Molecular genetic na pamamaraan para sa pag-diagnose ng mga namamana na sakit

Ang mga pamamaraan ng teknolohiya ng DNA ay ginagamit upang matukoy ang lokalisasyon ng isang mutant gene sa isang partikular na chromosome, na responsable para sa pinagmulan ng ilang mga anyo ng namamana na patolohiya. Dahil ang isang gene ay isang seksyon ng DNA, at ang isang gene mutation ay pinsala sa pangunahing istraktura ng DNA (ang mutation ay nauunawaan bilang lahat ng mga pagbabago sa pagkakasunud-sunod ng DNA, anuman ang kanilang lokalisasyon at epekto sa posibilidad ng isang indibidwal), kung gayon, sa pamamagitan ng pagsusuri sa mga paghahanda ng metaphase chromosome ng isang pasyente na may namamana na sakit, posible na maitaguyod ang lokalisasyon ng pathological gene. Ang mga molecular genetic na pamamaraan ay lumikha ng mga pagkakataon para sa pag-diagnose ng mga sakit sa antas ng binagong istraktura ng DNA, pinapayagan nila kaming matukoy ang lokalisasyon ng mga namamana na karamdaman. Ang mga molecular genetic na pamamaraan ay maaaring makilala ang mga mutasyon na nauugnay sa pagpapalit ng kahit isang solong base.

Ang pinakamahalagang yugto ng pagkilala sa gene ay ang paghihiwalay nito. Ang DNA ay maaaring ihiwalay sa anumang uri ng tissue at mga cell na naglalaman ng nuclei. Ang mga yugto ng paghihiwalay ng DNA ay kinabibilangan ng: mabilis na lysis ng mga selula, pag-alis ng mga fragment ng cellular organelles at lamad sa pamamagitan ng sentrifugasyon, enzymatic na pagkasira ng mga protina at ang kanilang pagkuha mula sa solusyon gamit ang phenol at chloroform, konsentrasyon ng mga molekula ng DNA sa pamamagitan ng pag-ulan sa ethanol.

Sa mga genetic laboratories, ang DNA ay madalas na nakahiwalay sa mga leukocytes ng dugo, kung saan ang 5-20 ml ng venous blood ay kinuha mula sa pasyente sa isang sterile test tube na may isang anticoagulant solution (heparin). Pagkatapos ang mga leukocytes ay pinaghihiwalay at pinoproseso ayon sa mga hakbang sa itaas.

Ang susunod na yugto ng paghahanda ng materyal para sa pananaliksik ay "pagputol" ng DNA sa mga fragment sa mga lugar na may mahigpit na tiyak na pagkakasunud-sunod ng base, na isinasagawa gamit ang mga bacterial enzymes - restriction endonucleases (restriction enzymes). Kinikilala ng mga restriction enzyme ang mga partikular na sequence ng 4-6, mas madalas na 8-12 nucleotides sa isang double-stranded na molekula ng DNA at hinahati ito sa mga fragment sa mga lokasyon ng mga sequence na ito, na tinatawag na restriction site. Ang bilang ng mga nagreresultang mga fragment ng paghihigpit ng DNA ay tinutukoy ng dalas ng paglitaw ng mga site ng paghihigpit, at ang laki ng mga fragment ay tinutukoy ng likas na katangian ng pamamahagi ng mga site na ito kasama ang haba ng orihinal na molekula ng DNA. Kung mas madalas matatagpuan ang mga lugar ng paghihigpit, mas maikli ang mga fragment ng DNA pagkatapos ng paghihigpit. Sa kasalukuyan, higit sa 500 iba't ibang uri ng restriction enzymes ng bacterial origin ang kilala, at bawat isa sa mga enzyme na ito ay kinikilala ang sarili nitong partikular na nucleotide sequence. Sa hinaharap, ang mga lugar ng paghihigpit ay maaaring gamitin bilang mga genetic marker ng DNA. Ang mga fragment ng DNA na nabuo bilang isang resulta ng paghihigpit ay maaaring i-order ayon sa haba sa pamamagitan ng electrophoresis sa isang agarose o polyacrylamide gel, at sa gayon ay matukoy ang kanilang molekular na timbang. Karaniwan, ang DNA sa isang gel ay nakikilala sa pamamagitan ng partikular na paglamlam (karaniwan ay ethidium bromide) at pagtingin sa gel sa ipinadalang ultraviolet light. Ang mga site ng lokalisasyon ng DNA ay may kulay na pula. Gayunpaman, sa mga tao, kapag ang DNA ay naproseso ng ilang mga paghihigpit na enzyme, napakaraming mga fragment ng iba't ibang haba ang nabuo na hindi sila maaaring paghiwalayin ng electrophoresis, ibig sabihin, hindi posible na makita ang mga indibidwal na mga fragment ng DNA sa electrophoresis (nakakuha ang unipormeng paglamlam sa buong haba ng gel). Samakatuwid, upang matukoy ang nais na mga fragment ng DNA sa naturang gel, ang paraan ng hybridization na may label na DNA probes ay ginagamit.

Anumang single-stranded na segment ng DNA o RNA ay may kakayahang mag-binding (hybridizing) na may complementary strand, na may guanine na laging nagbubuklod sa cytosine, at adenine sa thymine. Ito ay kung paano nabuo ang isang double-stranded molecule. Kung ang isang solong-stranded na kopya ng isang na-clone na gene ay may label na radioactive na label, isang probe ang makukuha. Ang probe ay may kakayahang makahanap ng isang pantulong na segment ng DNA, na pagkatapos ay madaling matukoy gamit ang autoradiography. Ang isang radioactive probe na idinagdag sa isang paghahanda ng mga stretched chromosome ay nagbibigay-daan sa gene na ma-localize sa isang partikular na chromosome: gamit ang isang DNA probe, maaaring matukoy ang mga partikular na lugar sa panahon ng Southern blotting. Nagaganap ang hybridization kung ang seksyon ng DNA na sinusuri ay naglalaman ng isang normal na gene. Sa kaso kung saan ang isang abnormal na pagkakasunud-sunod ng nucleotide ay naroroon, ibig sabihin, ang kaukulang mga istruktura ng chromosome ay naglalaman ng isang mutant gene, hindi magaganap ang hybridization, na nagpapahintulot sa lokalisasyon ng pathological gene na matukoy.

Para makakuha ng DNA probes, ginagamit ang gene cloning method. Ang kakanyahan ng pamamaraan ay ang isang fragment ng DNA na tumutugma sa isang gene o isang seksyon ng isang gene ay ipinasok sa isang cloning particle, karaniwang isang bacterial plasmid (annular extrachromosomal DNA na nasa bacterial cells at nagdadala ng antibiotic resistance genes), at pagkatapos ay ang bacteria na may plasmid na may nakapasok na gene ng tao ay pinarami. Salamat sa mga proseso ng synthesis sa plasmid, bilyun-bilyong kopya ng gene ng tao o seksyon nito ang maaaring makuha.

Ang mga resultang kopya ng DNA, na may label na radioactive na label o fluorochromes, ay ginagamit bilang mga probe upang maghanap ng mga pantulong na pagkakasunud-sunod sa mga pinag-aralan na pool ng mga molekula ng DNA.

Sa kasalukuyan, mayroong maraming iba't ibang uri ng mga pamamaraan gamit ang DNA probes upang masuri ang mga mutation ng gene.

[ 1 ], [ 2 ], [ 3 ], [ 4 ], [ 5 ], [ 6 ], [ 7 ]