocyte phenotype. Ang mga cell ay nagpapanatili ng kanilang spherical na hugis at synthesize ng tissue-specific na protina. Ang sinuspinde na kultura ng chondrocytes ay karaniwang inirerekomenda para sa pag-aaral ng pagbuo ng isang bagong pericellular matrix. Ang mga kultura ng chondrocytes sa synthetic o natural absorbent polymers ay ginagamit para sa pagtatanim ng mga cell sa mga depekto sa cartilage upang pasiglahin ang pagbabagong-buhay ng joint cartilage tissue. Ang synthetic o natural na medium para sa implanted cells ay dapat matugunan ang ilang mga kinakailangan:

• Ang mga implant ay dapat magkaroon ng porous na istraktura para sa pagdirikit at paglaki ng cell,
• ni ang polymer mismo o ang mga degradation na produkto nito ay hindi dapat magdulot ng pamamaga o mga nakakalason na reaksyon kapag itinanim sa vivo,
• ang graft carrier ay dapat magkaroon ng kakayahang mag-bonding sa katabing cartilage o subchondral bone,
• ang natural o sintetikong matrix ay dapat magkaroon ng kakayahang sumipsip, ang pagkasira nito ay dapat balansehin ng tissue regeneration,
• upang mapadali ang pag-aayos ng cartilage, ang kemikal na istraktura at pore architecture ng matrix ay dapat na mapadali ang pagpapanatili ng cellular phenotype at ang synthesis ng mga tissue-specific na protina ng mga chondrocytes na inilagay dito,
• Sa panahon ng in vivo implantation, kinakailangang pag-aralan ang mga mekanikal na katangian ng synthetic o natural na matrix.

[ 12 ], [ 13 ], [ 14 ], [ 15 ], [ 16 ]

Suspensyon ng mga chondrocytes sa likidong yugto

Ang pagkakabit ng mga cell sa mga plastic na sisidlan kung saan ang mga chondrocyte ay pinag-kultura ay maaaring mapigilan sa pamamagitan ng paglalagay sa kanilang mga dingding ng isang solusyon ng methylcellulose, agarose, hydrogel (poly-2-hydroxyethyl methacrylate), o isang collagen-agarose mixture. Sa ilalim ng mga kundisyong ito, ang mga chondrocytes ay bumubuo ng mga kumpol at nag-synthesize pangunahin ang mga aggrecan at tissue-specific na collagens (II, IX, XI na mga uri). Dalawang uri ng mga cell ang karaniwang matatagpuan. Ang mga cell na matatagpuan sa gitna ay nagpapanatili ng isang spherical na hugis at napapalibutan ng isang mahusay na binuo na ECM, na kinumpirma ng histochemical at ultrastructural na pag-aaral. Sa paligid, ang mga chondrocyte ay may mga discoid na balangkas at napapalibutan ng isang kalat-kalat na ECM; kaunti ang nalalaman tungkol sa mga functional na katangian ng naturang mga cell.

Posibleng linangin ang mga chondrocytes sa mga microcarrier na pinananatili sa suspensyon; dextran beads (cytodex), collagen-coated dextran beads (cytodex III), at non-porous microspheres ng type I collagen (cellagen) ay ginagamit bilang microcarriers. Sa ilalim ng mga kondisyong ito sa pag-kultura, ang mga chondrocyte ay nakakabit sa ibabaw ng microcarrier, pinapanatili ang kanilang spherical na hugis, at gumagawa ng isang materyal na tulad ng matrix. Bukod dito, ang paggamit ng cellagen ay nagtataguyod ng paglaganap ng chondrocyte at muling pagpapahayag ng normal na phenotype. Samakatuwid, ang pag-culture ng mga chondrocytes sa cellagen microspheres ay maaaring gamitin upang maibalik ang cell phenotype bago ang paglipat.

Ang isa pang paraan ng pag-culture ng chondrocyte suspension sa isang likidong daluyan ay ang kanilang paglilinang sa anyo ng mga siksik na bola na binubuo ng mga cell (0.5-1 * 10 ^b ), na nakuha sa pamamagitan ng centrifugation. Ang ganitong mga chondrocytes ay may kakayahang gumawa ng isang matrix na naglalaman ng isang malaking halaga ng proteoglycans, collagen type II, ngunit hindi collagen type I, na kung saan ay nakumpirma ng histological, immunohistochemical at quantitative na pamamaraan.

Suspensyon ng chondrocytes sa natural na ECM

Ang mga Chondrocytes ay maaaring i-culture sa suspensyon sa isang three-dimensional na matrix (soft agar, agarose, collagen gel o sponge, hyaluronic acid, fibrin glue, alginate beads).

Ang mga chondrocyte na na-culture sa agarose ay nagpapanatili ng kanilang normal na phenotype at nag-synthesize ng type II collagen at mga aggrecan na tukoy sa tissue. Kapag na-culture sa agarose, ang mga proteoglycan na na-synthesize ng cell ay inilabas sa medium sa loob ng 50 araw. Para sa paghahambing, sa isang monolayer na kultura, ang cellular phase ay napuno ng mga glycosaminoglycans na nasa unang 5-6 na araw ng paglilinang; kapag nilinang sa daluyan, pagkatapos ng pagtaas ng synthesis at pagpapalabas ng mga glycosaminoglycans sa unang 8-10 araw, nangyayari ang kanilang pagbabawas na nakasalalay sa oras. Gayunpaman, ang pag-uugali ng mga chondrocytes kapag nilinang sa agarose ay naiiba sa vivo. Sa agarose, ang isang malaking bilang ng mga synthesized aggrecan aggregates ay naglalaman ng mas maliliit na molekula at mas kaunting mga molekula kaysa sa vivo. Pinasisigla ng TGF-β ang proteoglycan synthesis sa explant, ngunit binabawasan ang aggrecan synthesis sa agarose.

