Hematopoietic stem cells mula sa dugo ng pusod

Ang dugo ng umbilical cord ay isang magandang pinagmumulan ng mga hematopoietic stem cell sa mga tuntunin ng potensyal na proliferative at repopulation na kakayahan ng mga hematopoietic cells. Ito ay paulit-ulit na ipinakita na sa oras ng kapanganakan, ang pusod ng dugo ay naglalaman ng isang sapat na malaking bilang ng mga mahina na nakatuon na hematopoietic progenitor cells. Naniniwala ang ilang mga may-akda na ang bentahe ng cord blood hematopoietic stem cell transplantation ay ang kakulangan ng pangangailangan na maghanap ng donor na tugma sa HLA antigens. Sa kanilang opinyon, ang pagiging immaturity ng immune system ng bagong panganak ay nagdudulot ng pagbawas sa functional activity ng immunocompetent cells at, nang naaayon, mas mababang saklaw ng malubhang graft-versus-host disease kaysa sa bone marrow transplantation. Kasabay nito, ang survival rate ng isang cord blood cell transplant ay hindi mas mababa kaysa sa bone marrow cells, kahit na sa kaso ng paggamit ng mas maliit na bilang ng mga HSC na ibinibigay sa bawat 1 kg ng timbang ng katawan ng pasyente. Gayunpaman, sa aming opinyon, ang mga isyu ng pinakamainam na bilang ng mga transplanted cord blood cell na kinakailangan para sa epektibong pagkakalagay sa katawan ng tatanggap, ang kanilang immunological compatibility, at ilang iba pang aspeto ng problema ng paglipat ng cord blood hematopoietic stem cell ay nangangailangan ng mas seryosong pagsusuri.

[ 1 ], [ 2 ], [ 3 ], [ 4 ], [ 5 ], [ 6 ]

Pagkuha ng mga hematopoietic stem cell mula sa dugo ng umbilical cord

Ang pamamaraan para sa pagkuha ng hematopoietic stem cell mula sa pusod ng dugo ay nangangailangan ng koleksyon nito kaagad pagkatapos ng kapanganakan ng bata at ang paghihiwalay nito sa inunan kapag ang inunan ay nasa utero o ex utero, gayundin sa panahon ng cesarean section, ngunit din sa ex utero. Ipinakita na kung ang oras mula sa sandali ng kapanganakan hanggang sa paghihiwalay ng bagong panganak mula sa inunan ay nabawasan sa 30 segundo, ang dami ng dugong umbilical cord na nakuha ay tataas ng average na 25-40 ml. Kung ang pamamaraang ito ay gagawin sa ibang pagkakataon, ang parehong dami ng dugo ay mawawala. Ito ay itinatag na ang maagang paghihiwalay ng bata mula sa inunan ay hindi nangangailangan ng anumang negatibong kahihinatnan para sa bagong panganak.

Ang Russian Research Institute of Hematology and Transfusiology ay nakabuo ng epektibo at murang mga teknolohiya para sa pagkuha ng umbilical cord blood sa panahon ng normal na panganganak ((70.2+25.8) ml) at cesarean section ((73.4+25.1) ml). Ang isang paraan para sa paghihiwalay ng dugo ng pusod na may sapat na mataas na ani ng mga nucleated at mononuclear cells ay iminungkahi - (83.1+9.6) at (83.4+14.1)%, ayon sa pagkakabanggit. Ang isang paraan para sa cryopserving ng umbilical cord blood ay napabuti, na nagsisiguro ng mataas na pangangalaga ng mononuclear cells at CFU-GM - (96.8+5.7) at (89.6+22.6)%, ayon sa pagkakabanggit. Natukoy ang kahusayan ng paraan ng pagpapatuyo para sa pagkolekta ng dugo ng umbilical cord gamit ang lalagyan ng Kompoplast-300 (Russia). Ang mga may-akda ay nangolekta ng dugo ng pusod kaagad pagkatapos ng kapanganakan ng bata at ang paghihiwalay nito mula sa inunan, sa mga kondisyon ng paglalagay ng inunan sa utero o ex utero. Bago ang pagbutas ng pusod, ang pusod ay ginagamot nang isang beses na may 5% na tincture ng yodo, at pagkatapos ay dalawang beses na may 70% na ethyl alcohol. Kusang dumaloy ang dugo sa mga connecting tubes papunta sa lalagyan. Ang pamamaraan ng pagkolekta ay tumagal ng hindi hihigit sa 10 minuto. Ang average na dami ng 66 cord blood samples na nakolekta sa pamamagitan ng drainage ay (72+28) ml, at ang bilang ng mga leukocytes sa average na kabuuang sample volume ay (1.1+0.6) x 107. Kapag sinusuri ang cord blood para sa sterility (bacterial contamination, HIV-1, hepatitis B at C viruses, syphilis at cytomeGlorus virus na natukoy lamang ang isang sample na impeksyon sa hepatitis Cgalovirus). Sa isa pang pag-aaral, ang inunan ay inilagay sa ibabaw ng pangsanggol sa isang espesyal na frame kaagad pagkatapos ng kapanganakan, ang pusod ay ginagamot ng 5% na solusyon sa yodo at 75% na ethyl alcohol. Ang umbilical vein ay pinatuyo gamit ang isang karayom mula sa isang transfusion system (G16). Kusang umagos ang dugo sa lalagyan. Ang average na dami ng dugo na nakolekta sa ganitong paraan ay (55+25) ml. Sa gawa ni G. Kogler et al. (1996), ang dugo ng pusod ay nakolekta gamit ang isang saradong paraan at ang malalaking volume ng dugo ay nakuha - sa average (79+26) ml. Napansin ng mga may-akda na sa 574 na sample ng dugo ng umbilical cord, humigit-kumulang 7% ang naglalaman ng mas mababa sa 40 ML ng dugo, na hindi pinapayagan ang mga ito na gamitin para sa paglipat. K. Isoyama et al. (1996), ang pagkolekta ng dugo ng kurdon sa pamamagitan ng aktibong pagbubuhos gamit ang mga hiringgilya, ay nakakuha ng average na 69.1 ml ng dugo (ang dami ng dugo ng pusod ay nag-iiba mula 15 hanggang 135 ml). Sa wakas, A. Abdel-Mageed PI et al. (1997) ay nakakuha ng average na 94 ml ng umbilical cord blood (mula 56 hanggang 143 ml) sa pamamagitan ng catheterization ng umbilical vein.

Upang mabawasan ang panganib ng impeksyon sa iatrogenic at kontaminasyon sa mga pagtatago ng ina, binuo ang isang closed blood collection system batay sa malawakang ginagamit na transfusion system ng Baxter Healthcare Corp., Deerfield, IL (USA), na naglalaman ng 62.5 ml ng CPDA (citrate-phosphate-dextrose na may adenine) bilang isang anticoagulant. Ang teknolohiya para sa pagkuha ng materyal ay ang pangunahing kahalagahan para sa paghahanda ng isang mataas na kalidad na sample sa mga tuntunin ng dami, nilalaman, at kadalisayan ng suspensyon ng cell. Sa mga umiiral na pamamaraan para sa pagkolekta ng umbilical cord blood, na kung saan ay conventionally inuri sa closed, semi-open, at open system, ang kagustuhan ay dapat ibigay sa una, dahil ang closed system ay makabuluhang binabawasan ang panganib ng microbial contamination ng materyal, pati na rin ang kontaminasyon ng cell suspension sa maternal cells.

A. Nagler et al. (1998) ay nagsagawa ng isang comparative analysis ng kahusayan ng lahat ng tatlong mga sistema para sa pagkolekta ng pusod ng dugo. Sa unang variant, ang pamamaraan ay isinasagawa sa isang saradong sistema sa pamamagitan ng pag-exfoliating ng dugo nang direkta sa isang lalagyan. Sa pangalawang variant, ang dugo ng kurdon ay nakuha sa pamamagitan ng aktibong pagbuga ng dugo na may MP1 syringe na sinundan ng pag-flush ng mga ugat ng inunan at sabay-sabay na pagpapatuyo ng dugo sa isang lalagyan (bukas na paraan). Sa ikatlong variant, ang dugo ay nakolekta sa isang semi-open system sa pamamagitan ng aktibong pagkuha nito gamit ang mga syringe at pag-flush nito sa umbilical artery na may sabay-sabay na pagbubuhos sa isang lalagyan. Sa unang variant, ang mga may-akda ay nakakuha ng umbilical cord blood sa dami ng (76.4+32.1) ml na may leukocyte content na (10.5+3.6) x 10 ⁶ sa 1 ml ng dugo. Sa pangalawang variant, ang mga kaukulang indicator ay (174.4+42.8) ml at (8.8+3.4) x 10 ⁶ /ml; sa pangatlo - (173.7+41.3) ml at (9.3+3.8) x 10 ⁶ /ml. Ang pinaka-madalas na impeksyon ng mga sample ng dugo ng pusod ay naobserbahan kapag gumagamit ng isang bukas na sistema. Ang isang direktang ugnayan ay itinatag sa pagitan ng masa ng inunan at ang dami ng dugo na nakuha - na may pagtaas sa masa ng inunan, ang dami ng dugo na nakolekta ay tumataas.

