Molecular genetic methods para sa diagnosis ng hereditary diseases

DNA technology pamamaraan ay ginagamit upang matukoy ang mga localization sa isang partikular na chromosome ng mutant gene na responsable para sa pinagmulan ng mga tiyak na mga paraan ng sakit na namamana. Dahil ang gene ay isang DNA segment at gene pagbago - pinsala sa pangunahing istraktura ng DNA (mutation ay nauunawaan ng lahat ng mga pagbabago sa sequence DNA, anuman ang kanilang lokasyon at ang impluwensiya sa mga indibidwal na posibilidad na mabuhay) at pagkatapos ay probing paghahanda ng metaphase pasyente chromosomes minana sakit, posible na magtatag ng lokalisasyon ng pathological gene. Pamamaraan ng molecular genetics upang lumikha ng ang posibilidad ng pag-diagnose na sakit sa isang binago DNA istraktura, pinapayagan nila upang alamin ang mga localization ng minana disorder. Ang mga pamamaraan ng genetic molecular ay maaaring magbunyag ng mga mutation na nauugnay sa kapalit ng kahit na isang base.

Ang pinakamahalagang yugto sa pagkakakilanlan ng isang gene ay ang paghihiwalay nito. Ang DNA ay maaaring ihiwalay mula sa anumang uri ng tisyu at cell na naglalaman ng nuclei. Ang mga hakbang ng DNA paghihiwalay isama ang mabilis na pag-lysis ng mga cell sa pamamagitan ng centrifugation sa pag-alis ng mga fragment ng cellular organelles at membranes, enzymatic pagkawasak ng mga protina at ang kanilang pagkuha mula sa mga solusyon na may penol at kloropormo, DNA konsentrasyon sa pamamagitan ng pag-ulan sa ethanol.

Sa genetic laboratories, ang DNA ay madalas na nakahiwalay sa mga leukocytes ng dugo, kung saan ang pasyente ay kinuha ng 5-20 ml ng venous blood sa isang payat na tubo na may isang anticoagulant solution (heparin). Pagkatapos ay pinaghiwalay at pinoproseso ang mga leukocytes ayon sa mga hakbang na nakabalangkas sa itaas.

Ang susunod na yugto ng paghahanda materyal sa pag-aaral - DNA "cut" sa mga fragment sa mga site na may mahigpit na mga tiyak na pagkakasunod-sunod base ay ginanap sa pamamagitan ng bacterial enzymes - pagbabawal endonucleases (paghihigpit enzymes). Paghihigpit enzymes makilala ang mga partikular na pagkakasunud-sunod ng 4-6, hindi bababa sa 8-12 nucleotides sa dalawang-hiblang DNA Molekyul at ang kanyang pinaghihiwalay sa mga fragment ng mga pagkakasunud-sunod localize site na tinatawag na pagrerenda sites. Bilang produce paghihigpit fragment ng DNA natutukoy sa pamamagitan ng ang dalas ng pangyayari ng paghihigpit site at mga fragment ng laki - ang kalikasan ng ang pamamahagi ng mga site na ito sa kahabaan ng haba ng orihinal na DNA Molekyul. Ang mas madalas ang mga lugar ng paghihigpit ay matatagpuan, ang mas maikli ang mga fragment ng DNA pagkatapos ng paghihigpit. Sa ngayon ay higit sa 500 iba't ibang uri ng mga paghihigpit enzymes ng bacterial pinagmulan, at bawat isa sa mga enzyme ay kumikilala sa kanyang mga tiyak na pagkakasunod-sunod ng nucleotides. Sa hinaharap, ang mga site ng paghihigpit ay maaaring gamitin bilang genetic marker para sa DNA. Ang resultang DNA paghihigpit fragment ay maaaring nakaayos ayon sa haba sa pamamagitan ng electrophoresis sa agarose o polyacrylamide gels, at sa gayon ay maaaring maging determinado ang kanilang molekular timbang. Karaniwan para sa pagtuklas ng DNA sa gel na ginagamit ng mga tiyak na paglamlam (karaniwan ay ethidium bromuro) at pagtingin sa gel sa nakukuha sindihan ang ultraviolet. Ang mga lokasyon ng lokalisasyon ng DNA ay may pulang kulay. Gayunman, ang isang tao sa pagproseso ng ilang mga paghihigpit DNA endonucleases nabuo kaya maraming mga fragment ng mga iba't ibang mga haba na mabigo silang paghiwalayin ng electrophoresis, ito ay hindi posible upang biswal na makilala ang mga indibidwal na DNA fragment na electrophoregram (produce pare-parehong kulay sa buong haba ng gel). Samakatuwid, ang isang pamamaraan ng hybridization na may label na DNA probes ay ginagamit upang matukoy ang nais na mga fragment ng DNA sa gayong gel.

Ang anumang segment ng solong kilu-kilo DNA o RNA ay magagawang upang panagutin (paghaluin) sa kanyang komplimentaryong chain, na may guanine ay palaging nauugnay sa cytosine, adenine sa thymine. Ito ang pagbuo ng isang double-stranded molecule. Kung ang isang solong-stranded kopya ng cloned gene ay may label na may radioactive label, isang probe ay makuha. Ang probe ay makakahanap ng isang komplimentaryong bahagi ng DNA, na kung saan ay madaling nakilala sa pamamagitan ng radioautography. Ang isang radioactive probe idinagdag sa isang bawal na gamot ng mga naka-stretch chromosomes ay nagbibigay-daan sa gene na mailalok sa isang tiyak na chromosome: ang ilang mga sample ng DNA ay maaaring makilala sa isang DNA probe sa Southern blotting. Ang hybridization ay nangyayari kung ang bahagi ng pagsubok ng DNA ay naglalaman ng isang normal na gene. Sa kaso kung saan may isang abnormal pagkakasunod-sunod ng nucleotides, hal kaukulang chromosome istruktura naglalaman ng isang mutant gene, paghahalo ng lahi ay hindi mangyayari, na kung saan ay nagbibigay-daan upang matukoy localization ng abnormal gene.

Upang makuha ang mga probes ng DNA, ginagamit ang paraan ng pag-clone ng gene. Ang kakanyahan ng ang paraan ay binubuo sa na ang DNA fragment naaayon sa anumang gene o rehiyon ng gene ipinasok sa cloning maliit na butil, karaniwan ay isang bacterial plasmid (pabilog ekstrakromosomal DNA naroroon sa bacterial cell at nagdadala ng paglaban gene sa mga antibiotic), at pagkatapos ay ang mga bakterya pagkakaroon ng isang plasmid na may built-in na gene ng tao, ay pinarami. Dahil sa proseso ng synthesis ito ay posible upang makuha ang plasmid bilyun-bilyong kopya ng pantao gene o bahagi nito.

Dagdag dito, ang mga kopya ng DNA na may label na radioactive label o fluorochromes ay ginagamit bilang mga probes upang maghanap ng mga komplementaryong pagkakasunud-sunod sa hanay ng mga molecule ng DNA na pinag-aralan.

Sa kasalukuyan, maraming mga paraan ng paggamit ng DNA probes para sa diagnosis ng mutation ng gene.

[1], [2], [3], [4], [5], [6], [7],