Ang alginate ay isang linear polysaccharide na nakuha mula sa brown seaweed. Sa pagkakaroon ng divalent cations, tulad ng Ca ²⁺ ions, nagiging gel ang polimer na ito. Ang bawat chondrocyte na nakulong sa alginate ay napapalibutan ng isang matrix ng mga negatibong sisingilin na polysaccharides, na ang mga pores ay maihahambing sa mga nasa hyaline cartilage. Ang matrix na nabuo ng chondrocytes sa alginate beads ay binubuo ng dalawang compartments - isang manipis na layer ng cell-associated matrix na naaayon sa pericellular at territorial matrix ng articular cartilage at isang mas malayong matrix na katumbas ng interterritorial sa native tissue. Sa ika-30 araw ng kultura, ang kamag-anak at ganap na dami na inookupahan ng mga selula at bawat isa sa dalawang compartment sa isang alginate bead ay halos ganap na magkapareho sa mga nasa katutubong kartilago. Sa loob ng halos 30 araw, ang mga chondrocytes ay nagpapanatili ng kanilang spherical na hugis at gumagawa ng aggrecan, ang mga hydrodynamic na katangian na kung saan ay katulad ng mga aggrecan molecule sa articular cartilage matrix, pati na rin ang mga collagen molecule ng mga uri II, IX, at XI. Kasabay nito, tulad ng iba pang mga kultura ng suspensyon, ang mga flattened na cell ay naroroon sa ibabaw ng alginate beads, na gumagawa ng isang maliit na halaga ng mga molekula ng collagen ng uri I, na direktang inilabas sa medium at hindi isinama sa ECM. Ang katamtamang paglaganap ng mga chondrocytes ay sinusunod sa alginate beads. Pagkatapos ng 8 buwan ng paglilinang sa alginate gel, ang mga mature na chondrocyte ay hindi nawawalan ng metabolic activity at patuloy na synthesize ang tissue-specific collagen type II at aggrecan.

H. Tanaka et al. (1984) ay nag-imbestiga sa mga katangian ng pagsasabog ng iba't ibang mga natural na molekula sa alginate at natagpuan na ang mga molekula na mas malaki sa 70 kDa ay hindi nagkakalat sa pamamagitan ng alginate. Kaya, ang kultura ng cell sa alginate ay angkop para sa pag-aaral ng regulasyon ng matrix biosynthesis at samahan ng ECM. Ang pagkakaroon ng mga cell na naka-culture sa alginate ay nagbibigay-daan sa isa na pag-aralan ang pagkilos ng peptide regulatory factor at mga pharmacological agent sa transcriptional, post-transcriptional, at translational na antas.

Ang mga Chondrocytes ay nilinang din sa isang matrix ng collagen fibers ng mga uri I at II. S. Nehrer et al. (1997) inihambing ang paggana ng canine chondrocytes sa mga porous na collagen-proteoglycan polymer matrice na naglalaman ng mga collagens ng iba't ibang uri. Natagpuan nila ang mahahalagang pagkakaiba sa morpolohiya ng biosynthetic function ng mga chondrocytes na nakakultura sa mga collagen matrice na naglalaman ng mga uri ng collagen I at II. Ang mga cell sa isang matrix ng collagen type II ay nagpapanatili ng kanilang spherical na hugis, habang sa collagen type I mayroon silang isang fibroblast-like morphology. Bukod dito, sa isang matrix ng collagen type II, ang mga chondrocytes ay gumawa ng mas malaking halaga ng glycosaminoglycans. J. van Susante et al. (1995) inihambing ang mga katangian ng mga chondrocytes na nilinang sa alginate at collagen (type I) gel. Natuklasan ng mga may-akda ang isang makabuluhang pagtaas sa bilang ng mga cell sa collagen gel, ngunit mula sa ika-6 na araw ng paglilinang ang mga cell ay nawala ang kanilang katangian na phenotype, na nagiging fibroblast-like na mga cell. Sa alginate gel, isang pagbawas sa bilang ng mga cell ay naobserbahan, ngunit pinanatili ng chondrocytes ang kanilang normal na phenotype. Sa collagen gel, ang bilang ng mga proteoglycans bawat cell ay makabuluhang mas mataas kaysa sa alginate, ngunit sa gel isang pagbaba sa synthesis ng mga elemento ng matrix ay naobserbahan, simula sa ika-6 na araw ng paglilinang, habang sa alginate ang synthesis ay patuloy na tumaas.

Ang solidong three-dimensional na fibrin matrix ay isang natural na sangkap na sumusuporta sa mga chondrocytes na nasuspinde dito sa isang naiibang phenotype. Ang three-dimensional na fibrin matrix ay maaari ding gamitin bilang carrier sa chondrocyte transplantation. Ang mga bentahe ng fibrin ay ang kawalan ng cytotoxicity, ang kakayahang punan ang espasyo, at kapasidad ng malagkit. Ang mga histological at biochemical na pag-aaral, autoradiography, at electron microscopy ay nagpakita na ang mga chondrocytes sa fibrin gel ay nagpapanatili ng kanilang morpolohiya, dumarami, at gumagawa ng matrix kahit na pagkatapos ng 2 linggo ng paglilinang. Gayunpaman, G. Homminga et al. (1993) ay nag-ulat na ang fibrin disintegration ay nagsisimula pagkatapos ng 3 araw ng paglilinang, at ang chondrocyte dedifferentiation ay umuusad.

Suspensyon ng chondrocytes sa artipisyal (synthetic) ECM

Ang mga cartilage implants para sa reconstructive o orthopedic surgery ay maaaring makuha sa pamamagitan ng paglaki ng mga nakahiwalay na chondrocytes sa vitro sa isang sintetikong biocompatible na matrix.

Ang mga Chondrocytes na naka-culture sa polyglycolic acid ay dumarami at nagpapanatili ng normal na morpolohiya at phenotype sa loob ng 8 linggo. Ang chondrocyte-polyglycolic acid complex ay binubuo ng mga cell, glycosaminoglycans, collagens, at may panlabas na collagen capsule. Gayunpaman, ang mga naturang implant ay naglalaman ng dalawang uri ng mga molekula ng collagen - I at II. Ang mga implant mula sa mga chondrocytes na na-dedifferentiated ng isang serye ng mga sipi ay may mas malaking halaga ng mga glycosaminoglycans at collagens kaysa sa mga implant mula sa mga pangunahing hindi natukoy na chondrocytes.

L. Freed et al. (1993b) inihambing ang pag-uugali ng mga kultura ng tao at bovine chondrocyte sa fibrous polyglycolic acid (FPGA) at porous polylactic acid (PPLA). Pagkatapos ng 6-8 na linggo ng pag-culture ng bovine chondrocytes sa FPGA o PPLA, naobserbahan ng mga may-akda ang paglaganap ng cell at pagbabagong-buhay ng cartilage matrix. Sa FPGA, ang mga chondrocytes ay may spherical na hugis at matatagpuan sa lacunae na napapalibutan ng isang cartilage matrix. Pagkatapos ng 8 linggo ng in vitro culturing, ang regenerated tissue ay naglalaman ng hanggang 50% dry matter (4% cellular mass, 15% glycosaminoglycans, at 31% collagens). Sa PPLA, ang mga cell ay may hugis ng spindle at isang maliit na halaga ng glycosaminoglycans at collagen. Sa FPGA, ang paglaki ng cell ay 2 beses na mas matindi kaysa sa PPLA. Sa vivo, ang mga chondrocytes na lumaki sa VPGK at PPLC ay gumawa ng tissue na histologically katulad ng cartilage sa loob ng 1-6 na buwan. Ang mga implant ay naglalaman ng glycosaminoglycans, collagens type I at II.