Pagkatapos ng koleksyon ng dugo ng kurdon, ang yugto ng paghihiwalay ay sumusunod - paghihiwalay ng mga mononuclear cell at paglilinis ng suspensyon ng cell mula sa mga erythrocytes. Sa mga pang-eksperimentong kondisyon, ang mga nucleated na selula ay ibinukod sa pamamagitan ng sedimentation na may methylcellulose sa panahon ng lysis ng mga erythrocytes na may ammonium chloride. Gayunpaman, ang methylcellulose ay hindi dapat gamitin para sa mga klinikal na layunin, dahil ang pagkawala ng mga hematopoietic stem cell dito ay umabot sa 50-90%. Ang lysis ng mga erythrocytes ay halos hindi rin gumanap sa klinika dahil sa malalaking volume ng gumaganang solusyon, kahit na ang porsyento ng paghihiwalay ng mga nucleated na cell na may CD34+ phenotype, pati na rin ang mga progenitor cells na may CFU-GM at CFU-GEMM function sa paraang ito ay makabuluhang mas mataas. Ang paglitaw ng isang bagong paraan para sa paghihiwalay ng mga mononuclear cell sa isang density gradient, buyant density solution (BDS72), ay iniulat. Ang sangkap na ito ay may mga sumusunod na physiological parameter: pH - 7.4, osmolality - 280 mOsm/kg, density - 1.0720 g/ml. Ayon sa mga may-akda, maaari itong magamit upang ihiwalay ang hanggang sa 100% ng mga cell na positibo sa CD34 at alisin ang 98% ng mga erythrocytes. Gayunpaman, ang BDS72 ay hindi pa ginagamit sa klinika.

Sa mga aprubadong pamamaraan ng paghihiwalay ng mga nucleated na selula mula sa dugo ng pusod, karaniwang ginagamit ang 10% hydroxyethyl starch solution o 3% gelatin solution. Ang kahusayan ng sedimentation ng mga erythrocytes at paghihiwalay ng mga nucleated na selula sa parehong mga kaso ay humigit-kumulang pantay. Gayunpaman, kapag ginamit ang gelatin bilang ahente ng sedimentation, posibleng makakuha ng bahagyang mas malaking halaga ng CFU-GM kaysa sa paggamit ng hydroxyethyl starch. Ipinapalagay na ang mga pagkakaiba sa kahusayan ng paghihiwalay ng CFU-GM ay dahil sa iba't ibang mga rate ng sedimentation ng mga indibidwal na praksyon ng mga nucleated na selula o ang kakayahan ng mga molekula ng hydroxyethyl starch na masipsip sa ibabaw ng mga hematopoietic cell receptor at sa gayon ay hinaharangan ang kanilang sensitivity sa colony-stimulating factor na ginagamit sa paglilinang ng CFU-GM in vitro. Gayunpaman, ang parehong mga sedimentator ay maaaring maging angkop para sa paghihiwalay ng mga nucleated na selula kapag lumilikha ng malakihang mga cord blood bank.

Ang mga paraan ng paghihiwalay ng dugo ng kurdon at cryopreservation ay karaniwang walang pinagkaiba sa mga ginagamit sa trabaho sa mga hematopoietic stem cell ng peripheral blood at bone marrow ng mga adult na donor. Ngunit kapag naghahanda ng isang malaking bilang ng mga sample ng dugo ng kurdon para sa mga bangko nito, ang mga paraan ng paghihiwalay ay dapat, una sa lahat, ay mura. Samakatuwid, sa kasamaang-palad, sa kasalukuyan, para sa mga klinikal na pangangailangan, nasubok na ang mga nakagawiang pamamaraan ng paghihiwalay at pag-iingat ng mga selula ng dugo ng kurdon ay ginagamit, at mas epektibo, ngunit ang mga mamahaling pamamaraan ay nananatiling maraming mga eksperimento.

Sa pangkalahatan, ang pamantayan para sa pagtatasa ng bilang ng mga hematopoietic na selula at mga kinakailangan para sa pagsusuri ng mga sample ng dugo ng kurdon upang makilala ang mga nakakahawang ahente ay naaprubahan. Upang matiyak ang kaligtasan ng cord blood hematopoietic cell transplantation, ang lahat ng mga sample ng dugo ay dapat na masuri lalo na para sa hematogenously transmitted infections at genetic disease. Ang ilang mga may-akda ay nagrerekomenda ng mga karagdagang espesyal na pamamaraan para sa pagsusuri ng dugo ng kurdon upang masuri ang mga genetic na sakit tulad ng a-thalassemia, sickle cell anemia, kakulangan sa adenosine deaminase, Bruton's agammaglobulinemia, Hurler's at Ponter's disease.

Ayon sa mga rekomendasyon ni L. Ticheli at mga kapwa may-akda (1998), ang bawat sample ng dugo ng kurdon ay dapat na masuri para sa mga nucleated na selula, mga selulang positibo sa CD34, at CFU-GM, ang pag-type ng HLA ay dapat isagawa, at ang pangkat ng dugo ay dapat matukoy ayon sa ABO at sa Rh factor nito. Bilang karagdagan, ang bacteriological culture, serological testing para sa HIV at cytomegalovirus infection, HBsAg, viral hepatitis C, HTLY-I at HTLV-II (human T-cell leukemia), syphilis, at toxoplasmosis ay dapat isagawa. Ang polymerase chain reaction para sa cytomegalovirus at impeksyon sa HIV ay sapilitan.

Ang pamamaraan para sa pagkuha ng dugo ng kurdon ay dapat na isagawa sa mahigpit na alinsunod sa mga prinsipyo ng medikal na bioethics. Bago ang pagkolekta ng dugo, kinakailangan upang makakuha ng pahintulot ng buntis na babae upang isakatuparan ito. Ang isang paunang pag-uusap sa buntis na babae upang makakuha ng kaalamang pahintulot para sa lahat ng mga manipulasyon, mula sa pagbubuhos ng dugo hanggang sa pagpuno ng dokumentasyon, ay isinasagawa lamang ng mga medikal na manggagawa. Sa anumang kaso ay pinahihintulutan para sa alinman sa mga pamamaraang ito na isagawa ng mga tauhan na may biyolohikal, kemikal, parmasyutiko o iba pang hindi medikal na edukasyon, dahil sa paglabag sa itinatag na mga pamantayan ng bioethics at karapatang pantao. Sa kaso ng mga positibong pagsusuri para sa karwahe ng HBsAg, ang pagkakaroon ng mga antibodies sa mga pathogen ng hepatitis C, impeksyon sa HIV at syphilis, ang dugo ng kurdon ay hindi kinokolekta, at ang mga sample ng nakolektang dugo ay tinatanggihan at nawasak. Dapat pansinin na ang pagdadala ng mga nakatagong impeksyon sa mga bagong silang ay mas karaniwan kaysa sa mga may sapat na gulang, samakatuwid, ang posibilidad ng paglipat ng hematogenous at pag-unlad ng mga nakakahawang komplikasyon sa panahon ng mga pagbubuhos ng mga selulang hematopoietic ng dugo ng kurdon ay makabuluhang mas mababa kaysa sa kaso ng paggamit ng adult donor bone marrow para sa paglipat.

Ang isang mahalagang aspeto ng klinikal na paggamit ng dugo ng kurdon ay pagsusuri ng transplant, na batay sa pagtukoy sa dami ng mga hematopoietic stem cell sa isang sample ng dugo ng kurdon at ang mga dosis ng mga cell na kinakailangan para sa paglipat. Sa kasalukuyan, ang mga pamantayan para sa pinakamainam na dami ng mga selula ng dugo ng kurdon na kinakailangan para sa paglipat ay hindi pa nabuo. Walang pangkalahatang tinatanggap na pananaw kahit na sa mga nakagawiang parameter gaya ng bilang ng CD34-positibong mga cell at CFU-GM. Sinusuri ng ilang mga may-akda ang potensyal ng mga hematopoietic na selula sa pamamagitan ng pagsusuri sa mga pangmatagalang kultura na may pagpapasiya ng nilalaman ng mga yunit na bumubuo ng kolonya na karaniwan sa mga granulocytes, erythrocytes, monocytes at megakaryocytes - CFU-GEMM.

Gayunpaman, sa isang klinikal na setting, ang karaniwang pagsusuri ng isang cord blood transplant ay karaniwang nagsasangkot lamang ng pagtukoy sa bilang ng mga nucleated o mononuclear na mga cell.