Ang bovine fetal chondrocytes ay nilinang sa porous high-density hydrophobic at hydrophilic polyethylene. Pagkatapos ng 7 araw ng pagpapapisa ng itlog sa parehong mga substrate, ang mga cell ay nagpapanatili ng isang spherical na hugis at naglalaman ng pangunahing uri ng II collagen. Pagkatapos ng 21 araw ng paglilinang, ang hydrophilic matrix ay natagpuang naglalaman ng mas maraming type II collagen kaysa sa hydrophobic matrix.

Ang tissue ng cartilage ay maaari ding makuha sa pamamagitan ng pag-culture sa isang monolayer sa mga filter ng Millicell-CM. Ang pre-coating ng mga filter na may collagen ay kinakailangan para sa attachment ng chondroitins. Ang pagsusuri sa histological ng kultura ay nagpapakita ng akumulasyon ng mga chondrocytes sa ECM na naglalaman ng mga proteoglycan at uri ng collagen. Ang type I collagen ay hindi nakita sa naturang kultura. Ang mga chondrocytes sa nakuha na tissue ng cartilage ay spherical sa hugis, ngunit sa ibabaw ng tissue sila ay medyo pipi. Ang kapal ng bagong nabuo na tissue ay tumaas sa paglipas ng panahon at depende sa paunang density ng cell monolayer. Sa ilalim ng pinakamainam na kondisyon ng pag-culture, ang kapal ng tissue ng cartilage ay umabot sa 110 μm, ang organisasyon ng mga cell at collagen nito sa mababaw at malalim na mga layer ay katulad ng articular cartilage. Ang ECM ay naglalaman ng humigit-kumulang 3 beses na mas maraming collagen at proteoglycans. Pagkatapos ng 2 linggo ng paglilinang, ang akumulasyon ng matrix ay naobserbahan, na nagpapahintulot sa tissue na makuha mula sa filter at magamit para sa paglipat.

Sims et al. (1996) pinag-aralan ang paglilinang ng mga chondrocytes sa polyethylene oxide gel, isang encapsulated polymer matrix na nagpapahintulot sa paglipat ng malaking bilang ng mga cell sa pamamagitan ng iniksyon. Anim na linggo pagkatapos ng iniksyon sa subcutaneous tissue ng athymic mice, nabuo ang bagong cartilage, na kung saan ay morphologically characterized ng isang puting opalescence na katulad ng hyaline cartilage. Ang data ng histological at biochemical ay nagpahiwatig ng pagkakaroon ng aktibong proliferating chondrocytes na gumagawa ng ECM.

Pagpapaliwanag

Ang paliwanag ng tissue ng cartilage ay ginagamit upang pag-aralan ang mga proseso ng ana- at catabolism sa loob nito, pagpapanatili ng homeostasis, resorption at pagkumpuni. Ang mga Chondrocytes sa cartilage explants ay nagpapanatili ng isang normal na phenotype at ECM na komposisyon na katulad ng mga nasa articular cartilage sa vivo. Pagkatapos ng 5 araw ng pag-culture sa pagkakaroon ng suwero, ang isang pare-parehong antas ng synthesis at natural na mga proseso ng pagkasira ay nakamit. Maaaring mapabilis ang resorption ng tissue sa pangunahing kultura at sa kultura sa pagdaragdag ng serum gamit ang isang bilang ng mga ahente, tulad ng IL-IB, TNF-a, bacterial lipopolysaccharides, retinoic acid derivatives o aktibong oxygen radical. Upang pag-aralan ang reparation ng cartilage, ang pinsala nito ay udyok ng mga natutunaw na inflammatory mediator (H ₂ O ₂, IL-1, TNF-a) o pisikal na pagkalagot ng matrix.

Ang pamamaraan ng kulturang organotypic ay isang modelo para sa mga in vitro na pag-aaral ng mga epekto ng nakahiwalay na panlabas na mga kadahilanan sa chondrocytes at ang nakapalibot na matrix. Sa vivo, ang mga chondrocytes ay kakaunti ang matatagpuan sa ECM at hindi nakikipag-ugnayan sa isa't isa. Ang articular cartilage explant culture ay nagpapanatili sa istrukturang organisasyong ito, pati na rin ang mga partikular na pakikipag-ugnayan sa pagitan ng mga chondrocytes at ng nakapalibot na extracellular na kapaligiran. Ginagamit din ang modelong ito upang pag-aralan ang mga epekto ng mekanikal na stress, mga pharmacological agent, growth factor, cytokine, at hormones sa cartilage metabolism.

Ang isa pang bentahe ng cartilage tissue explantation ay ang kawalan ng pinsala sa chondrocytes sa ilalim ng pagkilos ng proteolytic enzymes o mekanikal na mga kadahilanan, na hindi maiiwasan kapag naghihiwalay ng mga cell. Ang mga receptor at iba pang mga protina ng lamad at glycoprotein ay protektado mula sa mga nakakapinsalang salik.

[ 17 ], [ 18 ], [ 19 ], [ 20 ], [ 21 ]

Kultura ng Chondron

Ang Chondron ay isang structural, functional at metabolic unit ng articular cartilage na binubuo ng isang chondrocyte, ang pericellular matrix nito at compact filamentous capsule at responsable para sa matrix homeostasis. Ang mga Chondron ay mekanikal na kinukuha mula sa cartilage at kinokolekta gamit ang ilang sunud-sunod na low-speed homogenization. Ang mga chondron na nakahiwalay sa mga zone na may iba't ibang lalim ng cartilage ay maaaring nahahati sa apat na kategorya: single chondron, paired chondrons, maramihang (tatlo o higit pa) linearly arranged chondrons (chondron columns), at chondron clusters.

Ang mga solong chondrons ay karaniwang matatagpuan sa gitnang mga layer ng buo na kartilago, ang mga ipinares na chondrons ay matatagpuan sa hangganan ng gitna at malalim na mga layer, linearly na nakaayos ang maramihang mga chondrons ay tipikal ng malalim na mga layer ng buo na kartilago. Sa wakas, ang mga kumpol ng chondron ay binubuo ng mga random na organisadong grupo ng mga single at paired na chondrons, na nagpapanatili ng pinagsama-samang estado pagkatapos ng homogenization. Ang mga kumpol ng chondron ay malalaking fragment ng cartilage, kadalasang naglalaman ng ilang chondrons at radially arranged collagen fibrils, ibig sabihin, isang tipikal na organisasyong katangian ng malalim na mga layer ng matrix. Ang mga Chondrons ay hindi kumikilos sa transparent na agarose, na nagbibigay-daan para sa pag-aaral ng kanilang istraktura, komposisyon ng molekular, at metabolic na aktibidad. Ang chondron-agarose system ay itinuturing na isang micromodel ng cartilage, na naiiba sa tradisyonal na chondrocyte-agarose system dahil ang natural na microenvironment ay napanatili, at hindi na kailangang i-synthesize at tipunin ito. Ang kultura ng Chondron ay isang modelo para sa pag-aaral ng mga pakikipag-ugnayan ng mga cell at matrix sa articular cartilage sa ilalim ng normal at pathological na mga kondisyon.

[ 22 ], [ 23 ], [ 24 ], [ 25 ], [ 26 ], [ 27 ]

Kultura ng walang kamatayang chondrocytes

Ang recombinant DNA o mga virus na naglalaman ng oncogene na may kakayahang gumawa ng isang cell na "immortal" ay ginagamit upang lumikha ng mga permanenteng linya ng cell. Ang mga imortal na chondrocytes ay may kakayahang lumaganap nang walang hanggan habang pinapanatili ang isang matatag na phenotype. F. Mallein-Gerin et al. (1995) ay nagpakita na ang SV40T oncogene ay nagpapahiwatig ng paglaganap ng mga mouse chondrocytes, na patuloy na nagpapahayag ng mga uri ng collagen II, IX, at XI, pati na rin ang articular aggrecan at nagbubuklod na protina. Gayunpaman, ang naturang cell line ay nakakakuha ng kakayahang mag-synthesize ng collagen type I kapag nililinang ito sa isang monolayer na kultura o sa isang agarose gel.

W. Horton et al. (1988) inilarawan ang isang linya ng walang kamatayang mga selula na may mababang antas ng pagpapahayag ng uri II collagen mRNA. Ang mga cell na ito ay nakuha sa pamamagitan ng kanilang pagbabago sa isang mouse retrovirus na naglalaman ng I-myc- at y-ra-oncogenes. Ang ganitong uri ng mga cell ay kumakatawan sa isang natatanging modelo para sa pag-aaral ng mga pakikipag-ugnayan ng articular matrix sa kawalan ng type II collagen, pati na rin ang regulasyon ng type II collagen synthesis.

Ang kultura ng mga chondroprites na may mutated o tinanggal na mga gene ay isang maginhawang modelo para sa pag-aaral ng kanilang physiological function. Ang modelong ito ay partikular na angkop para sa pag-aaral ng papel ng mga tiyak na molekula sa organisasyon ng cartilage matrix o para sa pagsisiyasat ng mga epekto ng iba't ibang regulatory factor sa cartilage metabolism. Ang mga Chondrocyte na may tinanggal na gene para sa type IX collagen ay nag-synthesize ng collagen fibrils na mas malawak kaysa sa normal, na nagpapahiwatig na ang type IX collagen ay kinokontrol ang diameter ng mga fibrils. Gaya ng nabanggit sa Kabanata 1, ang isang mutation sa COLAI gene encoding type II collagen ay natuklasan kamakailan sa mga pamilyang may pangunahing pangkalahatang osteoarthritis. Upang pag-aralan ang epekto ng mutant type II collagen sa articular matrix, R. Dharmrvaram et al. (1997) inilipat (nahawahan ng dayuhang nucleic acid) may depektong COL ₂ AI (arginine sa posisyon 519 ay pinalitan ng cysteine) sa fetal chondrocytes ng tao sa vitro.

Sistema ng kultura. Sa kasukasuan, ang kartilago ay nakikipag-ugnayan sa iba pang mga uri ng mga selula na nakapaloob sa synovial membrane, synovial fluid, ligaments, at subchondral bone. Ang metabolismo ng mga chondrocytes ay maaaring maapektuhan ng iba't ibang natutunaw na mga kadahilanan na na-synthesize ng mga nakalistang selula. Kaya, sa arthritis, ang articular cartilage ay nawasak ng mga proteolytic enzymes at mga libreng radical na ginawa ng mga synovial cells. Samakatuwid, ang mga modelo ay binuo upang pag-aralan ang mga kumplikadong pakikipag-ugnayan sa pagitan ng kartilago at mga nakapaligid na tisyu, na tinatawag na cocultures.

S. Lacombe-Gleise et al. (1995) ang kulturang rabbit chondrocytes at osteoblast sa isang coculture system (COSTAR) kung saan ang mga cell ay pinaghihiwalay ng isang microporous membrane (0.4 μm) na nagpapahintulot sa pagpapalitan sa pagitan ng dalawang uri ng cell nang walang anumang direktang kontak. Ang pag-aaral na ito ay nagpakita ng kakayahan ng mga osteoblast na pasiglahin ang paglaki ng chondrocyte sa pamamagitan ng mga natutunaw na mediator.

Pinag-aralan ni AM Malfait at ng mga kapwa may-akda (1994) ang kaugnayan sa pagitan ng peripheral blood monocytes at chondrocytes. Ang modelong ito ay maginhawa para sa pag-aaral ng cytokine-mediated na mga proseso sa inflammatory arthropathies (rheumatoid arthritis, seronegative spondyloarthritides, atbp.). Pinaghiwalay ng mga may-akda ng modelo ang mga cell na may isang lamad na nagbubuklod ng protina na may mga pores na 0.4 μm ang lapad. Ipinakita ng pag-aaral na ang mga monocyte na pinasigla ng lipopolysaccharide ay gumawa ng IL-1 at TNF-a, na pumipigil sa synthesis ng aggrecan ng mga chondrocytes at nag-ambag sa pagkasira ng mga na-synthesize na aggrecan aggregates.

K. Tada et al. (1994) ay lumikha ng isang modelo ng coculture kung saan ang mga endothelial cells sa isang collagen (type I) gel ay inilagay sa isang panloob na silid na hiwalay mula sa panlabas na silid na may mga chondrocytes na inilagay dito sa pamamagitan ng isang filter na may sukat ng butas na 0.4 μm. Sa isang estado ng kumpletong paghihiwalay mula sa panlabas na silid, ang mga endothelial cell ng tao ay bumubuo ng mga tubo sa isang collagen gel sa pagkakaroon ng EGF o TGF-a. Kapag ang parehong mga uri ng mga cell ay pinagsama nang sabay-sabay, ang pagbuo ng TGF-a-dependent na tubo ng mga endothelial cells ay napigilan. Ang pagsugpo sa prosesong ito ng mga chondrocytes ay bahagyang inalis ng mga anti-TGF-beta antibodies. Maaaring ipagpalagay na ang TGF-beta na ginawa ng chondrocytes ay pumipigil sa vascularization ng cartilage mismo.