Pag-iimbak ng dugo ng cord hematopoietic stem cell

Mayroon ding ilang mga problema sa teknolohiya ng pag-iimbak ng mga hematopoietic na selula ng dugo ng pusod. Kapag nag-iingat ng mga hematopoietic stem cell, upang makamit ang pinakamainam na mode ng pagyeyelo, kinakailangan na bawasan ang dami ng dugo ng pusod hangga't maaari, pati na rin ang pag-alis ng mga erythrocytes nang maaga upang maiwasan ang hemolysis at ang panganib ng pagbuo ng isang hindi pagkakatugma na reaksyon para sa mga erythrocyte antigens (ABO, Rh). Ang iba't ibang paraan ng paghihiwalay ng mga nucleated na selula ay angkop para sa mga layuning ito. Noong unang bahagi ng 90s ng huling siglo, ang pinakakaraniwang ginagamit na paraan ay ang paghiwalay ng mga nucleated na selula sa isang density gradient batay sa Ficoll na may density na 1.077 g / ml o Percoll na may density na 1.080 g / ml. Ang paghihiwalay ng umbilical cord blood sa isang density gradient ay nagbibigay-daan para sa paghihiwalay ng nakararami na mga mononuclear cells, ngunit humahantong sa makabuluhang pagkalugi ng hematopoietic progenitor cells - hanggang sa 30-50%.

Ang kahusayan ng sedimentation ng hydroxyethyl starch sa proseso ng paghihiwalay ng mga selulang hematopoietic ng dugo ng kurdon ay naiiba ang pagtatasa. Ang ilang mga may-akda ay tumutukoy sa mababang kalidad ng paghihiwalay gamit ang pamamaraang ito, habang ang iba pang mga mananaliksik, sa kabaligtaran, sa lahat ng posibleng mga pamamaraan, ay nagbibigay ng kagustuhan sa paghihiwalay ng cord blood HSC gamit ang isang 6% hydroxyethyl starch solution. Kasabay nito, ang mataas na kahusayan ng hematopoietic cell sedimentation ay binibigyang diin, na, ayon sa ilang data, umabot mula 84% hanggang 90%.

Ang mga tagapagtaguyod ng ibang pananaw ay naniniwala na halos lahat ng mga paraan ng fractionation ay nauugnay sa malaking pagkalugi ng mga nucleated na selula at nagmumungkahi na magsagawa ng paghihiwalay sa pamamagitan ng centrifugation, na naghahati sa pusod ng dugo sa 3 fraction: erythrocytes, leukocyte ring at plasma. Sa pamamagitan ng paghihiwalay ng mga cell sa ganitong paraan, natuklasan ng mga may-akda na ang nilalaman ng mga mononuclear cells, maagang hematopoietic progenitor cells at mga cell na may CD34+ immunophenotype sa huli ay umabot sa 90, 88 at 100% ng paunang antas, ayon sa pagkakabanggit. Ang mga katulad na halaga para sa pagtaas ng mga selula ng dugo ng kurdon na nalinis ng pamamaraang ito ay nakuha din ng iba pang mga mananaliksik: pagkatapos ng sedimentation, 92% ng mga nucleated na selula, 98% ng mga selulang mononuklear, 96% ng mga selulang positibo sa CD34 at 106% ng mga yunit na bumubuo ng kolonya ay nakahiwalay.

Noong huling bahagi ng 1990s, malawakang ginagamit ang gulaman bilang ahente ng sedimentation. Sa klinikal na kasanayan, ang gelatin ay ginagamit upang ihiwalay ang mga hematopoietic stem cell mula sa pusod ng dugo mula noong 1994. Kapag gumagamit ng 3% gelatin solution, ang kahusayan ng paghihiwalay ng mga nucleated na selula ay umabot sa 88-94%. Ang malakihang paggamit ng gelatin sa paglikha ng isang cord blood bank ay nakumpirma ang mga pakinabang nito sa iba pang mga ahente ng sedimentation. Ang isang paghahambing na pagsusuri ng kahusayan ng lahat ng mga pamamaraan sa itaas para sa paghihiwalay ng mga nucleated na selula sa ilalim ng mga kondisyon ng kanilang sunud-sunod na paggamit sa bawat isa sa nasubok na mga sample ng dugo ng umbilical cord ay napatunayan na ang isang 3% gelatin solution ay ang pinakamainam na ahente ng sedimentation sa mga tuntunin ng ani ng mga mononuclear cell na may CD34+/CD45+ phenotype, pati na rin sa mga tuntunin ng CFUGE-MM. Ang mga pamamaraan gamit ang isang Ficoll density gradient, pati na rin ang paggamit ng hydroxyethyl starch at methylcellulose, ay hindi gaanong epektibo, na may mga pagkawala ng hematopoietic na mga cell na umaabot sa 60%.

Ang pagpapalawak ng cord blood stem cell transplantation volume ay nauugnay hindi lamang sa pag-unlad ng mga pamamaraan para sa kanilang pagkuha, kundi pati na rin sa imbakan. Mayroong maraming mga problema na direktang nauugnay sa paghahanda ng dugo ng kurdon para sa pangmatagalang imbakan at ang pagpili ng pinakamainam na teknolohiya para sa cryopreservation ng mga sample nito. Kabilang sa mga ito ay ang mga isyu ng pagiging posible ng pagsasagawa ng mga pamamaraan ng paghihiwalay, gamit ang iba't ibang cryopreservation media at paglalapat ng mga pamamaraan para sa paghahanda ng mga defrosted cell para sa paglipat. Ang transportasyon ng mga sample ng dugo ng katutubong kurdon ay madalas na isinasagawa mula sa mga rehiyon na malayo sa mga sentro ng hematological. Sa pagsasaalang-alang na ito, ang problema ng katanggap-tanggap na mga panahon ng imbakan para sa dugo ng kurdon mula sa sandali ng pagkuha nito hanggang sa simula ng cryopreservation ay lumitaw, na partikular na kahalagahan kapag lumilikha ng mga cord blood bank.

Ang isang pag-aaral ng functional activity ng hematopoietic cells sa umbilical cord blood pagkatapos ng pangmatagalang imbakan (hanggang 12 taon) sa liquid nitrogen ay nagpakita na ang tungkol sa 95% ng mga hematopoietic cells ay hindi nawawala ang kanilang mataas na proliferative capacity sa panahong ito. Sa gawain ni S. Yurasov at mga kapwa may-akda (1997), napatunayan na ang pag-iimbak ng dugo ng pusod sa temperatura ng silid (22 ° C) o sa 4 ° C sa loob ng 24 at 48 na oras ay hindi makabuluhang bawasan ang posibilidad na mabuhay ng mga hematopoietic na selula, na 92 at 88% ng paunang antas, ayon sa pagkakabanggit. Gayunpaman, kung ang panahon ng pag-iimbak ay pinalawig sa tatlong araw, ang bilang ng mga mabubuhay na nucleated na selula sa dugo ng pusod ay bumababa nang malaki. Kasabay nito, ipinakita ng iba pang mga pag-aaral na kapag nakaimbak ng 2-3 araw sa 22 o 4 ° C, ang posibilidad na mabuhay ng mga mature na granulocytes, sa halip na mga hematopoietic na selula, ay nagdurusa una at pangunahin.

Ang viability ng cord blood hematopoietic stem cells ay maaaring negatibong maapektuhan ng mga bahagi ng cord blood collection system. Ang isang pagsusuri ng epekto ng iba't ibang mga anticoagulants na ang mekanismo ng pagkilos ay dahil sa calcium ion binding (ACD, EDTA, XAPD-1) sa hematopoietic progenitor cells sa ilalim ng mga kondisyon ng cord blood storage para sa 24 hanggang 72 na oras ay nagsiwalat ng kanilang negatibong epekto sa posibilidad na mabuhay ng mga nucleated na selula. Kaugnay nito, inirerekomenda ng mga may-akda ang paggamit ng PBS (phosphate buffer solution) kasama ang pagdaragdag ng katutubong heparin na walang preservative sa isang konsentrasyon na 20 U / ml, na, sa kanilang opinyon, ay nagbibigay-daan sa pagtaas ng panahon ng pag-iimbak ng unfractionated cord blood sa 72 oras at pinapanatili ang functional na aktibidad ng mga yunit na bumubuo ng kolonya. Gayunpaman, ang isang pag-aaral ng kaligtasan ng CFU-GM at CFU-G ay nagpakita na ang oras ng pag-iimbak ng dugo ng kurdon bago ang cryopreservation ay hindi dapat lumampas sa siyam na oras. Malinaw, ang prinsipyo na dapat ilapat sa kasong ito ay na sa pagkakaroon ng magkasalungat na data, ang pinakamababang inirerekumendang panahon ng pag-iimbak para sa dugo ng kurdon ay dapat gamitin at ang programmed na pagyeyelo ng mga nakahiwalay na mga cell ay dapat na simulan sa lalong madaling panahon.

Kapag nagyeyelong cord blood hematopoietic stem cell, karaniwang ginagamit ang 10% DMSO solution bilang cryoprotectant. Gayunpaman, bilang karagdagan sa binibigkas na cryoprotective effect, ang dimethyl sulfoxide sa naturang konsentrasyon ay mayroon ding direktang cytotoxic effect, kahit na may kaunting pagkakalantad sa cord blood hematopoietic cells. Upang bawasan ang cytotoxic effect ng DMSO, zero exposure temperature ang ginagamit, ang bilis ng lahat ng manipulasyon ay tumataas, at maramihang paghuhugas ay isinasagawa pagkatapos ng lasaw ng cord blood samples.