S. Groot et al. (1994) sabay-sabay na nilinang ang mga chondrocytes mula sa hypertrophic at proliferative zone ng buto ng 16-araw na fetus ng mouse na may mga piraso ng tisyu ng utak. Pagkatapos ng 4 na araw ng paglilinang, ang transdifferentiation ng chondrocytes sa mga osteoblast at ang simula ng pagbuo ng osteoid ay naobserbahan. Pagkatapos ng 11 araw ng paglilinang, ang bahagi ng kartilago ay pinalitan ng tissue ng buto at ang bone matrix ay bahagyang na-calcified. Ang ilang mga neuropeptides at neurotransmitter na ginawa ng tisyu ng utak ay nakakaapekto sa metabolismo ng mga osteoblast o may mga receptor para sa kanila. Kabilang sa mga ito ay norepinephrine, vasoactive intestinal peptide, calcitonin gene-related peptide, substance P at somatostatin. Ang mga piraso ng tisyu ng utak na nilinang kasama ng mga chondrocytes ay maaaring makabuo ng ilan sa mga nakalistang salik na may kakayahang mag-udyok sa proseso ng transdifferentiation ng mga chondrocytes sa mga osteoblast.

[ 28 ], [ 29 ], [ 30 ], [ 31 ], [ 32 ], [ 33 ]

Ang impluwensya ng panlabas na mga kadahilanan sa kultura ng chondrocyte

Ang impluwensya ng pag-igting ng oxygen sa metabolismo ng chondrocyte

Sa karamihan ng mga kaso, ang mga kultura ng chondrocyte ay bubuo sa ilalim ng mga kondisyon ng atmospheric oxygen tension. Gayunpaman, kilalang-kilala na sa vivo chondrocytes ay umiiral sa ilalim ng mga kondisyon ng hypoxic at ang pag-igting ng oxygen ay nag-iiba sa ilalim ng iba't ibang mga kondisyon ng pathological. Sa panahon ng proseso ng pagkahinog, ang mga makabuluhang pagbabago sa suplay ng dugo sa mga epiphyses ay sinusunod. Dahil nag-iiba ang vascularization sa iba't ibang mga zone ng growth plate, nag-iiba din ang oxygen tension sa kanila. Ipinakita ni C. Brighton at R. Heppenstall (1971) na sa tibial plate ng mga kuneho, ang tensyon ng oxygen sa hypertrophic zone ay mas mababa kaysa sa nakapalibot na kartilago. Ang mga sukat ng ilang mga metabolic parameter ay nagpakita na ang mga chondrocytes ay mabilis na tumugon sa mga lokal na pagbabago sa konsentrasyon ng oxygen. Una sa lahat, sa mababang pag-igting ng oxygen, ang pagkonsumo nito ng mga chondrocytes ay bumababa. Sa isang pagbawas sa pag-igting ng oxygen mula 21 hanggang 0.04%, tumataas ang paggamit ng glucose, ang aktibidad ng glycolytic enzymes at ang synthesis ng lactic acid ay tumaas. Kahit na sa mababang pag-igting ng oxygen, ang ganap na dami ng ATP, ADP at AMP ay nananatiling stable. Ang mga datos na ito ay nagpapahiwatig na ang metabolismo ng chondrocyte ay naglalayong sa pinakamataas na konserbasyon ng enerhiya. Gayunpaman, ang sintetikong aktibidad, at samakatuwid ang mga proseso ng reparasyon, ay nagbabago sa ilalim ng mga kondisyon ng hypoxic.

Ang mataas na pag-igting ng oxygen ay nakakaapekto rin sa metabolismo ng chondrocyte, na nagiging sanhi ng pagbaba sa proteoglycan at synthesis ng DNA at pagkasira ng cartilage matrix. Ang mga epektong ito ay kadalasang sinasamahan ng paggawa ng mga libreng radikal na oxygen.

Ang impluwensya ng konsentrasyon ng ion at osmotic pressure ng kapaligiran sa pag-andar ng chondrocyte

Sa katutubong kartilago, ang konsentrasyon ng mga ions ay makabuluhang naiiba mula sa iba pang mga tisyu: ang nilalaman ng sodium sa extracellular medium ay 250-350 mmol, at ang osmolarity nito ay 350-450 mosmol. Kapag ang mga chondrocytes ay nahiwalay sa ECM at na-incubate sa karaniwang media (DMEM (Dulbecco's Minimal Essential Medium), ang osmolarity ay 250-280.7 mosmol), ang kapaligiran na nakapalibot sa mga cell ay nagbabago nang malaki. Bilang karagdagan, ang konsentrasyon ng calcium at potassium sa karaniwang media ay makabuluhang mas mababa kaysa sa katutubong tissue, at ang konsentrasyon ng mga anion ay makabuluhang mas mataas.

Ang pagdaragdag ng sucrose sa medium ay nagpapataas ng osmolarity nito at naghihikayat ng lumilipas na intracellular na pagtaas sa konsentrasyon ng H ⁺ at calcium anion sa cytosol. Ang ganitong mga pagbabago sa intracellular ay maaaring makaapekto sa mga proseso ng pagkita ng kaibahan ng chondrocyte at ang kanilang metabolic na aktibidad. J. Urban et al. (1993) natagpuan na ang pagsasama ng ³⁵ 8-sulfate at ³ H-proline ng mga nakahiwalay na chondrocytes na incubated sa standard DMEM sa loob ng 2-4 h ay 10% lamang nito sa katutubong tissue. Ang intensity ng synthesis ay umabot sa maximum sa isang osmolarity ng extracellular medium na 350-400 mosmol kapwa sa mga bagong hiwalay na chondrocytes at sa cartilage tissue explants. Bukod dito, ang dami ng chondrocytes ay tumaas ng 30-40% pagkatapos ilagay ang mga nakahiwalay na mga cell sa karaniwang DMEM ng tinukoy na osmolarity. Gayunpaman, kapag ang pag-culture ng mga chondrocytes sa ilalim ng mga kondisyon ng non-physiological osmolarity sa loob ng 12-16 na oras, ang mga cell ay umaangkop sa mga bagong kondisyon, na binabawasan ang intensity ng biosynthesis sa proporsyon sa pagbabago sa osmolarity ng extracellular na kapaligiran.

P. Borgetti et al. (1995) pinag-aralan ang epekto ng extracellular medium osmolarity sa paglaki, morpolohiya, at biosynthesis ng mga pig chondrocytes. Ang mga may-akda ay nagpakita ng magkatulad na biochemical at morphological na mga tampok ng chondrocytes na nilinang sa media na may osmolarity na 0.28 at 0.38 mosmol. Sa isang katamtamang osmolarity na 0.48 mosmol, isang pagbaba sa paglaganap ng cell at synthesis ng protina ay naobserbahan sa unang 4-6 na oras ng paglilinang, ngunit ang mga parameter na ito ay kasunod na nakuhang muli at kalaunan ay umabot sa mga halaga ng kontrol. Kapag ang mga chondrocytes ay nilinang sa isang daluyan na may osmolarity na 0.58 mosmol, ang mga cell ay nawalan ng kakayahang mapanatili ang physiological intensity ng mga proliferative na proseso, at pagkatapos ng 6 na araw ang bilang ng mga chondrocytes ay makabuluhang nabawasan. Sa isang medium osmolarity na 0.58 mosmol, ang malalim na pagsugpo sa synthesis ng protina ay naobserbahan. Bilang karagdagan, kapag nilinang sa media na may osmolarity na 0.28-0.38 mOsm, pinapanatili ng mga chondrocyte ang kanilang physiological phenotype; sa mas mataas na osmolarity (0.48-0.58 mOsm), ang mga makabuluhang pagbabago sa cell morphology ay nangyayari, na kung saan ay ipinahayag sa pamamagitan ng pagkawala ng katangian na phenotype, ang pagbabago ng chondrocytes sa fibroblast-like na mga cell, at ang pagkawala ng kakayahan ng mga cell na mag-ipon ng matrix proteoglycans. Ang mga resulta ng pag-aaral na ito ay nagpapahiwatig ng kakayahan ng mga chondrocytes na tumugon sa limitadong pagbabagu-bago sa osmolarity ng extracellular na kapaligiran.

Ang mga pagbabago sa konsentrasyon ng iba pang mga ions ay maaari ring makaapekto sa mga proseso ng biosynthesis sa chondrocytes. Kaya, ang antas ng ³⁵ S (sulfate) incorporation ay tumataas ng kalahati na may pagtaas sa konsentrasyon ng potassium ions mula 5 mmol (ang konsentrasyon sa karaniwang DM EM medium) hanggang 10 mmol (ang konsentrasyon sa ECM sa vivo). Ang mga konsentrasyon ng calcium sa ibaba 0.5 mmol ay nag-promote ng produksyon ng collagen ng mga mature na bovine chondrocytes, habang ang isang konsentrasyon na 1-2 mmol (naaayon sa konsentrasyon sa karaniwang DM EM medium) ay nagdulot ng makabuluhang pagbaba sa synthesis ng collagen. Ang isang katamtamang pagtaas sa biosynthesis ay naobserbahan sa mataas na antas ng calcium (2-10 mmol). Ang iba't ibang mga kasyon ay nakikilahok sa pagkakabit ng mga chondrocytes sa mga protina ng ECM. Kaya, ang magnesium at manganese ions ay nagbibigay ng attachment sa fibronectin at type II collagen, habang ang mga calcium ions ay hindi nakikilahok sa attachment ng chondrocytes sa mga protina. Kaya, ang mga resulta ng inilarawan na pag-aaral ay nagpapahiwatig ng impluwensya ng mga pagbabago sa extracellular ions ng potassium, sodium, calcium at osmolarity ng medium sa biosynthetic function ng chondrocytes incubated sa standard media.

Epekto ng mekanikal na stress sa metabolismo ng chondrocyte

Ang joint immobilization ay nagdudulot ng reversible cartilage atrophy, na nagpapahiwatig ng pangangailangan para sa mechanical stimuli para sa normal na metabolic process sa ECM. Sa karamihan ng mga kaso, ang mga modelo ng kultura ng cell na ginamit ay umiiral sa ilalim ng normal na presyon ng atmospera. M. Wright et al. (1996) ay nagpakita na ang mekanikal na kapaligiran ay nakakaapekto sa chondrocyte metabolismo, ang cell tugon ay depende sa intensity at dalas ng compressive loading. Ang mga eksperimento sa paglo-load sa mga explant ng buo na articular cartilage sa vitro ay nagpakita ng pagbaba sa synthesis ng mga protina at proteoglycan sa ilalim ng pagkilos ng static na paglo-load, habang pinasisigla ng dynamic na paglo-load ang mga prosesong ito. Ang eksaktong mga mekanismo ng epekto ng mekanikal na pag-load sa cartilage ay kumplikado at malamang na nauugnay sa pagpapapangit ng cell, hydrostatic pressure, osmotic pressure, potensyal na elektrikal at mga pang-ibabaw na cellular receptor para sa mga molekula ng matrix. Upang pag-aralan ang epekto ng bawat isa sa mga parameter na ito, kinakailangan na lumikha ng isang sistema kung saan ang isang parameter ay maaaring ibahin nang nakapag-iisa. Halimbawa, ang kultura ng explant ay hindi angkop para sa pag-aaral ng pagpapapangit ng cell, ngunit maaari itong magamit upang pag-aralan ang pangkalahatang epekto ng presyon sa metabolic na aktibidad ng mga chondrocytes. Ang compression ng cartilage ay humahantong sa cell deformation at sinamahan din ng paglitaw ng hydrostatic pressure gradient, electrical potential, fluid flow, at mga pagbabago sa naturang physicochemical parameters gaya ng water content sa matrix, electrical charge density, at osmotic pressure level. Maaaring pag-aralan ang pagpapapangit ng cell gamit ang mga nakahiwalay na chondrocytes na inilubog sa agarose o collagen gel.