Mula noong 1995, ang Institute of Hematology and Transfusiology ng Academy of Medical Sciences ng Ukraine ay bumubuo ng isang siyentipikong direksyon na naglalayong isang komprehensibong pag-aaral ng dugo ng pusod bilang isang alternatibong mapagkukunan ng mga hematopoietic stem cell. Sa partikular, ang mga bagong teknolohiya para sa mababang temperatura na cryopreservation ng hematopoietic cells ng unfractionated at fractionated umbilical cord blood ay binuo. Ang low-molecular na medikal na polyvinylpyrrolidone ay ginagamit bilang cryoprotectant. Ang paraan ng cryopreservation ng unfractionated umbilical cord blood ay batay sa isang orihinal na teknolohiya para sa pre-preparation ng mga cell para sa pagyeyelo at isang paraan para sa espesyal na pagproseso ng cell suspension kaagad bago ang paglipat.

Ang isa sa pinakamahalagang kadahilanan na nakakaimpluwensya sa antas ng functional na aktibidad ng cryopreserved hematopoietic stem cells ay ang rate ng paglamig ng suspensyon ng cell, lalo na sa yugto ng crystallization. Ang isang software na diskarte sa paglutas ng problema ng bilis at oras ng pagyeyelo ay nagbibigay ng magagandang pagkakataon para sa paglikha ng simple at lubos na epektibong pamamaraan ng cryopreservation, nang hindi hinuhugasan ang cell suspension mula sa cryoprotectors bago ang paglipat.

Ang pinaka-mapanganib na yugto para sa viability ng mga cell sa panahon ng kanilang paghahanda ay ang mga yugto ng direktang pagyeyelo at lasaw. Kapag nagyeyelong hematopoietic cells, ang isang makabuluhang bahagi ng mga ito ay maaaring sirain sa sandali ng paglipat ng intercellular medium mula sa likido hanggang sa solid phase - pagkikristal. Upang mabawasan ang porsyento ng pagkamatay ng cell, ginagamit ang mga cryoprotectors, ang mga mekanismo ng pagkilos at kahusayan ng cryoprotective na kung saan ay sapat na sakop sa siyentipikong panitikan.

Ang isang promising na direksyon para sa pag-optimize ng mga pamamaraan ng cryopreservation para sa bone marrow at umbilical cord blood cells ay ang kumbinasyon ng mababang konsentrasyon ng ilang cryoprotectors na may iba't ibang mekanismo ng pagkilos sa isang solusyon, halimbawa, DMSO na kumikilos sa intracellular level at hydroxyethyl starch o albumin, na may extracellular protective effect.

Para sa cryopreservation ng umbilical cord blood cells, tradisyonal na ginagamit ang isang 20% DMSO solution, na dahan-dahang ibinubuhos sa cell suspension na may patuloy na mekanikal na paghalo sa isang ice bath hanggang sa makamit ang pantay na (1:1) ratio ng cryoprotectant at cell suspension volume. Ang huling konsentrasyon ng dimethyl sulfoxide ay 10%. Pagkatapos ay pinapalamig ang cell suspension sa isang naka-program na cryogenic unit sa bilis na GS/min hanggang -40°C, pagkatapos nito ay tataas ang bilis ng paglamig sa 10°C/min. Pagkatapos maabot ang -100°C, ang lalagyan na may cell suspension ay inilalagay sa likidong nitrogen (-196°C). Gamit ang cryopreservation technique na ito, ang preserbasyon ng mga functionally active mononuclear cells pagkatapos ng defrosting ay umabot sa 85% ng orihinal na antas.

Ang mga pagbabago sa mga pamamaraan ng cryopreservation ay naglalayong bawasan ang konsentrasyon ng DMSO sa pamamagitan ng pagdaragdag ng hydroxyethyl starch (ang panghuling konsentrasyon ng dimethyl sulfoxide at hydroxyethyl starch ay 5 at 6%, ayon sa pagkakabanggit). Ang mataas na kahusayan ng naturang kumbinasyon ng mga cryoprotectors ay sinusunod kapag nagyeyelo ng isang suspensyon ng myeloid cells, at walang mas kaunting cytoprotection kaysa kapag gumagamit lamang ng isang 10% na solusyon ng dimethyl sulfoxide. Ang bilang ng mga mabubuhay na nucleated cell ay umabot sa 96.7% ng paunang antas, at ang kanilang functional na aktibidad, na tinatantya ng bilang ng CFU-GM, ay 81.8%.

Kapag gumagamit ng isang dimethyl sulfoxide solution sa mga konsentrasyon mula 5 hanggang 10% kasama ng 4% hydroxyethyl starch (panghuling konsentrasyon), napag-alaman na ang kaligtasan ng mga CD34-positibong mga cell sa naturang mga hanay ng dimethyl sulfoxide ay nananatiling halos hindi nagbabago. Kasabay nito, kapag ang konsentrasyon ng dimethyl sulfoxide ay bumababa mula 5 hanggang 2.5%, ang napakalaking pagkamatay ng mga selula ng dugo ng pusod ay sinusunod - ang bilang ng mga mabubuhay na yunit ng cell ay bumababa mula 85.4 hanggang 12.2%. Ang iba pang mga may-akda ay dumating din sa konklusyon na ito ay 5 at 10% dimethyl sulfoxide na mga solusyon (sa bersyon ng may-akda - kasama ang autologous serum) na nagbibigay ng cytoprotection na may pinakamataas na kahusayan sa panahon ng cryopreservation ng umbilical cord blood HSCs. Bilang karagdagan, ang mataas na pangangalaga ng sunud-sunod na frozen at lasaw na mga cell ay nabanggit sa kaso ng isang kumbinasyon ng 5 o 10% dimethyl sulfoxide na may 4% hydroxyethyl starch solution, lalo na sa isang kinokontrol na rate ng paglamig ng GS / min. Sa isa pang pag-aaral, ginamit ang isang cryoprotective solution na binubuo ng tatlong sangkap - DMSO, purified human albumin at RPMI medium sa ratio na 1:4:5, na idinagdag sa cell suspension sa isang pantay na volume ratio (ang panghuling konsentrasyon ng dimethyl sulfoxide ay 5%). Pagkatapos mag-defrost sa isang paliguan ng tubig sa temperatura na +4 GS, ang pangangalaga ng CFU-GM ay lumampas sa 94%.

Iminumungkahi ng ilang may-akda ang paggamit ng unfractionated cord blood para sa cryopreservation, dahil malaking halaga ng hematopoietic cell ang nawawala sa proseso ng pag-alis ng mga pulang selula ng dugo. Sa variant na ito, ginagamit ang isang 10% na solusyon ng dimethyl sulfoxide upang protektahan ang mga mononuclear cell mula sa mga nakakapinsalang epekto ng cryocrystallization. Isinasagawa ang pagyeyelo sa pare-parehong bilis ng paglamig ng GS/min hanggang -80°C, pagkatapos nito ang suspensyon ng selula ng dugo ng kurdon ay ibinaba sa likidong nitrogen. Ang paraan ng pagyeyelo na ito ay nagreresulta sa bahagyang lysis ng mga pulang selula ng dugo, kaya ang mga sample ng dugo ay hindi nangangailangan ng fractionation. Pagkatapos ng defrosting, ang cell suspension ay hinuhugasan mula sa libreng hemoglobin at dimethyl sulfoxide sa isang solusyon ng albumin ng tao o sa autologous blood serum ng pasyente at ginagamit para sa paglipat.

Ang preserbasyon ng hematopoietic progenitor cells pagkatapos ng paglusaw ng unfractionated cord blood ay talagang mas mataas kaysa sa fractionated cord blood, gayunpaman, dahil sa cryostability ng ilang erythrocytes, ang mga seryosong problema sa post-transfusion ay maaaring lumitaw dahil sa transfusion ng ABO-incompatible erythrocytes. Bilang karagdagan, ang dami ng nakaimbak na unfractionated na dugo ay tumataas nang malaki. Mula sa klinikal na pananaw, ang cryopreservation ng dati nang nakahiwalay at nalinis mula sa iba pang mga fraction ng cell cord blood hematopoietic cells ay mas gusto pa rin.

Sa partikular, ang isang paraan para sa cryopreservation ng fractionated umbilical cord blood cells ay binuo, na nagpapahintulot sa pag-alis ng mga erythrocytes sa yugto ng paghahanda para sa pagyeyelo, kung saan ang isang 6% na solusyon ng hydroxyethyl starch ay ginagamit bilang bahagi ng plasma-substituting solution na "Stabizol". Pagkatapos ng defrosting, ang cell suspension na nakuha sa ganitong paraan ay handa na para sa klinikal na paggamit nang walang karagdagang mga manipulasyon.

Kaya, sa kasalukuyan mayroong maraming medyo epektibong paraan ng cryopreservation ng dugo ng pusod. Ang kanilang pangunahing pagkakaiba ay ang mga sample ng dugo ay frozen unfractionated o sumasailalim sa paghihiwalay sa mga cell fraction sa yugto ng paghahanda at mga nucleated na mga cell na walang admixture ng mga erythrocytes ay inihanda.