Maraming mga sistema ang binuo upang pag-aralan ang epekto ng mekanikal na pagpapasigla sa kultura ng chondrocyte. Ang ilang mga mananaliksik ay gumagamit ng mga sistema kung saan ang presyon ay inilalapat sa kultura ng cell sa pamamagitan ng gaseous phase. Kaya, JP Veldhuijzen et al. (1979), gamit ang presyon na 13 kPa sa itaas ng atmospera na may mababang dalas (0.3 Hz) sa loob ng 15 min, napansin ang pagtaas sa synthesis ng cAMP at proteoglycans at pagbaba sa synthesis ng DNA. R. Smith et al. (1996) ay nagpakita na ang paulit-ulit na pagkakalantad ng isang kultura ng pangunahing bovine chondrocytes sa hydrostatic pressure (10 MPa) na may dalas na 1 Hz para sa 4 na oras ay nagdulot ng pagtaas sa synthesis ng aggrecan at type II collagen, samantalang ang pare-parehong presyon ay hindi nakakaapekto sa mga prosesong ito. Gamit ang isang katulad na sistema, Wright et al. (1996) iniulat na ang cyclic pressure sa cell culture ay nauugnay sa hyperpolarization ng chondrocyte cell membrane at pag-activate ng Ca ²⁺ -dependent potassium channels. Kaya, ang mga epekto ng cyclic pressure ay pinagsama sa pamamagitan ng stretch-activated ion channels sa chondrocyte membrane. Ang tugon ng mga chondrocytes sa hydrostatic pressure ay depende sa mga kondisyon ng cell culture at ang dalas ng inilapat na load. Kaya, ang cyclic hydrostatic pressure (5 MPa) ay nagpapababa ng sulfate incorporation sa chondrocyte monolayer sa dalas na 0.05, 0.25, at 0.5 Hz, samantalang sa frequency na mas mataas sa 0.5 Hz, ang sulfate incorporation sa cartilage explant ay tumataas.

M. Bushmann et al. (1992) iniulat na ang mga chondrocytes sa agarose gels ay nagbabago ng biosynthesis bilang tugon sa static at dynamic na mekanikal na paglo-load sa parehong paraan tulad ng kulturang buo na organ. Nalaman ng mga may-akda na ang mekanikal na pag-load ay bumubuo ng isang hyperosmotic stimulus na may kasunod na pagbaba sa pH sa mga chondrocytes.

Ang epekto ng mechanical stretching ay maaaring pag-aralan sa isang cell culture na nahuhulog sa isang gel. Ang stretching force ay maaaring malikha gamit ang computer-controlled vacuum. Kapag ang sistema ay nasa ilalim ng isang tiyak na antas ng vacuum, ang ilalim ng Petri dish na may kultura ng cell ay pinalawak ng isang kilalang halaga, ang pagpapapangit ay maximum sa mga gilid ng ilalim ng ulam at pinakamababa sa gitna. Ang kahabaan ay naililipat din sa mga chondrocytes na nilinang sa Petri dish. Gamit ang pamamaraang ito, K. Holm-vall et al. (1995) ay nagpakita na sa mga cell ng chondrosarcoma na nilinang sa isang collagen (uri II) gel, ang pagpapahayag ng mRNA ng isang 2-integrin ay nadagdagan _{. ang isang 2 βintegrin} ay _{may kakayahang} magbigkis sa type II collagen. Ito ay itinuturing na isang mechanoreceptor, dahil nakikipag-ugnayan ito sa mga protina na nagbubuklod ng actin, kaya nagkokonekta sa ECM at sa cytoskeleton.

Ang epekto ng pH sa metabolismo ng chondrocyte

Ang pH ng interstitial fluid ng ECM ng cartilage tissue ay mas acidic kaysa sa ibang mga tissue. Tinukoy ni A. Maroudas (1980) ang pH ng articular cartilage matrix sa 6.9. B. Diamant et al. (1966) natagpuan ang isang pH ng 5.5 sa ilalim ng pathological kondisyon. Ito ay kilala na ang mga chondrocytes ay nabubuhay sa mababang PO2, na nagpapahiwatig ng mahalagang papel ng glycolysis (95% ng lahat ng metabolismo ng glucose) sa metabolismo ng mga selulang ito; Ang glycolysis ay sinamahan ng paggawa ng isang malaking halaga ng lactic acid.

Bilang karagdagan sa pag-aasido ng kapaligiran sa pamamagitan ng mga produkto ng glycolysis, ang mga bahagi ng matrix mismo ay may malaking kahalagahan. Ang malaking halaga ng nakapirming negatibong singil sa mga proteoglycan ay nagbabago sa extracellular ionic na komposisyon: isang mataas na konsentrasyon ng mga libreng cations (hal., H ⁺, Na ⁺, K ⁺ ) at isang mababang konsentrasyon ng mga anion (hal., O2, HCO3 ) ay sinusunod. Bilang karagdagan, sa ilalim ng impluwensya ng mekanikal na pag-load, ang tubig ay pinatalsik mula sa ECM, na humahantong sa isang pagtaas sa konsentrasyon ng mga nakapirming negatibong singil at ang pagkahumaling ng higit pang mga cation sa matrix. Ito ay sinamahan ng isang pagbawas sa pH ng extracellular na kapaligiran, na nakakaapekto sa intracellular pH, at sa gayon ay binabago ang metabolismo ng mga chondrocytes. Pinag-aralan nina R. Wilkin at A. Hall (1995) ang epekto ng pH ng extracellular at intracellular na kapaligiran sa biosynthesis ng matrix ng mga nakahiwalay na bovine chondrocytes. Naobserbahan nila ang dalawahang pagbabago ng matrix synthesis na may pagbaba sa pH. Ang isang bahagyang pagbaba sa pH (7.4ng 35 SO ₄ at ³ H-proline sa chondrocytes, samantalang ang mas malalim na pag-aasido ng medium (pH<7.1) ay humadlang sa synthesis ng 75% kumpara sa kontrol. Ang paglikha ng mababang pH (6.65) gamit ang mga ammonium ions ay nagdulot ng pagbaba ng matrix synthesis ng 20% lamang. Ang mga resulta na nakuha ay nagpapahiwatig na ang pagbabago ng pH ng extracellular medium ng matrix synthesis ay hindi maipaliwanag lamang sa pamamagitan ng mga pagbabago sa pH ng intracellular medium. Bukod dito, ang mga chondrocytes ay may kakayahang mag-regulate ng intracellular pH gamit ang Na ⁺, H ⁺ -exchanger, ang Ka ⁺ -dependent Cl ^_ -НСОС3 -transporter, at H ⁺ /ATPase.

[ 34 ], [ 35 ], [ 36 ], [ 37 ], [ 38 ], [ 39 ], [ 40 ]

Ang impluwensya ng komposisyon ng medium ng kultura sa metabolismo ng mga chondrocytes

Ang daluyan para sa paglilinang ng mga chondrocytes ay dapat na tumutugma sa mga pang-eksperimentong kondisyon. Sa mga nagdaang taon, ang calf serum ay ginamit upang ma-optimize ang mga kondisyon ng pag-culture. Gayunpaman, kapag gumagamit ng serum, ang isang bilang ng mga mahahalagang punto ay dapat isaalang-alang:

• panlabas na paglaki ng mga selula mula sa periphery ng tissue sa mga kultura ng organ,
• pagkakaiba-iba sa komposisyon ng mga serum ng iba't ibang serye,
• ang pagkakaroon ng hindi kilalang mga sangkap sa kanila,
• nadagdagan ang panganib ng pagkagambala at mga artifact kapag pinag-aaralan ang impluwensya ng iba't ibang mga biological na kadahilanan sa metabolic na aktibidad ng mga cell.