Cord blood hematopoietic stem cell transplantation

Noong huling bahagi ng 1980s at unang bahagi ng 1990s, itinatag na ang pusod ng dugo, na nagbibigay ng suporta sa buhay ng fetus sa panahon ng pagbubuntis, ay may mataas na nilalaman ng hematopoietic stem cell. Ang kamag-anak na pagiging simple ng pagkuha ng mga selula ng dugo ng pusod at ang kawalan ng mga halatang problema sa etika ay nag-ambag sa paggamit ng mga stem cell ng dugo ng pusod sa praktikal na gamot. Ang unang matagumpay na cord blood transplant sa isang batang may Fanconi anemia ay nagsilbing panimulang punto para sa pagpapalawak ng dami ng mga cord blood stem cell transplant at paglikha ng isang sistema para sa pagbabangko nito. Sa pandaigdigang sistema ng mga cord blood bank, ang pinakamalaki ay ang New York Placental Blood Center, na nasa balanse ng US National Institute of Health. Ang bilang ng mga nakaimbak na sample ng dugo ng umbilical cord sa bangkong ito ay papalapit na sa 20,000. Ang bilang ng mga tatanggap (karamihan ay mga bata) na sumailalim sa matagumpay na transplant ay lumalaki din. Ayon sa US Department of Health, ang relapse-free na panahon ng post-transplant life ng cord blood transplant recipients ay lumampas na sa 10 taon.

Hindi ito nakakagulat, dahil maraming mga pag-aaral ng hematopoietic na potensyal ng dugo ng pusod ay nagpakita na sa mga tuntunin ng dami at kalidad ng pinakamaagang stem cell, hindi lamang ito mas mababa sa bone marrow ng isang may sapat na gulang, ngunit lumampas din ito sa ilang mga aspeto. Ang mas mataas na potensyal na proliferative ng cord blood stem cells ay dahil sa mga ontogenetic features ng cellular signaling, ang pagkakaroon ng mga receptor para sa mga partikular na growth factor sa HSC, ang kakayahan ng cord blood cells sa autocrine production ng growth factor, at ang malaking sukat at haba ng telomeres.

Kaya, ang genomic at phenotypic na mga katangian ng cord blood hematopoietic stem cells ay paunang tinutukoy ang mataas na kalidad na engraftment ng transplant na may mataas na potensyal para sa pagpapanumbalik ng donor hematopoiesis sa katawan ng tatanggap.

Mga benepisyo ng cord blood hematopoietic stem cells

Kabilang sa mga tunay na pakinabang ng paggamit ng cord blood hematopoietic stem cell para sa paglipat sa iba pang mga pinagmumulan ng hematopoietic cells, ito ay nagkakahalaga ng pagpuna sa halos zero na panganib sa kalusugan ng donor (kung hindi natin isasaalang-alang ang inunan bilang tulad) at ang kawalan ng pangangailangan para sa pangkalahatang kawalan ng pakiramdam. Ang paggamit ng cord blood ay nagpapalawak ng mga posibilidad ng cell transplantation dahil sa bahagyang HLA-compatible transplants (incompatibility mula sa isa hanggang tatlong antigens). Isang paraan para sa pangmatagalang pag-iimbak ng cord blood hematopoietic cells sa isang frozen na estado ay binuo, na nagpapataas ng posibilidad na makakuha ng mga bihirang uri ng HLA at binabawasan ang oras upang maghanap ng isang HLA-compatible na transplant para sa allogeneic transplantation. Kasabay nito, ang panganib na magkaroon ng ilang mga nakatagong impeksiyon na ipinadala sa pamamagitan ng mga transmissible na paraan ay makabuluhang nabawasan. Bilang karagdagan, ang isang murang anyo ng biological life insurance ay lumitaw dahil sa posibilidad ng paggamit ng mga cord blood cell para sa autologous transplantation.

Gayunpaman, dahil sa maliit na dami ng dugo na maaaring makolekta mula sa inunan (sa average na hindi hihigit sa 100 ml), ang problema sa pagkuha ng maximum na posibleng dami ng dugo mula sa ugat ng pusod ay nauuna habang mahigpit na sinusunod ang kondisyon ng minimal na panganib ng bacterial contamination ng nakuha na mga sample ng dugo ng pusod.

Ang mga primitive hematopoietic cells ng umbilical cord blood ay karaniwang nakikilala sa pamamagitan ng pagkakaroon ng CD34 glycophosphoprotein sa kanilang ibabaw, pati na rin batay sa kanilang mga functional na katangian sa pamamagitan ng pag-aaral ng clonogenicity o colony formation sa vitro. Ipinakita ng comparative analysis na sa cord blood at bone marrow ang maximum content ng CD34-positive cells sa mononuclear fraction ay 1.6 at 5.0%, ayon sa pagkakabanggit, ang maximum level ng colony-forming units sa CD34+ cell subpopulation ay 80 at 25%, ang kabuuang cloning efficiency ng CD34+ na mga cell na may mataas na prolife na nilalaman ng colony ay 88 at 58%. (HPP-CFC sa populasyon ng CD34+) ay 50 at 6.5%. Dapat itong idagdag na ang kahusayan ng pag-clone ng mga cell ng CD34 + CD38 at ang kakayahang tumugon sa pagpapasigla ng cytokine ay mas mataas din sa mga selulang hematopoietic stem ng dugo ng kurdon.

Ang kumbinasyon ng mga phenotypic antigens na Thy-1, CD34 at CD45RA ay nagpapatunay sa mataas na potensyal na proliferative ng cord blood hematopoietic cells, at ang pagpapahayag ng tatlong antigen na ito sa ibabaw ng cord blood cells ay nagpapahiwatig ng kanilang pag-aari sa mga stem cell. Bilang karagdagan, natagpuan na ang cord blood ay naglalaman ng mga cell na may CD34+ phenotype na walang mga marker ng linear differentiation. Ang antas ng mga cellular subpopulasyon na may phenotypic na profile na CD34+/Lin sa cord blood ay humigit-kumulang 1% ng kabuuang bilang ng mga CD34-positive na cell. Ang hematopoietic progenitor cells ng umbilical cord blood ay nagbibigay ng parehong lymphoid cell line at ang pluripotent myeloid series ng linear cell differentiation, na nagpapahiwatig din ng kanilang pag-aari sa mga stem cell.

Tulad ng nabanggit na, ang mga makabuluhang pagkakaiba sa pagitan ng bone marrow at cord blood ay nasa dami ng hematopoietic cells na ginagamit para sa paglipat na nakuha sa isang pamamaraan ng pagkolekta. Kung sa panahon ng paglipat ng utak ng buto, ang pagkawala ng masa ng cell sa panahon ng paghihiwalay, cryopreservation, lasaw at pagsubok ay katanggap-tanggap sa loob ng 40-50%, kung gayon para sa dugo ng kurdon, ang mga pagkalugi ng selula ay napakahalaga, dahil kung ang isang hindi sapat na halaga ng HSC ay ginagamit, ang transplant ay maaaring patunayan na hindi epektibo. Ayon kay G. Kogler et al. (1998), para sa cell transplantation na may bigat ng katawan ng tatanggap na 10 kg, ang lahat ng sample ng dugo ng kurdon ay maaaring maging potensyal na mga transplant (ang kabuuang bilang ng mga nakolektang sample ng dugo ng kurdon ay 2098), na may timbang na 35 kg - 67%, at 25% lamang ng mga sample ang maaaring magbigay ng epektibong paglipat sa mga pasyente na may timbang sa katawan na 50-70 kg. Ang klinikal na sitwasyong ito ay nagpapahiwatig ng pangangailangan na i-optimize at pagbutihin ang kahusayan ng mga umiiral na pamamaraan ng pagkolekta, pagpaparami at pag-iimbak ng mga selula ng dugo ng pusod. Samakatuwid, ang panitikan ay kasalukuyang malawak na tinatalakay ang mga isyu ng pag-standardize ng mga pamamaraan ng pagkolekta, pagsubok, paghihiwalay at pag-iingat ng dugo ng pusod upang lumikha ng mga bangko ng dugo, ang paggamit nito sa klinika, at itinakda din ang mga kondisyon at tuntunin ng pag-iimbak ng mga hematopoietic stem cell ng dugo ng pusod.

[ 7 ], [ 8 ], [ 9 ]

Paggamit ng cord blood hematopoietic stem cell sa gamot

^{Karaniwan, posibleng ihiwalay ang hanggang 10 6} hematopoietic stem cell mula sa dugo ng pusod, bihirang higit pa. Sa pagsasaalang-alang na ito, ang tanong kung ang naturang dami ng mga hematopoietic na selula mula sa dugo ng pusod ay sapat upang maibalik ang hematopoiesis sa isang may sapat na gulang na tatanggap ay nananatiling bukas hanggang sa araw na ito. Ang mga opinyon sa bagay na ito ay nahahati. Naniniwala ang ilang mga mananaliksik na ang naturang dami ay sapat na para sa paglipat sa mga bata, ngunit masyadong maliit para sa paglipat sa isang may sapat na gulang, kung kanino ang pinakamainam na halaga ay ang pagpapakilala ng (7-10) x 10 ⁶ CD34-positibong mga cell bawat 1 kg ng timbang ng katawan - isang average ng 7 x 10 ⁸ bawat transplant. Mula sa mga kalkulasyong ito, sumusunod na ang isang sample ng dugo ng umbilical cord ay naglalaman ng 700 beses na mas kaunting mga hematopoietic stem cell kaysa sa kinakailangan para sa isang paglipat sa isang may sapat na gulang na pasyente. Gayunpaman, ang naturang quantitative assessment ay ginawa sa pamamagitan ng pagkakatulad sa bilang ng mga transfused bone marrow cells at hindi isinasaalang-alang ang mga ontogenetic na tampok ng hematopoiesis.