Ang isang halimbawa ng huli ay isang pag-aaral ng epekto ng EGF sa cartilage chondrocytes sa mga daga. Pinasigla ng EGF ang pagsasama ng ³ H-thymidine at pagtaas ng nilalaman ng DNA sa kultura. Ang epektong ito ay mas malinaw sa mababang serum na konsentrasyon (<1%), ngunit sa mataas na konsentrasyon (>7.5%) ang epekto ay nawala.

Kilalang-kilala na ang mga antas ng synthesis at degradation sa DMEM na pupunan ng calf serum ay makabuluhang tumaas kumpara sa mga kondisyon ng vivo. Ang mga pagkakaiba sa pagitan ng in vivo at in vitro metabolism ay maaaring dahil sa mga pagkakaiba sa pagitan ng synovial fluid at ng medium kung saan ang mga cell ay na-culture. Lee et al. (1997) nag-kultura ng mga batang bovine chondrocytes sa agarose gamit ang isang nutrient medium na naglalaman ng DMEM na pupunan ng 20% calf serum at isang malaking halaga ng normal na allogeneic synovial fluid. Ang pagkakaroon ng synovial fluid sa medium ay nagdulot ng pagtaas sa dami ng proteoglycans, hanggang 80% ng kabuuang halaga ng synovial fluid. Ang mga resultang ito ay nagpapahiwatig na ang synovial fluid sa kultura ay nag-uudyok ng isang antas ng metabolismo na katulad ng sa vivo, na may mataas na antas ng glycosaminoglycan synthesis at isang mababang antas ng cell division.

G. Verbruggen et al. (1995) ay nagpakita na ang ³⁵ S-arrpeKaHa synthesis ng mga chondrocytes ng tao na nilinang sa agarose sa serum-free DMEM ay 20-30% ng antas ng synthesis na naobserbahan sa DMEM na dinagdagan ng 10% na calf serum. Tinukoy ng mga may-akda ang lawak kung saan naibalik ng IGF-1, IGF-2, TGF-R, o insulin ang produksyon ng aggrecan sa serum-free medium. Napagpasyahan ng mga may-akda na ang 100 ng/ml na insulin, IGF-1, o IGF-2 ay bahagyang naibalik ang aggrecan synthesis sa 39-53% ng antas ng kontrol. Walang synergism o cumulation ang naobserbahan sa kumbinasyon ng mga nakalistang salik. Kasabay nito, ang 10 ng/ml TGF-R sa pagkakaroon ng 100 ng/ml na insulin ay nagpasigla ng aggrecan synthesis sa 90% o higit pa sa antas ng sanggunian. Sa wakas, ang human serum transferrin, nag-iisa o kasama ng insulin, ay hindi nakakaapekto sa aggrecan synthesis. Kapag ang calf serum ay pinalitan ng bovine serum albumin, ang nilalaman ng aggrecan aggregates ay makabuluhang nabawasan. Ang pagpapayaman ng medium ng kultura na may insulin, IGF, o TGF-R ay bahagyang naibalik ang kakayahan ng mga cell na makagawa ng mga pinagsama-samang pinagsama-samang. Bukod dito, ang IGF-1 at insulin ay nakakapagpapanatili ng homeostasis sa mga kultura ng cell. Pagkatapos ng 40 araw ng paglilinang sa isang daluyan na pinayaman ng 10-20 ng/ml IGF-1, ang proteoglycan synthesis ay napanatili sa parehong antas o mas mataas pa kumpara sa daluyan na naglalaman ng 20% calf serum. Ang mga proseso ng catabolic ay nagpatuloy nang mas mabagal sa medium na pinayaman ng IGF-1 kaysa sa medium na pinayaman ng 0.1% na solusyon sa albumin, ngunit medyo mas mabilis sa medium na pinayaman ng 20% na suwero. Sa mahabang buhay na mga kultura, ang 20 ng/ml IGF-1 ay nagpapanatili ng isang matatag na estado ng mga selula.

D. Lee et al. (1993) kumpara sa epekto ng culture medium composition (DMEM, DMEM+20% calf serum, DMEM+20 ng/ml IGF-1) sa DNA synthesis sa isang cartilage tissue explant culture, isang monolayer culture, at sa agarose suspension. Kapag nag-culture sa agarose sa pagkakaroon ng suwero, napansin ng mga may-akda ang isang ugali para sa mga chondrocytes na mag-grupo sa malalaking kumpol. Ang mga cell na nilinang nang walang suwero o may IGF-1 ay nagpapanatili ng isang bilog na hugis sa agarose, na nakolekta sa maliliit na grupo, ngunit hindi bumubuo ng malalaking pinagsama-samang. Sa isang monolayer, ang synthesis ng DNA ay mas mataas sa medium na naglalaman ng serum kaysa sa medium na pinayaman ng IGF-1; Ang synthesis ng DNA sa huli ay mas mataas kaysa sa hindi pinagyaman na daluyan. Walang mga pagkakaiba sa DNA synthesis ang natagpuan kapag ang mga chondrocytes ay na-culture sa agarose suspension sa isang non-enriched medium at sa isang medium na may IGF-1. Kasabay nito, ang pag-culture ng mga chondrocyte suspension sa agarose sa isang serum-enriched medium ay sinamahan ng pagtaas ng pagsasama ng radionucleotide ³ H-thymidine kumpara sa ibang media.

Ang bitamina C ay kinakailangan para sa pag-activate ng mga enzyme na kasangkot sa pagbuo ng isang matatag na helical na istraktura ng collagen fibrils. Ang mga Chondrocyte na kulang sa ascorbic acid ay nag-synthesize ng underhydroxylated non-helical collagen precursors, na dahan-dahang itinago. Ang pangangasiwa ng ascorbic acid (50 μg/ml) ay nagdudulot ng hydroxylation ng collagen type II at IX at ang kanilang pagtatago sa normal na dami. Ang pagdaragdag ng bitamina C ay hindi nakakaapekto sa antas ng synthesis ng proteoglycan. Samakatuwid, ang pagtatago ng collagen ay kinokontrol nang nakapag-iisa sa pagtatago ng proteoglycan.

[ 41 ], [ 42 ], [ 43 ], [ 44 ], [ 45 ], [ 46 ], [ 47 ]