Sa partikular, ang katotohanan ng isang mas mataas na potensyal na proliferative ng cord blood hematopoietic stem cells kumpara sa bone marrow hematopoietic progenitor cells ay hindi pinansin. Ang mga resulta ng in vitro colony-forming potential studies ay nagmumungkahi na ang isang dosis ng cord blood ay may kakayahang magbigay ng reconstitution ng adult recipient hematopoiesis. Sa kabilang banda, hindi dapat kalimutan na ang bilang ng mga stem cell ng dugo ng kurdon ay bumababa kahit na sa panahon ng pag-unlad ng embryonic: ang nilalaman ng mga CD34-positibong mga selula sa dugo ng kurdon ay bumababa nang linear ng 5 beses sa panahon mula sa 20 linggo (ang dugo para sa pag-aaral ay nakuha sa panahon ng napaaga na pagwawakas ng pagbubuntis) hanggang 40 na linggo ng pagbubuntis (ang panahon ng isang physiological companiel na linya), na kung saan ay patuloy na tumataas sa pamamagitan ng physiological labor), mga marker ng cytodifferentiation.

Dahil sa kakulangan ng standardized approach sa quantitative determination ng progenitor cells sa cord blood samples, nagpapatuloy ang mga debate tungkol sa pinakamainam na dosis ng cord blood hematopoietic stem cell. Naniniwala ang ilang mananaliksik na ang bilang ng mga nucleated na selula at mga mononuclear na selula na muling kinalkula para sa timbang ng katawan ng tatanggap, ibig sabihin, ang kanilang dosis, ay maaaring gamitin bilang pamantayan sa pagpili ng mga sample ng dugo ng kurdon. Naniniwala ang ilang may-akda na ang pinakamababang quantitative threshold ng CD34+ cells kahit para sa autotransplantation ng HSCs ay 2 x 10 ⁶ /kg. Kasabay nito, ang pagtaas sa dosis ng mga hematopoietic na selula sa 5 x 10 ⁶ na mga cell/kg (2.5 beses lamang) ay nagsisiguro ng isang mas kanais-nais na kurso ng maagang post-transplant na panahon, binabawasan ang saklaw ng mga nakakahawang komplikasyon at pinaikli ang tagal ng preventive antibiotic therapy.

Ayon kay E. Gluckman et al. (1998), sa oncohematology ang kundisyon para sa matagumpay na cord blood cell transplantation ay ang pagpapakilala ng hindi bababa sa 3.7 x 10 ⁷ nucleated cells bawat 1 kg ng timbang ng katawan ng tatanggap. Kapag ang dosis ng hematopoietic stem cell ay nabawasan sa 1 x 10 ⁷ o mas kaunting mga nucleated na selula sa bawat 1 kg ng timbang ng katawan ng pasyente, ang panganib ng pagkabigo sa transplant at pagbabalik ng kanser sa dugo ay tumataas nang husto. Dapat itong kilalanin na ang pinakamababang bilang ng mga progenitor cells na kinakailangan para sa mabilis na pagpapanumbalik ng hematopoiesis pagkatapos ng allotransplantation ng HSCs ay hindi pa rin alam. Sa teorya, ito ay maaaring makamit gamit ang isang cell, ngunit sa klinikal na pagsasanay ng bone marrow transplantation, ang mabilis at matatag na engraftment ay ginagarantiyahan sa pamamagitan ng pagsasalin ng hindi bababa sa (1-3) x 10 ⁸ nucleated na mga cell bawat 1 kg ng timbang ng katawan ng pasyente.

Ang isang kamakailang detalyadong pag-aaral upang matukoy ang pinakamainam na bilang ng mga HSC sa oncohematology ay kasama ang pagmamasid sa mga pasyente sa tatlong grupo, na inilalaan depende sa nilalaman ng CD34-positibong mga cell sa transplanted na materyal. Ang mga pasyente ng unang grupo ay pinangangasiwaan (3-5) x 10 ⁶ na mga cell/kg. Ang dosis ng HSC sa mga pasyente ng pangalawang grupo ay (5-10) x 10 ⁶ na mga cell/kg, at ang mga pasyente ng ikatlong grupo ay inilipat na may higit sa 10 x 10 ⁶ CD34+ na mga cell/kg. Ang pinakamahusay na mga resulta ay naobserbahan sa pangkat ng mga tatanggap na nakatanggap ng transplant na may bilang ng mga CD34-positibong mga cell na katumbas ng (3-5) x 10 ⁶ /kg. Sa pagtaas ng dosis ng mga transplanted na selula sa itaas ng 5 x 10 ⁶ /kg, ang mga makabuluhang pakinabang sa istatistika ay hindi naihayag. Sa kasong ito, ang isang napakataas na nilalaman ng HSC sa transplant (> 10 x 10 ⁶ /kg) ay nauugnay sa muling pagbubuhos ng isang makabuluhang bilang ng mga natitirang selula ng tumor, na humahantong sa pagbabalik ng sakit. Ang isang direktang ugnayan sa pagitan ng bilang ng mga inilipat na allogeneic progenitor cells at ang pagbuo ng reaksyon ng graft-versus-host ay hindi naitatag.

Ang naipon na karanasan sa mundo ng cord blood transplantation ay nagpapatunay sa kanilang mataas na potensyal na muling populasyon. Ang rate ng engraftment ng cord blood transplant ay nauugnay sa bilang ng mga ipinakilalang nucleated na mga cell. Ang pinakamahusay na mga resulta ay sinusunod sa paglipat ng 3 x 10 ⁷ /kg, habang para sa bone marrow ang dosis na ito ay 2 x 10 ⁸ /kg. Ayon sa data ng mga coordinating center, sa pagtatapos ng 2000, 1200 cord blood cell transplantation ang isinagawa sa buong mundo, pangunahin mula sa mga kaugnay na donor (83%). Malinaw na ang cord blood ay dapat isaalang-alang bilang alternatibo sa bone marrow para sa paglipat sa mga pasyenteng may hemoblastoses.

Kasabay nito, ang neonatal na kalikasan ng pinagmulan ng kurdon ng hematopoietic tissue ay nagbibigay inspirasyon sa optimismo dahil sa pagkakaroon ng mga functional na tampok ng HSC nito. Kasabay nito, tanging klinikal na karanasan lamang ang makakasagot sa tanong ng sapat na isang sample ng dugo ng kurdon upang maibalik ang hematopoiesis sa isang may sapat na gulang na tatanggap na may hematopoietic aplasia. Ang paglipat ng mga selula ng dugo sa pusod ay ginagamit sa mga programa sa paggamot para sa maraming sakit na tumor at hindi tumor: leukemia at myelodysplastic syndromes, non-Hodgkin's lymphoma at neuroblastoma, aplastic anemia, congenital Fanconi at Diamond-Blackfan anemias, leukocyte adhesion deficiency, Barr syndrome, Gunther's disease, thalass syndrome, thalass syndrome

Ang mga immunological na aspeto ng cord blood hematopoietic cell transplantation ay nararapat na masusing pansin at isang hiwalay na pag-aaral. Ipinakita na sa kaso ng cord blood stem cell transplantation mula sa mga donor na may hindi kumpletong HLA compatibility, ang mga resulta ng transplantation ay lubos na kasiya-siya, na, ayon sa mga may-akda, ay nagpapahiwatig ng mas mababang immunoreactivity ng cord blood cells kaysa bone marrow.

Ang isang detalyadong pag-aaral ng cellular composition ng umbilical cord blood ay nagsiwalat ng mga tampok ng parehong phenotypic spectrum ng effector cells ng immune system at ang kanilang functional na aktibidad, na naging posible na isaalang-alang ang cord blood bilang isang mapagkukunan ng HSC na may medyo mababang panganib na magkaroon ng reaksyon ng 'graft versus host'. Kabilang sa mga palatandaan ng functional immaturity ng immunocompetent cells ng umbilical cord blood, kinakailangang tandaan ang kawalan ng timbang sa paggawa ng mga cytokine at pagbaba ng sensitivity sa regulasyon ng cytokine ng immune response. Ang nagresultang pagsugpo sa aktibidad ng cytotoxic lymphocytes ay itinuturing na isang kadahilanan na nag-aambag sa pagbuo ng immunological tolerance sa transplanted hematopoietic tissue. Sa populasyon ng umbilical cord blood lymphocytes, sa kaibahan sa peripheral blood at bone marrow ng mga adult na donor, nangingibabaw ang hindi aktibo, hindi pa nabubuong mga lymphocyte at suppressor cells. Ito ay nagpapahiwatig ng pinababang kahandaan ng T-lymphocytes ng dugo ng pusod para sa isang immune response. Ang isang mahalagang katangian ng monocytic na populasyon ng mga selula ng dugo ng pusod ay ang mababang nilalaman ng ganap na gumagana at aktibong mga cell na nagpapakita ng antigen.

Sa isang banda, ang mababang kapanahunan ng immune system effector cells sa cord blood ay nagpapalawak ng mga indikasyon para sa paggamit nito sa klinika, dahil ang mga tampok na ito ay nagbibigay ng pagbawas sa intensity ng immune conflict sa pagitan ng mga cell ng donor at ng tatanggap. Ngunit, sa kabilang banda, ito ay kilala tungkol sa pagkakaroon ng isang ugnayan sa pagitan ng antas ng pag-unlad ng "graft versus host" na reaksyon at ang antitumor effect ng paglipat, iyon ay, ang pagbuo ng "graft versus leukemia" na epekto. Kaugnay nito, isang pag-aaral ang isinagawa sa antitumor cytotoxicity ng cord blood cells. Ang mga resulta na nakuha ay nagpapahiwatig na, sa kabila ng tunay na humina na tugon ng immunocompetent cord blood cells sa antigen stimulation, ang mga lymphocytes na pangunahing naka-activate ay mga natural killer at killer-like cells na aktibong bahagi sa mga mekanismo ng pagpapatupad ng antitumor cytotoxicity. Bilang karagdagan, ang mga subpopulasyon ng mga lymphocyte na may CD16+CD56+ at CD16"TCRa/p+ na mga phenotype ay natagpuan sa cord blood. Ipinapalagay na ang mga cell na ito sa kanilang activated form ay nagpapatupad ng "graft versus leukemia" na reaksyon.

Sa Institute of Oncology ng Academy of Medical Sciences ng Ukraine, ang cryopreserved hematopoietic cells ng umbilical cord blood ay ibinibigay sa mga pasyente ng cancer na may patuloy na hematopoietic hypoplasia dahil sa chemo- at radiotherapy. Sa ganitong mga pasyente, ang paglipat ng mga hematopoietic stem cell ng umbilical cord blood ay lubos na epektibong naibalik ang nalulumbay na hematopoiesis, na pinatunayan ng isang patuloy na pagtaas sa nilalaman ng mga mature na nabuo na elemento sa peripheral na dugo, pati na rin ang pagtaas sa mga tagapagpahiwatig na nagpapakilala sa estado ng cellular at humoral na kaligtasan sa sakit. Ang katatagan ng epekto ng repopulation pagkatapos ng paglipat ng mga hematopoietic na selula ng dugo ng pusod ay nagpapahintulot sa patuloy na radiation at chemotherapy nang hindi nakakaabala sa kurso ng paggamot. Mayroong impormasyon sa isang mas mataas na kahusayan ng allotransplantation ng umbilical cord blood stem cells sa mga oncohematological na pasyente: ang taunang panganib ng pagbabalik ng sakit sa tumor sa kanilang paggamit ay 25% kumpara sa 40% sa mga pasyente na may transplanted allogenic bone marrow.

Ang mekanismo ng pagkilos ng cryopreserved cord blood stem cells ay dapat isaalang-alang na resulta ng humoral stimulation ng recipient hematopoiesis na dulot ng natatanging kakayahan ng neonatal cells sa autocrine production ng hematopoietic growth factor, gayundin bilang resulta ng pansamantalang engraftment ng mga donor cells (bilang ebidensya ng isang maaasahang pagtaas sa nilalaman ng fetal hemoglobin sa peripheral na data sa peripheral na dugo ng 7-15 na unang araw ng transfusion). Ang kawalan ng mga reaksyon sa post-transfusion sa mga tatanggap ng dugo ng kurdon ay resulta ng kamag-anak na pagpapaubaya ng mga immunocompetent na mga selula nito, pati na rin ang isang pamantayan ng kumpiyansa para sa biological na kasapatan ng cryopreserved na materyal.

Ang cord blood T-lymphocyte killer progenitor cells ay may kakayahang mag-activate sa ilalim ng impluwensya ng exogenous cytokine stimulation, na ginagamit upang bumuo ng mga bagong ex vivo at in vivo na pamamaraan para sa pag-induce ng antitumor cytotoxicity ng transplant lymphoid elements para sa kasunod na immunotherapy. Bilang karagdagan, ang "immaturity" ng genome ng umbilical cord blood immunocompetent cells ay nagpapahintulot sa kanila na magamit upang mapahusay ang aktibidad ng antitumor gamit ang mga molecular modeling method.

Ngayon, ang dugo ng kurdon ay natagpuan ang malawak na aplikasyon lalo na sa pediatric hematology. Sa mga batang may acute leukemia, ang allotransplantation ng cord blood hematopoietic stem cells, kumpara sa allotransplantation ng bone marrow, ay makabuluhang binabawasan ang saklaw ng graft-versus-host disease. Gayunpaman, ito ay sinamahan ng mas mahabang panahon ng neutro- at thrombocytopenia at, sa kasamaang-palad, isang mas mataas na 100-araw na post-transplant mortality rate. Ang isang mas mahabang panahon ng pagbawi ng mga antas ng granulocyte at platelet sa peripheral na dugo ay maaaring dahil sa hindi sapat na pagkita ng kaibahan ng mga indibidwal na subpopulasyon ng CD34-positive cord blood cells, na pinatunayan ng mababang antas ng pagsipsip ng radioactive rhodamine at mababang pagpapahayag ng CD38 antigens sa kanilang ibabaw.

Kasabay nito, ang paglipat ng mga hematopoietic stem cell ng umbilical cord blood sa mga pasyenteng may sapat na gulang, na isinagawa dahil sa kawalan ng parehong hindi katugmang donor ng bone marrow at ang posibilidad ng pagpapakilos ng mga autologous HSC, ay nagpakita ng isang mataas na isang taon na walang pagbabalik na kaligtasan ng buhay sa pangkat ng mga pasyente sa ilalim ng 30 taong gulang (73%). Ang pagpapalawak ng hanay ng edad ng mga tatanggap (18-46 taon) ay humantong sa pagbaba ng kaligtasan ng buhay sa 53%.

Ang dami ng pagsusuri ng mga cell na may CD34+ phenotype sa bone marrow at cord blood ay nagsiwalat ng kanilang mas mataas (3.5 beses) na nilalaman sa bone marrow, ngunit isang makabuluhang pamamayani ng mga cell na may phenotypic profile CD34+HLA-DR ay nabanggit sa cord blood. Alam na ang mga selula ng dugo na may mga immunological marker na CD34+HLA-DR ay lumalaganap nang mas aktibo kaysa sa mga cell na may immunophenotype CD34+HLA-DR+, na nakumpirma sa mga eksperimentong pag-aaral ng paglago ng pangmatagalang hematopoietic cell culture sa vitro. Ang mga primitive cell precursor na may CD34+CD38 phenotype ay parehong nasa cord blood at bone marrow, ngunit ang cord blood cells na may marker set CD34+CD38 ay may mas mataas na clonogenic na aktibidad kaysa sa mga hematopoietic na cell ng parehong phenotype na nakahiwalay sa bone marrow ng mga adult na donor. Bilang karagdagan, ang mga cord blood cell na may CD34+CD38 immunophenotype ay mas mabilis na dumarami bilang tugon sa cytokine stimulation (IL-3, IL-6, G-CSF) at gumagawa ng 7 beses na mas maraming kolonya sa mga pangmatagalang kultura kaysa sa bone marrow cells.

Mga Bangko ng Cord Blood Stem Cell

Para sa wastong pag-unlad ng isang bagong lugar ng praktikal na gamot - cord blood stem cell transplantation, pati na rin para sa pagpapatupad ng bone marrow hematopoietic stem cell transplants, kinakailangan na magkaroon ng malawak na network ng mga blood bank, na nalikha na sa USA at Europe. Ang mga domestic cord blood bank network ay pinagsama ng Netcord Bank Association. Ang pagiging angkop ng paglikha ng isang pang-internasyonal na asosasyon ng mga cord blood bank ay natutukoy sa pamamagitan ng katotohanan na ang isang malaking bilang ng mga na-type na sample ng dugo ng kurdon ay kinakailangan upang magsagawa ng mga hindi nauugnay na mga transplant, na nagpapahintulot sa pagpili ng isang HLA-magkaparehong donor. Tanging ang pagtatatag ng isang sistema ng mga bangko na may imbakan ng mga sample ng dugo ng iba't ibang uri ng HLA ang talagang makakalutas sa problema ng paghahanap ng kinakailangang donor. Ang organisasyon ng naturang cord blood bank system ay nangangailangan ng paunang pag-unlad ng etikal at legal na mga pamantayan, na kasalukuyang tinatalakay sa internasyonal na antas.

Upang makalikha ng mga cord blood bank sa Ukraine, isang buong serye ng mga regulasyon at dokumento ang dapat gawin.

Una sa lahat, ito ay mga isyu ng standardisasyon ng mga pamamaraan ng koleksyon, fractionation at pagyeyelo ng dugo ng pusod. Kinakailangang i-regulate ang mga alituntunin ng koleksyon ng dugo ng pusod sa mga maternity hospital alinsunod sa mga kinakailangan ng etikang medikal, upang matukoy ang pinakamababang dami ng dugo ng pusod na nagsisiguro ng matagumpay na paglipat. Kinakailangan na ihambing at i-standardize ang iba't ibang pamantayan para sa pagtatasa ng kalidad at dami ng hematopoietic progenitor cells, pati na rin ang mga pamamaraan ng pag-type ng HLA at mga diagnostic na pamamaraan para sa genetic at mga nakakahawang sakit na maaaring maipasa sa panahon ng pagbubuhos ng mga selula ng dugo ng pusod, upang magtatag ng karaniwang pamantayan para sa pagpili ng malusog na mga donor. Nararapat ding pag-usapan ang mga isyu ng paglikha ng hiwalay na mga pasilidad ng imbakan para sa serum, mga selula at DNA na nakuha mula sa dugo ng pusod.

Talagang kinakailangan na ayusin ang isang computer network ng data ng dugo ng kurdon upang maiugnay sa mga rehistro ng donor ng bone marrow. Para sa karagdagang pag-unlad ng cell transplantology, kinakailangan na bumuo ng mga espesyal na protocol para sa paghahambing ng mga resulta ng cord blood at bone marrow transplantation mula sa HLA-magkaparehong mga kamag-anak at hindi nauugnay na mga donor. Ang standardisasyon ng dokumentasyon, kabilang ang may-kaalamang pahintulot ng mga magulang, pati na rin ang abiso ng ina o mga kamag-anak tungkol sa genetic at/o mga nakakahawang sakit na nakita sa bata, ay maaaring makatulong sa paglutas ng mga etikal at legal na problema ng klinikal na paggamit ng mga selula ng dugo ng kurdon.

Ang pagtukoy sa kondisyon para sa pagbuo ng cell transplantology sa Ukraine ay ang pag-aampon ng National Stem Cell Donation Program at ang pagbuo ng internasyonal na pakikipagtulungan sa ibang mga bansa sa pamamagitan ng World Marrow Donor Association (WMDA), US National Marrow Donor Program (NMDP) at iba pang mga rehistro.

Pagbubuod sa maikling kasaysayan pa rin ng pag-unlad ng cord blood hematopoietic stem cell transplantation, napapansin namin na ang mga unang pagpapalagay tungkol sa posibilidad ng paggamit ng cord blood sa isang klinika, na ipinahayag noong unang bahagi ng 70s, ay nakumpirma noong 80s ng mga resulta ng mga eksperimentong pag-aaral sa mga hayop, at noong 1988 ang unang mundo ng paglipat ng kurdon ng mga selula ng dugo sa isang hematopoie ng tao ay isinagawa pagkatapos ng cord ng dugo ng isang hematopoie network. nagsimulang likhain. Sa 10 taon, ang bilang ng mga pasyente na may transplanted cord blood hematopoietic cells ay lumapit sa 800. Kabilang sa mga ito ang mga pasyente na may iba't ibang sakit ng tumor (leukemia, lymphoma, solid tumor) at non-tumor (congenital immunodeficiencies, anemia, mga sakit na nauugnay sa metabolic disorder) kalikasan.

Ang nilalaman ng maaga at nakatuon na mga cell precursor sa dugo ng pusod ay mas mataas kaysa sa peripheral na dugo ng isang nasa hustong gulang. Sa mga tuntunin ng bilang ng mga granulocyte-macrophage colony-forming units at ang kanilang proliferative potential, umbilical cord blood ay makabuluhang lumampas sa peripheral blood ng mga matatanda kahit na pagkatapos ng pagpapakilala ng mga growth factor. Sa pangmatagalang mga kultura ng cell sa vitro, mas malaki ang proliferative na aktibidad at posibilidad na mabuhay ng mga selula ng dugo ng pusod kaysa sa mga selula ng utak ng buto. Ang mga kritikal na sandali sa cord blood stem cell transplantation ay ang bilang at hematopoietic na potensyal ng mga nucleated na selula, ang pagkakaroon ng impeksyon sa cytomegalovirus, pagiging tugma ng HLA ng donor at tatanggap, timbang ng katawan at edad ng pasyente.

Gayunpaman, ang cord blood stem cell transplantation ay dapat isaalang-alang bilang alternatibo sa bone marrow transplantation para sa paggamot ng mga malalang sakit sa dugo, pangunahin sa mga bata. Ang mga klinikal na problema ng cord blood cell transplantation ay unti-unting nareresolba - mayroon nang lubos na epektibong mga paraan para sa pagkolekta, paghihiwalay at pag-iingat ng mga cord blood cell, ang mga kondisyon ay ibinibigay para sa pagbuo ng mga cord blood bank, at ang mga pamamaraan para sa pagsusuri ng mga nucleated na selula ay pinapabuti. Ang 3% gelatin solution at 6% hydroxyethyl starch solution ay dapat ituring na pinakamainam para sa paghihiwalay sa panahon ng malakihang pagkuha ng cord blood hematopoietic stem cell kapag lumilikha ng mga bangko.

P. Perekhrestenko at co-authors (2001) ay wastong tandaan na ang cord blood stem cell transplantation ay dapat kumuha ng nararapat na lugar nito sa kumplikadong mga therapeutic na hakbang upang mapagtagumpayan ang mga hematopoietic depression ng iba't ibang genesis, dahil ang mga stem cell ng dugo ng kurdon ay may isang bilang ng mga makabuluhang pakinabang, bukod sa kung saan ang pinakamahalaga ay ang kamag-anak na pagiging simple ng kanilang pagkuha, ang kawalan ng mga cell ng neonatal at neonatal donasyon. medyo mababang halaga ng paglipat. Itinuturo ng ilang mga may-akda na ang paglipat ng selula ng dugo ng kurdon ay hindi gaanong madalas na sinamahan ng mga komplikasyon na nauugnay sa reaksyon ng graft-versus-host kaysa sa paglipat ng selula ng utak ng buto, na dahil, sa kanilang opinyon, sa mahinang pagpapahayag ng mga HLA-DR antigens sa mga selula ng dugo ng kurdon at ang kanilang pagiging immaturity. Gayunpaman, ang pangunahing populasyon ng mga nucleated cell sa cord blood ay T lymphocytes (CD3-positive cells), ang nilalaman nito ay humigit-kumulang 50%, na 20% mas mababa kaysa sa peripheral blood ng isang may sapat na gulang, ngunit ang mga phenotypic na pagkakaiba sa mga subpopulasyon ng T cell mula sa mga mapagkukunang ito ay hindi gaanong mahalaga.

Kabilang sa mga salik na direktang nakakaimpluwensya sa survival rate sa cord blood stem cell transplantation, ito ay nagkakahalaga ng pagpuna sa edad ng mga pasyente (ang pinakamahusay na mga resulta ay sinusunod sa mga tatanggap na may edad mula isa hanggang limang taon), maagang pagsusuri ng sakit at ang anyo ng leukemia (ang pagiging epektibo ay makabuluhang mas mataas sa talamak na leukemia). Ang pinakamahalaga ay ang dosis ng nucleated cord blood cells, gayundin ang kanilang HLA compatibility sa tatanggap. Hindi sinasadya na ang pagsusuri ng klinikal na pagiging epektibo ng cord blood HSC transplantation sa oncohematology ay nagpapakita ng pinakamahusay na mga resulta ng paggamot kapag gumagamit ng mga kaugnay na transplant: ang isang-taon na relapse-free survival sa kasong ito ay umabot sa 63%, habang may hindi nauugnay na paglipat - 29% lamang.

Kaya, ang pagkakaroon ng isang malaking bilang ng mga stem cell sa cord blood at ang mataas na repopulation capacity ng neonatal hematopoietic stem cells ay nagpapahintulot sa kanila na magamit para sa allogeneic transplantation sa mga oncohematological na pasyente. Gayunpaman, dapat tandaan na ang recapitulation ng hematopoiesis pagkatapos ng paglipat ng cord blood hematopoietic cells ay "nakaunat sa oras": ang pagpapanumbalik ng neutrophil na nilalaman sa peripheral na dugo ay karaniwang sinusunod sa pagtatapos ng ika-6 na linggo, at ang thrombocytopenia ay karaniwang nawawala pagkatapos ng 6 na buwan. Bilang karagdagan, ang immaturity ng cord blood hematopoietic cells ay hindi nagbubukod ng immunological conflicts: ang matinding talamak at talamak na graft-versus-host na sakit ay sinusunod sa 23 at 25% ng mga tatanggap, ayon sa pagkakabanggit. Ang mga relapses ng acute leukemia sa pagtatapos ng unang taon pagkatapos ng cord blood cell transplantation ay nabanggit sa 26% ng mga kaso.

[ 10 ], [ 11 ]